Protocol
Alle mus avlet og holdt under specifikke patogenfrie betingelser, og alle mus protokoller gennemføres i overensstemmelse med retningslinjerne i Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Fremstilling af buffere og reagenser
- Forbered komplet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (100 IU / ml) / streptomycin (100 ug / ml), 55 uM 2-mercaptoethanol ).
- Forbered 20x Balanced Salt Solution (BSS) Lager 1 og Stock to, hver for sig.
- Forbered 20x BSS lager 1 (111 mM dextrose, 8,8 mM kaliumphosphat, 26,7 mM natrium dibasisk i en L sterilt vand), og der tilsættes 40 ml 0,5% phenol Red til 20x BSS lager 1 før den endelige justering af lydstyrken. Sterilt filter under anvendelse af 0,2 um filter før opbevaring ved 4 ° C.
- Forbered 20x BSS lager 2 (25,8 mM calciumchlorid-dihydrat, 107 mM kaliumchlorid, 2,73 M natrium chloride, 19,6 mM magnesiumchlorid-hexahydrat, 16,6 mM magnesiumsulfat i 1 sterilt vand). Sterilt filter under anvendelse af 0,2 um filter før opbevaring ved 4 ° C.
- For at forberede 1x BSS for eksperimenterende brug, fortyndes 50 ml BSS lager 1 og 50 ml BSS lager 2, separat, i 400 ml sterilt vand hver. Kombiner begge fortyndede opløsninger, justeres til pH 7, og der tilsættes 20 ml FBS (2%). Top op til 1 L ved hjælp sterilt vand og sterilt filter anvendelse af 0,2 um filter.
BEMÆRK: BSS stamopløsninger skal udarbejdes separat, fordi blanding af koncentrerede BSS lagre direkte kan medføre udfældning.
- Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer
- Til fremstilling RBC lysis buffer, blandes 9 dele stock ammoniumchlorid (155 mM ammoniumchlorid i sterilt vand) til 1 del stock Tris-base (130 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan i sterilt vand, pH 7,65) før brug.
BEMÆRK: Opbevar sterile stamopløsninger af ammoniumchlorid og Tris-base ved 4 ° C. Forbered lysis Buffer frisk at sikre en effektiv lyse af røde blodlegemer.
- Til fremstilling RBC lysis buffer, blandes 9 dele stock ammoniumchlorid (155 mM ammoniumchlorid i sterilt vand) til 1 del stock Tris-base (130 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan i sterilt vand, pH 7,65) før brug.
2. generation af lymfocyt Suspension fra Spleen eller lymfeknuder
BEMÆRK: Det er vigtigt at forberede alle reagenser og udstyr, der kræves for eksperimentet før musen eutanasi og til at generere enkelt celle suspensioner af lymfocytter så hurtigt som muligt at opretholde høje celle levedygtighed.
- Euthanize eksperimentelle mus ved cervikal dislokation eller CO2-kvælning.
BEMÆRK: Fra dette trin fremefter, bør udføres aseptisk alle eksperimentelle procedurer. - Dyp hele musen ind 70% ethanol før du foretager nogen indsnit. Fjern milt og lymfeknuder aseptisk 8, og placere dem i separate 15 ml rør indeholdende 5 ml iskold RPMI / FBS (RPMI med 2% FBS) eller BSS / FBS (fra trin 1.2.3).
BEMÆRK: Da BSS forhindrer effektiv RBC lyse, bruge RPMI for udarbejdelsen af den milt celle suspension og skifte til BSS after RBC lysis. - For at generere en enkelt cellesuspension fra milt eller lymfeknuder, placere organet (r) i mellem to stykker steril 100 um cellefilter mesh i en petriskål indeholdende 2 ml iskold RPMI / FBS eller BSS / FBS. Brug af stemplet i en 1 ml sprøjte, mash organet (e), indtil den er blevet revet i meget fine dele.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør og vask cellesigte mesh med iskold RPMI / FBS eller BSS / FBS. Opsamling af resterende cellesuspension, tilføje det til samme 15-ml rør, og spin ned ved 453 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
BEMÆRK: Re-suspendere de pelleterede celler ved at stille rør med fingrene, før du tilføjer RBC lysis buffer eller medium i de efterfølgende trin. - Forbered stuetemperatur (RT) RBC lysis buffer under centrifugering af cellesuspensionen (se trin 1.3.). Efter pelletering af cellerne og fjernelse af supernatanten, resuspender cellerne med 1 ml RBC lysis buffer for hver 10 8 celler. INCUbate lysis reaktionen ved stuetemperatur i 3-4 min.
- Stop RBC lysis med 14 ml iskold BSS / FBS og spin ned på 453 xg i 5 min ved 4 ° C.
3. Oprensning af B- og T-celler
- Oprensning af B-celler
- Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Re-suspendere op til 10 8 milt celler i 300 pi BSS / FBS og tilsæt 50 pi anti-CD43 magnetiske mikrokugler 9,10. For at fjerne døde celler, tilsættes 30 ul Annexin V magnetiske perler. Inkubér cellesuspensionen i et 4 ° C køleskab i 30 min.
- Oprensning af T-celler
- Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Resuspender op til 10 8 celler i ikke-T-celle depletion antistofcocktail (biotinylerede antistoffer mod CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11, TER119 og CD4 eller CD8 afhængigt af målcellepopulation til oprenses), fortyndet 1: 200 i 200 pi BSS / FBS 4,5. Inkubér cellesuspensionen i en4 ° C køleskab i 15 min.
- Efter inkubering tilsættes 10 ml BSS / FBS for at vaske cellerne og spin ned ved 453 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og re-suspendere cellerne i 165 pi BSS / FBS med 30 pi streptavidin mikrokugler og 15 gl Annexin V magnetiske perler. Inkubér cellesuspensionen i et 4 ° C køleskab i 30 min.
BEMÆRK: For at sikre jævn mærkning med de magnetiske mikroperler, inkubere cellerne med mikroperler i 15 minutter, derefter blandes cellesuspensionen forsigtigt ved at banke på 15 ml rør og inkuberes yderligere 15 minutter under trin 3.1.1. eller 3.2.2.
- Udarbejdelse af Separation Kolonne for Cell Rensning
- Forbered en ubrugt adskillelse kolonne under mikroperle mærkning af cellerne (trin 3.1.1. Eller 3.2.2.). Pre-varm BSS (uden FBS) til RT og bruge 2 ml at vaske og ækvilibrere søjlen aseptisk. Efter ækvilibrering med BSS, bør den vaskede kolonnen ikke tillades at tørre ud.
BEMÆRK: Vi bruger LS column stedet for den anbefalede LD kolonne på grund af sin genbrugelighed (se trin 3.4.). - Efter mærkning med de magnetiske perler, tilsættes 14 ml BSS / FBS for at vaske cellerne og spin ned ved 453 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og re-suspendere cellerne i 1-3 ml RT BSS.
- Vedhæfte en steril 21 G nål til spidsen af kolonnen for at reducere strømningshastigheden under processen med oprensning. Indlæse cellesuspensionen på den ækvilibrerede søjle og samle strømmen gennem indeholdende de oprensede målceller.
BEMÆRK: Undgå at indføre bobler ind i søjlen under lastning. - Kolonnen udvaskes gang med 1 ml BSS / FBS og indsamle strømmen gennem indeholdende de oprensede målceller. Opdater kolonnen med strømmen gennem igen. Saml gennemstrømningen efter den anden belastning i samme 15 ml rør.
- Kolonnen udvaskes 3 gange med 1 ml BSS / FBS og indsamle strømmen gennem indeholdende de oprensede målceller. Derefter tilsættes 5 ml BSS / FBS til the-søjle og med et stempel, skylle de magnetisk mærkede celler ud af søjlen til et nyt 15 ml rør.
- Kontrollér renheden af cellerne opsamlet ved flowcytometri under anvendelse af antistoffer, som binder til overflade-antigener af oprenset B eller T-celler 4,5.
- Forbered en ubrugt adskillelse kolonne under mikroperle mærkning af cellerne (trin 3.1.1. Eller 3.2.2.). Pre-varm BSS (uden FBS) til RT og bruge 2 ml at vaske og ækvilibrere søjlen aseptisk. Efter ækvilibrering med BSS, bør den vaskede kolonnen ikke tillades at tørre ud.
- Re-hjælp delingssøjlen
BEMÆRK: LS kolonne kan genbruges op til 4 gange uden at påvirke rensningseffektivitet.- Kolonnen udvaskes 3 gange med 5 ml phosphatpufret saltvand (PBS) og 3 gange med 5 ml destilleret vand fra toppen ved hjælp af stemplet.
- Kolonnen udvaskes med 5 ml 70% ethanol og tør kolonnen ekstensivt under anvendelse af et luft tryk for at forhindre opbygning af rust i kolonnen.
- Til fremstilling af en brugt LS kolonnen for en særskilt rensning eksperiment, vaske søjlen fra bunden op med 5 ml 70% ethanol under anvendelse sprøjteadapteren. Dernæst vaskes søjlen fra bunden op to gange med 5 ml sterilt PBS, efterfulgt af 5 ml PBS gang fra toppen af søjlen. Tilføj 2ml RT BSS at afbalancere kolonnen og derefter gå videre til indlæsning af søjlen med mærkede celler.
4. CFSE Mærkning og Stimulation
BEMÆRK: Oprenset celler kan udsættes for en række forskellige in vitro og in vivo funktionelle assays. Her, bruger vi rensede T-celler for at bestemme T-celle-stimulering evne APC'er 5.
- Pre-varm mærkning opløsning (0,1% FBS i PBS) til 37 ° C før CFSE loading.
BEMÆRK: Ved hjælp af en lille procentdel af FBS i PBS reducerer celledød under CFSE lastning og minimerer celletab under centrifugering. Dog kan for meget FBS forstyrre CFSE belastning. - Vask oprensede celler to gange med mærkning løsning, så resuspenderes ved 2 x 10 7 celler / ml i forvarmet mærkning opløsning i en 15 ml rør.
- Forbered 10 uM CFSE opløsning (1: 500 fortynding af 5 mM CFSE stamopløsning) i forvarmet mærkningsløsning. CFSE opløsning skalvære frisklavet hver gang for at opnå optimal mærkning.
- At indlæse celler med CFSE, tilsættes 1 del cellesuspension til 1 del 10 pM CFSE opløsning i 15 ml rør og inkuberes i mørke i 10 minutter ved 37 ° C. En endelig koncentration på 5 uM CFSE anvendes til at mærke 1 x 10 7 celler / ml.
- Vend røret hver 2 min for at sikre en homogen blanding af celler under CFSE loading.
- At standse reaktionen, tilsættes flere volumener iskold komplet RPMI-medium og spin ned ved 453 x g i 5 min ved 4 ° C. Efter vellykket CFSE lastning, vil cellepelleten synes gullig.
- Wash CFSE indlæst celler en gang med iskold komplet RPMI-medium og spin ned ved 453 x g i 5 min ved 4 ° C inden brug til in vitro dyrkning eller in vivo-stimulering.
5. in vitro-stimulering
- Forbered en 2x stamopløsning af stimuli (2x stimuli stamopløsning) umiddelbart før brug, således at 100 pi 2x stimuli stamopløsning kan tilsættes til 100 pi celler til et endeligt volumen på 200 pi per brønd i en plade med 96 brønde.
- Hvis en plade med stimuli (IgM eller CD40 til B-celler eller CD3 og CD28 for T-celler) er påkrævet, fortyndes stimuli i PBS og præ-coat dyrkningspladen ved 4 ° C natten over. Alternativt kan kulturen plade overtrækkes ved 37 ° C i 1 time på dagen for forsøget. Vask den overtrukne plade to gange med PBS (Lad ikke pladen tørre ud til enhver tid).
| For B-celler | |
| stimuli | Endelig koncentration |
| F (ab ') 2 gede anti-muse-IgM | 0,6-2,4 pg / ml |
| Anti-mus CD40 mAb | 0,5-2 ug / ml |
| Rekombinantmuse-IL-4 | 25 U / ml |
| lipopolysaccharid | 0,1-10 ug / ml |
| (LPS) fra E. coli Serotype 055: B5 | |
| For T-celler | |
| stimuli | Endelig koncentration |
| Anti-CD3 (plade belagt) | 2-10 ug / ml |
| (50 pl / brønd til coating) | |
| Anti-CD28 (plade belagt) | 2 pg / ml |
| Rekombinant IL-2 | 40 U / ml |
| PDBu (phorbolester) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (Calcium ionofor) | 250 ng / ml |
Tabel 1: Koncentrationer af stimuli, der anvendes til at stimulere lymfocytter i in vitro kultur.
- For CFSE-mærkede B-celler, resuspender til 3 x 10 6 celler / ml i komplet RPMI-medium og kultur i tre eksemplarer med 3 x 10 5 celler / brønd i 96-brønds fladbundede plader i 72 timer.
- For CFSE-mærkede T-celler, re-suspend to 0,5-3 x 10 6 celler / ml i komplet RPMI-medium og kultur i tre eksemplarer med 0,5-3 x 10 5 celler / brønd i 96-brønds rundbundede plader til 48 eller 72 timer .
6. In vivo Stimulation
- Til in vivo-stimulering, adoptivt transfer 4 x 10 6 CFSE-mærkede T-celler per mus (intravenøst (iv) i 200 pi PBS) i hver MHC-matchede modtager mus.
BEMÆRK: I denne protokol, kan CFSE-mærkede T-celler kan adoptivt overføres ved hjælp hale vene eller retro-orbital injektion som disse celler vil hjem til lymfoide organer såsom milten og lymfeknuderne. - Udfordre de modtagende mus en dag senere med antigenet.
NOTE:I dette eksempel anvender vi ovalbumin (OVA-protein, 50 ug / mus) som antigenet fordi OVA-specifik, blev T-celle-receptor (TCR) -transgenic T-celler adoptivt overført til recipientmus. Forbered OVA protein i sterilt PBS og injicere 100 pi OVA protein / PBS eller PBS-kontrol, via subkutan injektion (si), i hver modtager mus 5. - Harvest og generere enkelte cellesuspensioner fra lymfoide organer (lymfeknuder og milt) af recipientmus 3 dage efter immunisering med OVA-protein eller PBS. Separate lymfeknuder i proximale lymfeknuder (PLN), som omfatter axillære, brachiale og overfladiske cervikale lymfeknuder) og distale lymfeknuder (DLN), som omfatter mesenteriale, popliteale, lyske-, lænde, og caudale lymfeknuder. Farv celler med passende FACS-antistoffer for at kontrollere for T-celleproliferation.
BEMÆRK: I denne CFSE cellesporing eksperiment, CFSE-mærkede T-celler fra PBS-injicerede kontrolmus etablere en basislinie fluorescens for ikke-dividing celler. Celledelinger af prolifererende, er antigen-stimuleret, CFSE-mærkede celler visualiseret ved at måle fluorescens toppe 12,13. Med PBS-kontrol, antallet af celledelinger af prolifererende, CFSE-mærkede T-celler kan bestemmes 12,13. - Analysere CFSE-mærkede celle proliferation data ved at sammenligne antallet af celledelinger eller spidser mellem prøverne (figur 1 og 2).
BEMÆRK: For eksempel CFSE-mærket, vil OVA-specifikke T-celler adoptivt overført til recipientmus modtager OVA-antigenet underkastes aktiv proliferation sammenlignet med PBS-injicerede kontrolmus 5,12. Desuden er det bemærkelsesværdigt at påpege, at der er mange måder at analysere CFSE celleproliferation data, som påvist af Hawkins og kolleger 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnetisk celle oprensning af lymfocytter giver brugerne mulighed for at oprense en målcellepopulation i et relativt kort tidsrum. Ved hjælp af vores udtømning protokol, var vi i stand til at øge andelen af CD8 T-celler (OT-I i rekombination-aktiverende gen-1 (RAG-1) deficiente mus) fra 72,8% (før rensning) til 94,2% (efter rensning; Figur 1A) 4,5. Disse oprensede lymfocytter kan derefter anvendes til efterfølgende funktionelle assays til bestemmelse lymfocytproliferation og signaltransduktion 4,5. For eksempel kan vi studere in vivo T-celle-stimulering kapacitet på APC'er ved at overføre CFSE-mærket, antigen-specifikke T-celler i vildtype (WT) og mutant (MT) mus immuniseret med passende antigen 5.
I vores repræsentativt forsøg, vi overført oprenset, CFSE-mærket, ovalbumin (OVA) specifik OT-I CD8 T calen til kontrol (WT) og mutant (MT) mus og immuniseret disse mus en dag senere med OVA-protein. Tre dage efter immunisering, vi høstede lymfeknuder (proximale og distale) og milte og analyseret T-cellerne ved flowcytometri. CD45 allele former kan anvendes til bedre at adskille delende, CFSE-mærket, donor OT-I CD8-celler fra ikke-mærkede, modtagende CD8 T-celler. I dette eksempel donor- og recipientceller er fra CD45,1 og CD45,2-mus, henholdsvis (figur 1b). De CFSE niveauer af overlevende, ustimulerede OT-I-T-celler på dette tidspunkt, anvendes til at definere den maksimale for ikke-prolifererende celler (figur 1C, punkteret linie). Ved stimulation, vil intensiteten af de CFSE niveauer i OT-I T-celler halvere med hver afdeling. T-celleproliferation kan derved bestemmes ved at tælle antallet af CFSE peaks 6,12. I vores repræsentative resultater, kan vi ikke se forskel på tværs af præsentation kapacitet WT og MT APC'erne (Figur 1C, fuldt optrukne linier), da T-cellerne prolifererer i samme omfang i begge mus.
I et separat eksperiment, udførte vi en [3H] -thymidin inkorporering assay for at undersøge celleproliferation af aktiveret kontrol og MT T-celler. Oprenset WT og MT T-celler blev stimuleret med forskellige stimuli i 48 timer og pulseres med [3H] -thymidin i de sidste 8 timer. Prolifererende celler i S-fasen af cellecyklussen vil inkorporere den radiomærkede nukleotid, [3H] -thymidin, i nysyntetiseret deoxyribonukleinsyre (DNA), derfor, ved hjælp af væskescintillationstælling, celleproliferation kan måles ved [3H] thymidin optagelse. Antallet af tællinger per minut (cpm) korrelerer direkte med mængden af [3H] -thymidin-optagelse i prolifererende T-celler. I vores repræsentative resultater, det reducerede antal cpm opnået fra MT T-celler ved stimulation i forhold til counts fra WT T-celler indikerer en kompromitteret proliferativ kapacitet MT T-celler (figur 1D).
For at bestemme B-celle proliferativ kapacitet, vi oprenset milt B celler under anvendelse af beskrevne depletion strategi. Efter rensning, vi var i stand til at øge andelen af B220 B-celler (WT mus) fra 63,9% (før rensning) til 98,4% (efter rensning, figur 2A) 4. Svarende til renset T-celler, kan oprensede milt-B-celler også anvendes til nedstrøms funktionelle assays for at vurdere lymfocytproliferation og signaltransduktion 4. Efterfølgende vi mærkede oprensede WT milt B celler med CFSE og stimuleret disse celler in vitro under anvendelse af plader coatet med anti-CD40 suppleret med cytokinet IL-4. Tre dage efter stimulering, analyserede vi levedygtige, aktiverede B-celler ved flowcytometri. De CFSE niveauer af overlevende, der stimulerede B-celler på dette tidspunkt bruges tildefinere toppen for ikke-prolifererende celler (figur 2B, punkteret linie). Svarende til T-celler, vil intensiteten af de CFSE niveauer i B-celler halvere med hver afdeling 6,12.
Figur 1: CFSE profiler af adoptivt overført oprenset OT-I T-celler efter immunisering (A) CD4 og CD8-farvning af celler isoleret fra OT-I;. RAG-1-deficiente mus før (øverste panel) og efter (nederste panel) ikke-T-celle depletion. (B) Repræsentative FACS plots af T-celler fra milt (Sp), proximale lymfeknuder (PLN) og distale lymfeknuder (DLN). Donor OT-I CD8 T-celler CD45,1 positive. (C) repræsentant CFSE profiler af overførte, CFSE-mærket OT-I donor-T-celler fra milt (SP), proximale lymfeknuder (PLN) og distale lymfeknuder (DLN) af WT (skraveret kurver) ogMT (fuldt optrukne linier) recipientmus 3 dage efter immunisering med OVA-protein og LPS. Stiplet linje angiver OT-I T-celler fra WT recipientmus uden immunisering (PBS injiceret). (D) Celleproliferation af aktiveret kontrol eller MT T-celler som målt ved [3H] -thymidin-optagelse assay. Resultaterne er præsenteret i tællinger per minut (cpm). Oprenset kontrol (åben søjle) eller MT (lukket bar) T-celler blev inkuberet i 48 timer i kun medium (medium) eller i nærværelse af pladebundet anti-CD3 eller anti-CD3 plus anti-CD28 med eller uden rekombinant IL 2. Polyklonale celle aktivering blev udløst af PMA (phorbolester) og A23 (calcium ionofor). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: CFSE profilB-celler upon in vitro-stimulering. (A) B220 og CD3-farvning af miltceller isoleret fra WT mus før (øverste panel) og efter (nederste panel) ikke-B-celle depletion. (B) repræsentant CFSE profil CFSE-mærket WT (skraveret kurve) milt B-celler efter 3 dages in vitro-stimulering med plader overtrukket med anti-CD40 og IL4. Stiplet linje angiver CFSE-mærkede WT B-celler uden stimulation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, viser vi en procedure til rensning af lymfocytter fra lymfoide organer. Celle oprensning under anvendelse af magnetiske perler sortering er en hurtig og enkel metode, der giver levedygtige, stærkt oprensede målceller.
Kritiske trin i protokollen
Cellelevedygtighed og celleudbytte
Opretholdelse levedygtighed hæmatopoietisk linje celler in vitro er afgørende for at sikre en vellykket og reproducerbare eksperimenter. Kemiske og biologiske reagenser, kan sub-optimale eksperimentelle betingelser eller forkert betingelser for udskårne organer storage alle påvirke cellernes levedygtighed. Efter udskæring fra mus, skal lagres på is og enkeltcellesuspensioner fremstillet som hurtigst muligt lymfoide organer. bør også undgås højhastighedscentrifugering af cellesuspensioner. Endvidere bør cellepellets løsnes ved at tænde rør med fingrene efter fjernelse af supernatant. Det er ikkeanbefales at re-suspendere pellets direkte med store mængder af medium ved pipettering.
Ca. 2-4 x 10 7 milt B-celler og 2 x 10 7 T-celler fra alle større lymfeknuder kan isoleres fra en 8-10 uger gamle WT mus. Reduceret antal oprenset B- og T-celler (under den forventede værdi) indikerer suboptimale betingelser, som nævnt tidligere.
Cell renhed
Den gennemsnitlige renhed af isolerede celler ved anvendelse af denne protokol er inden for området fra 90 til 95%, hvilket er tilstrækkeligt rent til efterfølgende in vitro eller in vivo forsøg (figur 1A). Det er tilrådeligt ikke at overbelaste separationskolonnen med for mange celler under processen med adskillelse da dette kan kompromittere celle renhed grundet kolonnens begrænsede bindingskapacitet.
Kvaliteten af FBS
Detkvaliteten af FBS anvendes til at supplere dyrkningsmediet er kritisk for in vitro overlevelse af lymfocytter. FBS fra forskellige kilder og partier kan variere i deres evne til at understøtte in vitro lymfocyt svar. Derfor er det vigtigt at teste forskellige typer af FBS for at finde en, der giver høj-specifik respons med lav baggrund. Et stort antal flasker bør derefter reserveret som en bestand.
Ændringer og fejlfinding
CFSE mærkningsbetingelser
Selvom CFSE mærkning arbejder i almindelig RPMI, har vi fundet, at bruge en lav procentdel af FBS i PBS reducerer celledød under lastningen, uden at gå på kompromis med effektiviteten af mærkning. Desuden er tilstedeværelsen af FBS minimerer celletab under centrifugering.
Et vigtigt aspekt af CFSE mærkning er at sikre jævn mærkning af cellerne med henblik på at visualisere distinkt tops, der repræsenterer celledeling. Overbelastning af CFSE kan resultere i øget celledød in vitro eller dårlig genvinding af mærkede celler in vivo. På den anden side kan utilstrækkelig CFSE mærkning eller heterogenitet i målcellen suspensionen under processen med mærkning resultere i dårligt løst CFSE peaks 12. Derfor er det vigtigt at optimere betingelserne CFSE mærkning. Mængden af CFSE anvendes til mærkning bør holdes så lavt som muligt for at mindske potentielle toksiske effekter fra overbelastning, men stadig opnå tilstrækkelig mærkning til at opdage pænt løst toppe ved stimulering inden for den eksperimentelle tidsramme. Desuden at undgå dårligt opløste toppe, bør celleklumper fjernes fra enkeltcelle-suspensioner før CFSE loading.
Celleklumper og celletab
Det er afgørende at sikre, at batterierne er fuldt resuspenderes før man går videre til næste trin, fordi evig flytbarel celleklumper under eksperimentet drastisk reducerer celletal. Celleklumper er normalt forbundet med nedsat cellelevedygtighed eller utilstrækkelig resuspension af cellepelleten.
CFSE og emissionsspektre overlap
CFSE-mærkede celler kan yderligere defineres med fluoroforen-konjugerede antistoffer efter en dag i kultur, men disse CFSE-mærkede celler stadig lyst fluorescerende efter en dag i kultur. Brug kombinationer af antistoffer konjugeret til lyse fluoroforer med minimale mængder af emission spektre overlapper med CFSE, såsom phycoerythrin (PE) og phycoerythrin-cyanin 7 (PeCy7), giver optimale farvningsresultater. Men til erstatning reducere emissionsspektre overlap stadig er nødvendig. Derudover følge af den høje intensitet CFSE signal (FL-1 kanal), at udslip i FL-2-kanal, FL-2-kanal har at blive kompenseret ved at fratrække den høje procentdel af FL-2 værdi for at opnå en optimal CFSE profil. Man kan henvise til papiret publiceret af Quah et al., Der leverer løsninger til fejlfinding CFSE mærkning og analyse af resultater 12.
Alternativer til CFSE
Emissionsspektret for CFSE begrænser anvendelsen af kombinationer af CFSE med fluorescein-derivater, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugerede antistoffer. Der er imidlertid andre kommercielt tilgængelige celle farvestoffer med lige så høj fluorescens intensitet og lav celletoksicitet i violet (CTV, excitation / emission: 405/450 nm), gul (CTY, 555/580 nm), langt rødt (CTFR, 630 / 661 nm eller CPD670, 647/670 nm) og rød (PKH26, 551/567 nm). Brug af mærkning celle farvestoffer med forskellige emissionsspektre giver fleksibilitet i eksperimentelle design. På den anden side kan ikke alle de ovenfor beskrevne mærkning celle farvestoffer generere distinkte celledeling toppe. En sammenlignende undersøgelse udført ved anvendelse afforskellige mærkningsordninger celle farvestoffer konkluderede, at CTV er en bedre erstatning for CFSE fordi CTV muliggør påvisning af et større antal klart definerede celledeling toppe 13.
Begrænsninger
Den største begrænsning af magnetisk cellesortering er, at det kun er egnet til enkel cellesortering. I vores eksempel, kunne vi bruge CD43 at nedbryder alle ikke-B-celler fra milt; dog ville vi ikke være i stand til at adskille follikulært B-celler fra marginal zone B-celler. Disse delpopulationer kan kun defineres med flere overflademarkører. Mens det er muligt at positivt markere celler anvender magnetisk celle sortering baseret på flere overflademarkører, den er afhængig af specielt forberedte, kommercielt tilgængelige reagenser, der muliggør frigivelsen af mikroperler fra målceller efter den første runde af sortering før man går videre til den anden markør. Således ville brugeren være fuldstændig afhængige af de kommercielt tilgængelige kits. I et sådant tilfælde, FACS is meget mere fordelagtige til adskillelse raffinerede cellepopulationer.
Betydningen af Teknik
Antistofbaserede cellesortering tilgange, såsom magnetisk cellesortering og FACS, er den mest pålidelige cellesortering teknikker til dato 15. Andre metoder til celleseparation eksisterer, herunder massefylde-baserede og compliance-baserede teknikker imidlertid lymfocytter er dårligt vedhæftende celler og deres subpopulationer er forholdsvis ens i tæthed, således adherence- og densitet teknikker er enten ikke anvendelige eller er meget ineffektiv 15 .
Som nævnt i indledningen, hurtig, enkel, høj cellelevedygtighed, og uafhængigt af et avanceret udstyr er de vindende træk ved magnetisk cellesortering løbet FACS. Navnlig negativ depletering ved anvendelse af magnetisk cellesortering etiketter og udtømmer uønskede celler under anvendelse af en magnetisk separation kolonne, mens isolering af målceller med minimal modifications til celleoverfladen og vedligeholdelse af naive tilstand.
Fremtidige applikationer
De stærkt berigede, levedygtige, og naive lymfocytter oprenset ved hjælp af denne magnetisk-baseret oprensning teknik kan underkastes forskellige funktionelle assays af lymfocyt adfærd og signaleringsmekanismer in vitro og in vivo. I denne protokol, demonstrerede vi anvendelse af to forskellige celleproliferationsassays - [3H] -thymidin inkorporering assay og CFSE celleproliferationsassay - at undersøge celleproliferative kapacitet aktiverede lymfocytter.
Valget mellem [3 H] -thymidininkorporering assay og CFSE celleproliferationsassay afhænger i høj grad prøvestørrelse og eksperimentelle betingelser. Udnytte den [3 H] -thymidininkorporering assay i eksperimenter med store stikprøvestørrelser genererer high-throughput celleproliferation data. For at sikre optimal [<sup> 3 H] -thymidin-optagelse og reproducerbarhed af resultater, [3H] -thymidin bør tilsættes til kulturen, når et flertal af cellerne deler sig aktivt. Optimering af protokollen mærkning er påkrævet for forskellige celletyper og stimuli. På grund af det radioaktive natur af [3H] -thymidin, kan denne inkorporering assay kun udføres in vitro, i modsætning CFSE mærkning af celler, der kan aktiveres in vitro (figur 2B) eller adoptivt overført til recipientmus (figur 1B og 1C).
Den CFSE celleproliferationsassay, på den anden side, giver mere information om celledeling end [3 H] -thymidininkorporering. Da intensiteten af CFSE i CFSE-mærkede celler halveres med hver celledeling, kan man bestemme antallet af celledelinger og andelen af celler i hver division ved at tælle antallet og størrelsen af toppene
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Undersøgelsen er støttet af Undervisningsministeriet, Singapore (AcRF Tier1-RG40 / 13 og Tier2-MOE2013-T2-2-038). Manuskriptet blev redigeret af Amy Sullivan fra Obrizus Communications.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
