Protocol
Alle mus er avlet og holdt under spesifikke patogen-frie forhold og alle muse protokoller er gjennomført i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Utarbeidelse av buffere og reagenser
- Fremstille komp Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (100 IU / ml) / streptomycin (100 ug / ml), 55 uM 2-merkaptoetanol ).
- Forbered 20x Balanced Salt Solution (BSS) lager en og lager to, hver for seg.
- Forbered 20x BSS lager en (111 mM dekstrose, 8,8 mM kaliumfosfat, 26,7 mM dinatriumhydrogenfosfat i en L sterilt vann) og tilsett 40 ml 0,5% fenolrødt 20x BSS lager en før endelig volumregulering. Steril filter bruker 0,2 mikrometer filter før lagring ved 4 ° C.
- Forbered 20x BSS lager 2 (25,8 mM kalsiumklorid dihydrat, 107 mM kaliumklorid, 2,73 M natrium chloride, 19,6 mM magnesiumklorid-heksahydrat, 16,6 mM magnesiumsulfat i en L sterilt vann). Steril filter bruker 0,2 mikrometer filter før lagring ved 4 ° C.
- For å forberede 1x BSS for eksperimentell bruk, fortynnes 50 ml BSS lager 1 og 50 ml BSS lager to, hver for seg, i 400 ml sterilt vann hver. Kombinere begge fortynnede løsninger, juster til pH 7, og legge til 20 ml FBS (2%). Topp opp til en L bruker sterilt vann og sterilt filter ved hjelp av 0,2 mikrometer filter.
MERK: BSS lagerløsninger bør være forberedt separat fordi blandingen av konsentrerte BSS aksjer direkte kan føre til nedbør.
- Røde blodceller (RBC) Lysis Buffer
- For å fremstille RBC lyseringsbuffer, blande 9 deler lager ammoniumklorid (155 mM ammoniumklorid i sterilt vann) til en del lager Tris-base (130 mM Tris (hydroksymetyl) aminometan i sterilt vann, pH 7,65) før bruk.
MERK: Lagre sterile lager oppløsninger av ammoniumklorid og Tris-base-ved 4 ° C. Forbered lysis bUffer frisk for å sikre effektiv lyse av RBC.
- For å fremstille RBC lyseringsbuffer, blande 9 deler lager ammoniumklorid (155 mM ammoniumklorid i sterilt vann) til en del lager Tris-base (130 mM Tris (hydroksymetyl) aminometan i sterilt vann, pH 7,65) før bruk.
2. Generering av lymfocyttsuspensjonen fra milt eller lymfeknuter
MERK: Det er viktig å forberede alle reagenser og utstyr som kreves for forsøket før musen eutanasi og å generere enkeltcellesuspensjoner av lymfocytter så snart som mulig for å opprettholde høye celle viabilities.
- Avlive eksperimentell mus ved halshugging eller CO 2 kvelning.
MERK: Fra dette trinnet og utover, bør alle eksperimentelle prosedyrer skal utføres aseptisk. - Dypp hele musen til 70% etanol før du gjør noen snitt. Fjern milt og lymfeknuter aseptisk 8, og plassere dem i egne 15 ml rør som inneholder 5 ml iskald RPMI / FBS (RPMI med 2% FBS) eller BSS / FBS (fra trinn 1.2.3).
MERK: Siden BSS hindrer effektiv RBC lysis, bruker RPMI for utarbeidelse av miltcellesuspensjonen og bytte til BSS after RBC lysis. - For å generere en enkeltcelle-suspensjon fra milt eller lymfeknuter, plasser organ (er) mellom to stykker av steril 100 mikrometer celle sil mesh i en petriskål inneholdende 2 ml iskald RPMI / FBS eller BSS / FBS. Ved hjelp av stempelet i en 1 ml sprøyte, mos organet (e) inntil den er blitt revet i meget fine deler.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør og vaske celle sil mesh med iskald RPMI / FBS eller BSS / FBS. Samle de resterende cellesuspensjonen, legge den til den samme 15-ml tube og spinne ned ved 453 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
MERK: Re-suspendere pelle cellene ved å dra fingeren røret med fingrene før du legger RBC lysis buffer eller medium i de påfølgende trinn. - Forbered romtemperatur (RT) RBC lyseringsbuffer under sentrifugering av cellesuspensjonen (se trinn 1.3.). Etter pelletering av cellene og fjerning av supernatanten, re-suspendere cellene med 1 ml RBC lyseringsbuffer for hver 10 8 celler. Incubate lyseringsreaksjonsblandingen ved RT i 3-4 min.
- Stopp RBC lysis med 14 ml iskald BSS / FBS og spinn ned på 453 xg i 5 min ved 4 ° C.
3. Rensing av B og T celler
- Rensing av B-cellene
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Re-suspendere opptil 10 8 miltceller i 300 mL BSS / FBS og tilsett 50 ul anti-CD43 magnetiske mikro 9,10. For å fjerne døde celler, tilsett 30 mL Annexin V magnetiske kuler. Inkuber cellesuspensjonen i et 4 ° C kjøleskap i 30 minutter.
- Rensing av T-celler
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Re-suspendere opptil 10 8 celler i ikke-T-celle uttømming antistoff cocktail (biotinylerte antistoffer mot CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 og CD4 eller CD8 avhengig målcellen befolkningen skal renses), fortynnet 1: 200 i 200 ul BSS / FBS 4,5. Inkuber cellesuspensjonen i en4 ° C kjøleskap i 15 min.
- Etter inkubasjon tilsett 10 ml BSS / FBS å vaske cellene og spinn ned på 453 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og re-suspendere cellene i 165 mL BSS / FBS med 30 mL streptavidin mikroperler og 15 mL Annexin V magnetiske kuler. Inkuber cellesuspensjonen i et 4 ° C kjøleskap i 30 minutter.
NB: For å sikre jevn merking med de magnetiske mikroperler, inkuberes cellene med mikroperler i 15 minutter, deretter blande cellesuspensjonen forsiktig ved å banke på 15 ml rør og inkuberes i 15 min under trinn 3.1.1. eller 3.2.2.
- Utarbeidelse av Separasjon kolonne for Cell Rensing
- Forbered en ubrukt separasjonskolonne under mikro merking av celler (trinn 3.1.1. Eller 3.2.2.). Pre-varm BSS (uten FBS) til RT og bruke 2 ml for å vaske og ekvilibrere kolonnen aseptisk. Etter likevekt med BSS, bør vaskes kolonnen ikke få lov til å tørke ut.
MERK: Vi bruker LS column stedet for den anbefalte LD kolonnen på grunn av sin re-anvendelighet (se trinn 3.4.). - Etter merking med magnetiske kuler, tilsett 14 ml BSS / FBS for å vaske cellene og spinne ned ved 453 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og re-suspendere cellene i 1-3 ml RT BSS.
- Fest en steril 21 G nål til tuppen av kolonnen for å redusere strømningshastigheten under prosessen med rensing. Installering av cellesuspensjonen på den ekvilibrerte søyle, og samle strømningen gjennom inneholdende de rensede målcellene.
MERK: Unngå å innføre bobler i kolonnen under lasting. - Vask kolonnen en gang med 1 ml BSS / FBS og samle strømningen gjennom inneholdende de rensede målcellene. Last kolonnen med strømningen gjennom en gang til. Samle strømmen gjennom etter den andre lasting i det samme 15 ml tube.
- Vask kolonnen 3 ganger med 1 ml BSS / FBS og samle strømningen gjennom inneholdende de rensede målcellene. Deretter tilsett 5 ml BSS / FBS til the søyle og med en plunger, spyle de magnetisk merkede celler ut av kolonnen inn i en ny 15 ml tube.
- Sjekke renheten av cellene innsamlet ved flowcytometri ved anvendelse av antistoffer som binder seg til overflateantigener av renset B eller T-celler 4,5.
- Forbered en ubrukt separasjonskolonne under mikro merking av celler (trinn 3.1.1. Eller 3.2.2.). Pre-varm BSS (uten FBS) til RT og bruke 2 ml for å vaske og ekvilibrere kolonnen aseptisk. Etter likevekt med BSS, bør vaskes kolonnen ikke få lov til å tørke ut.
- Re-bruker Separasjon kolonne
MERK: LS kolonnen kan brukes om igjen opptil 4 ganger uten at det påvirker renseeffekt.- Vask kolonnen 3 ganger med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og 3 ganger med 5 ml destillert vann fra toppen ved hjelp av stempelet.
- Vask kolonnen med 5 ml 70% etanol og tørkes i kolonnen i stor utstrekning ved hjelp av en luft-trykk for å forhindre opphoping av rust i kolonnen.
- For å fremstille en brukt LS kolonne for separat rensing eksperiment, vaske kolonnen fra bunnen opp med 5 ml 70% etanol under anvendelse av sprøyteadapteren. Deretter vaskes kolonnen fra bunnen opp to ganger med 5 ml sterilt PBS, etterfulgt av 5 ml PBS en gang fra toppen av kolonnen. Tilsett 2ml RT BSS til stabilisering kolonnen og deretter gå videre til lasting kolonnen med merkede celler.
4. CFSE Merking og stimulering
MERK: Renset cellene kan utsettes for en rekke in vitro og in vivo funksjonelle analyser. Her bruker vi rensede T-celler for å bestemme T-celle stimulering evnen til APCer 5.
- Pre-merking varm oppløsning (0,1% FBS i PBS) til 37 ° C før CFSE lasting.
MERK: Ved hjelp av en lav prosentandel av FBS i PBS reduserer celledød under CFSE lasting og minimerer celle tap under sentrifugering. Imidlertid kan for mye FBS forstyrre CFSE lasting. - Vask celler renset to ganger med merking oppløsning, deretter re-suspendert i 2 x 10 7 celler / ml i forvarmet merking oppløsning i et 15 ml rør.
- Forbered 10 mm CFSE oppløsning (1: 500 fortynning av 5 mM CFSE stamløsning) i forvarmet merking løsning. CFSE løsning børvære nylaget hver gang for å oppnå optimal merking.
- For å laste celler med CFSE, legge til en del cellesuspensjon til en del 10 uM CFSE løsning i et 15 ml rør og inkuberes i mørke i 10 min ved 37 ° C. En endelig konsentrasjon på 5 pM CFSE blir brukt for å merke 1 x 10 7 celler / ml.
- Snu røret hvert 2 min for å sikre en homogen blanding av celler under CFSE lasting.
- For å stoppe reaksjonen, legge til flere volumer av iskald komplett RPMI medium og spinne ned ved 453 xg i 5 min ved 4 ° C. Etter vellykket CFSE lasting, vil cellen pellet vises gulaktig.
- Vask CFSE lastet cellene en gang med iskald komplett RPMI-medium og spinne ned ved 453 xg i 5 minutter ved 4 ° C før bruk for in vitro dyrking eller in vivo stimulering.
5. In Vitro Stimulering
- Forbered en 2x stamløsning av stimuli (2x stimuli stamløsning) umiddelbart før bruk, slik at 100 ul av 2x stimuli stamoppløsningen kan tilsettes til 100 ul av celler til et sluttvolum på 200 ul per brønn i en 96-brønns plate.
- Hvis en plate belagt med stimuli (IgM eller CD40 på B-celler eller CD3 og CD28 på T-celler) er nødvendig, fortynnes stimuli i PBS og pre-coat dyrkningsplaten ved 4 ° C over natten. Alternativt kan dyrkningsplaten belegges ved 37 ° C i 1 time på dagen for eksperimentet. Vask den belagte platen to ganger med PBS (Ikke la platen tørke ut når som helst).
| For B-celler | |
| stimuli | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP |
| F (ab ') 2 geit anti-mus IgM | 0,6 til 2,4 pg / ml |
| Anti-mus CD40 mAb | 0,5-2 ug / ml |
| rekombinantmuse-IL-4- | 25 U / ml |
| lipopolysakkarid | 0,1 til 10 pg / ml |
| (LPS) fra E. coli Serotype 055: B5 | |
| For T-celler | |
| stimuli | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP |
| Anti-CD3 (plate belagt) | 2-10 pg / ml |
| (50 ul / brønn for-belegg) | |
| Anti-CD28 (plate belagt) | 2 ug / ml |
| Rekombinant IL-2- | 40 U / ml |
| PDBu (Phorbol ester) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (Calcium ionofor) | 250 ng / ml |
Tabell 1: Konsentrasjon av stimuli som brukes til å stimulere lymfocytter i in vitro kultur.
- For CFSE-merkede B-celler, re-suspendere til 3 x 10 6 celler / ml i fullstendig RPMI-medium og kulturen i tre eksemplarer med 3 x 10 5 celler / brønn i 96-brønners flatbunnede plater i 72 timer.
- For CFSE-merkede T-celler, re-suspendere til 0,5-3 x 10 6 celler / ml i fullstendig RPMI-medium og kulturen i tre eksemplarer med 0,5-3 x 10 5 celler / brønn i 96-brønners rundbunnede plater for 48 eller 72 timers .
6. I Vivo Stimulering
- For in vivo stimulering, adoptiv overføring 4 x 10 6 CFSE-merkede T-celler per mus (intravenøst (iv) i 200 ul PBS) inn i hvert MHC-matchet mottaker mus.
MERK: I denne protokollen, kan CFSE-merkede T-celler bli adoptiv overført ved hjelp av halevenen eller retro-orbital injeksjon som disse cellene vil hjem til lymfoide organer som milt og lymfeknuter. - Utfordre mottaker musene en dag senere med antigenet.
NOTAT:I dette eksempelet bruker vi ovalbumin (OVA protein, 50 ug / mus) som antigenet fordi OVA-spesifikk, ble T-cellereseptoren (TCR) -transgenic T-celler adoptivt overført til resipientmus. Forbered OVA protein i sterile PBS og injisere 100 mL av OVA protein / PBS eller PBS kontroll, via subkutan injeksjon (si), til hver mottaker mus fem. - Harvest og generere enkeltcellesuspensjoner fra lymfoide organer (lymfeknuter og milt) på mottakerens mus 3 dager etter immunisering med OVA protein eller PBS. Separate lymfeknuter i proksimale lymfeknuter (PLN), som omfatter axillaris, brachialis og overfladiske cervical lymfeknuter) og distal lymfeknuter (DLN), som omfatter mesenteric, popliteal, lyske, lumbar, og caudal lymfeknuter. Flekke celler ved hjelp av de aktuelle FACS antistoffer for å se etter T-celledeling.
MERK: I denne CFSE celle sporing eksperiment, CFSE-merkede T-celler fra PBS-injiserte kontroll mus etablere en baseline fluorescens for ikke-dibringelse av celler. Celledelinger av prolifererende er antigen-stimulert, CFSE-merkede celler visualisert ved å måle fluorescenstoppene 12,13. Med PBS-kontroll, antall celledelinger av prolifererende, CFSE-merkede T-celler kan bestemmes 12,13. - Analyser CFSE-merket celle spredning av data ved å sammenligne antallet av celledelinger eller topper mellom prøvene (figur 1 og 2).
MERK: For eksempel CFSE-merket, vil OVA-spesifikke T-celler adoptiv overført til mottaker mus som fikk OVA antigen gjennomgå aktiv spredning i forhold til PBS-injiserte kontroll mus 5,12. Videre er det verdt å merke seg å påpeke at det er mange måter å analysere CFSE celle spredning av data, som demonstrert av Hawkins og kolleger 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnetisk celle rensing av lymfocytter gjør det mulig å rense en målcellepopulasjon i en relativt kort tidsperiode. Ved hjelp av vår uttømming protokollen, var vi i stand til å øke andelen av CD8 T-celler (OT-I i rekombinasjon aktiverende gen-en (RAG-1) -deficient mus) fra 72,8% (før rensing) til 94,2% (etter rensing; figur 1A) 4,5. Disse rensede lymfocytter kan deretter brukes til nedstrøms funksjonelle analyser for å bestemme lymfocyttproliferasjon og signaltransduksjon 4,5. For eksempel, kan man studere in vivo T-celle stimulering kapasitet av APCer ved å overføre CFSE-merkede, antigen-spesifikke T-celler inn i villtype (WT) og mutant (MT) mus immunisert med passende antigen 5.
I vår representant eksperiment, overføres vi renset, CFSE-merket, ovalbumin (OVA) bestemt OT-I CD8 T calen til kontroll (WT) og mutant (MT) og mus immunisert disse musene en dag senere med OVA protein. Tre dager etter immunisering, høstet vi lymfeknuter (proksimale og distale) og milten og analysert T-celler ved flow cytometri. CD45 alleliske former kan anvendes for å bedre skille dele, CFSE-merket, donor OT-I CD8-celler fra ikke-merkede, mottaker CD8 T-celler. I dette eksempel giver- og mottakercellene er fra CD45.1 og CD45.2 mus, henholdsvis (figur 1B). De CFSE nivåene av overlevende, ustimulerte OT-I-T-celler på dette tidspunkt blir brukt til å definere topp for ikke-prolifererende celler (figur 1C, stiplet linje). Ved stimulering, vil intensiteten av CFSE nivåer i OT-I-T-celler reduseres til det halve med hver avdeling. T-celleproliferasjon kan derved bli bestemt ved å telle antallet CFSE topper 6,12. I våre representative resultater, kan vi ikke se forskjeller i tverrpresentasjons kapasiteter på WT og MT APC (Figur 1C, heltrukne linjer), siden T-cellene sprer på lignende priser i både mus.
I et separat eksperiment, utførte vi en [3H] -tymidin inkorporering assay for å studere celleproliferasjon av aktivert kontroll og MT T-celler. Renset WT og MT T-celler ble stimulert med ulike stimuli i 48 timer og pulsert med [3H] -tymidin for den endelige 8 timer. Prolifererende celler i S-fasen av cellesyklusen vil inkorporere radiomerkede nukleotid, [3H] -tymidin, inn i nylig syntetisert deoksyribonukleinsyre (DNA), og derfor, ved hjelp av væskescintillasjonstelling, celleproliferasjon kan bli målt ved [3H] -tymidin opptak. Antall tellinger pr minutt (cpm) korrelerer direkte med mengden av [3H] -tymidin-opptak i prolifererende T-celler. I våre representative resultater, det reduserte antall cpm erholdt fra MT T-celler ved stimulering sammenlignet med cMotorfestene fra WT T-celler indikerer en kompromittert proliferativ kapasitet på MT T-celler (figur 1D).
For å bestemme B-celle proliferativ kapasitet, renset vi milt-B-celler ved anvendelse av den beskrevne uttømming strategi. Ved rensing, vi var i stand til å øke andelen av B220 B-celler (WT mus) fra 63,9% (før rensing) til 98,4% (etter rensing, figur 2A) 4. I likhet med rensede T-celler, kan rensede milt-B-celler også anvendes for nedstrøms funksjonelle analyser for å vurdere lymfocyttproliferasjon og signaltransduksjon 4. Deretter merket vi rensede WT milt-B-celler med CFSE og stimulert disse cellene in vitro ved anvendelse av plater belagt med anti-CD40 supplert med cytokinet IL-4. Tre dager etter stimulering, analyserte vi levedyktige, aktiverte B-celler ved flow cytometri. De CFSE nivåer av overlevende, blir stimulerte B-celler på dette tidspunkt brukes til ådefinerer topp for ikke-prolifererende celler (figur 2B, stiplet linje). I likhet med T-celler, vil intensiteten av CFSE nivåene i B-celler reduseres til det halve med hver avdeling 6,12.
Figur 1: CFSE profiler av adoptivt overført renset OT-I-T-celler etter immunisering (A), CD4 og CD8 farging av celler isolert fra OT-I;. RAG-1-manglende mus før (øvre panel) og etter (nedre panel) ikke-T-celle-uttømming. (B) Representative FACS plott av T-celler fra milt (Sp), proksimale lymfeknuter (PLN) og distale lymfeknuter (DLN). Donor OT-I CD8 T-celler er CD45.1 positiv. (C) Representant CFSE profiler av overførte, CFSE-merket OT-I donor T-celler fra milt (Sp), proksimale lymfeknuter (PLN) og distale lymfeknuter (DLN) av WT (skyggelagt kurver) ogMT (heltrukne linjer) mottaker mus 3 dager etter vaksinasjon med OVA protein og LPS. Prikket linje angir OT-I T-celler fra WT mottaker mus uten immunisering (PBS injisert). (D) celle proliferasjon av aktiverte kontroll eller MT T-celler som målt ved [3H] -tymidin opptaksanalyse. Resultatene er presentert i tellinger per minutt (cpm). Renset kontroll (åpne bar) eller MT (lukket bar) T-celler ble inkubert i 48 timer i bare medium (medium), eller i nærvær av plate-bundet anti-CD3 eller anti-CD3 pluss anti-CD28, med eller uten rekombinant IL- 2. Polyklonale celle aktivering ble utløst av PMA (forbolester) og A23 (kalsiumionofor). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: CFSE profilenB-celler ved in vitro stimulering. (A) B220 og CD3 farging av milt-celler isolert fra WT mus før (øvre panel) og etter (nedre panel) non-B-celleutarming. (B) Representant CFSE profilen til CFSE-merket WT (skravert kurve) milt-B-celler etter 3 dager av in vitro stimulering med plater belagt med anti-CD40 og IL4. Prikket linje angir CFSE-merkede WT B-celler uten stimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, viser vi en fremgangsmåte for rensing av lymfocytter fra lymfoide organer. Cell rensing ved hjelp av magnetiske kuler sortering er en rask og enkel metode som gir levedyktige, svært renset målceller.
Kritiske trinn i protokollen
Celleviabilitet og celleutbytte
Opprettholde levedyktighet av blodkreft avstamning celler in vitro er kritisk for å sikre vellykkede og reproduserbare eksperimenter. Biologiske og kjemiske reagenser, kan sub-optimale forsøksbetingelser eller feil oppbevaring av utskårne organer alle påvirke celle levedyktighet. Ved fjerning fra mus, lymfoide organer må være lagret på is, og enkeltcellesuspensjoner fremstilt så snart som mulig. High-speed sentrifugering av cellesuspensjoner bør også unngås. Videre bør celle pellets løsnes ved å bla rør med fingrene etter fjerning av supernatant. Det er ikkeanbefales å re-suspendere pellets direkte med store mengder medium ved pipettering.
Omtrent 2-4 x 10 7 milt-B-celler og 2 x 10 7 T-celler fra alle de store lymfeknuter kan bli isolert fra en 8-10 uker gamle mus WT. Redusert antall renset B- og T-celler (under den forventede verdi) viser sub-optimale betingelser, som nevnt tidligere.
Cell renhet
Den gjennomsnittlige renhet av isolerte celler ved anvendelse av denne protokollen er i området fra 90 til 95%, som er tilstrekkelig rent for etterfølgende in vitro eller in vivo forsøk (figur 1A). Det anbefales ikke å overbelaste separasjonskolonnen med store antall celler i løpet av prosessen separasjon fordi det kan kompromittere celle renhet på grunn av kolonnens begrenset bindingskapasitet.
Kvaliteten på FBS
DeKvaliteten på FBS brukes til å supplere kulturmediet er kritisk for den in vitro overlevelse av lymfocytter. FBS fra ulike kilder og grupper kan variere i sin evne til å støtte in vitro lymfocytt svar. Derfor er det viktig å teste forskjellige typer av FBS for å finne en som gir høy-spesifikk reaksjon med lav bakgrunn. Et betydelig antall flasker bør da være reservert som en aksje.
Modifikasjoner og feilsøking
CFSE merking forhold
Selv om CFSE merking arbeider i ren RPMI, er det funnet at ved anvendelse av en lav prosentandel av FBS i PBS reduserer celledød under lasteprosessen, uten at effektiviteten av merking. Videre er nærværet av FBS minimerer celletap under sentrifugeringen.
Et viktig aspekt ved CFSE merking er å sikre jevn merking av cellene for å visualisere den distinkte topps som representerer celledeling. Overbelastning av CFSE kan føre til økt celledød in vitro eller dårlig gjenvinning av merkede celler in vivo. På den annen side, kan utilstrekkelig CFSE merking eller heterogenitet i mål-cellesuspensjonen under prosessen av merking resulterer i dårlig løst CFSE topper 12. Derfor er det viktig å optimalisere CFSE merkingsforhold. Mengden av CFSE benyttes for merking bør holdes så lav som mulig for å redusere mulige toksiske effekter mot overbelastning, men likevel oppnå tilstrekkelig merking for å detektere fint oppløste topper ved stimulering i løpet av den eksperimentelle tidsramme. I tillegg, for å unngå dårlig oppløste topper, bør celleklumper fjernes fra en enkelt cellesuspensjon forut for CFSE lasting.
Celleklumper og celle tap
Det er avgjørende å sikre at cellene er fullt re-suspendert før du går videre til neste trinn fordi den evige flyttbal av celleklumper under forsøket, drastisk reduserer antall celler. Celleklumper er vanligvis forbundet med redusert cellelevedyktighet eller utilstrekkelig re-suspensjon av cellepelleten.
CFSE og emisjonsspekter overlapping
CFSE-merkede celler kan videre defineres med fluoroforen-konjugerte antistoffer etter en dag i kultur, men disse CFSE-merkede celler fremdeles sterkt fluorescerende etter en dag i kultur. Ved hjelp av kombinasjoner av antistoffer konjugert til lyse fluoroforer med minimale mengder av emisjonsspektra overlapping med CFSE, slik som fykoerytrin (PE) og fykoerytrin-cyanin 7 (PeCy7), gir optimale fargingsresultater. Men kompensasjon for å redusere utslipp spektra overlapping er fortsatt nødvendig. I tillegg, på grunn av den høye intensiteten av CFSE signal (FL-1-kanal) som søl i FL-kanal 2, og FL-2-kanal som skal kompenseres ved å trekke fra den høye andel av FL-to verdien for å oppnå en optimal CFSE profilen. Man kan referere til artikkel publisert av Quah et al., Som leverer løsninger for feilsøking CFSE merking og analyse av resultatene 12.
Alternativer til CFSE
Den emisjonsspekteret av CFSE begrenser bruken av kombinasjoner av CFSE med fluorescein-derivater, slik som grønt fluorescerende protein (GFP) og fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert antistoffer. Det finnes imidlertid også andre kommersielt tilgjengelige cellefargestoffer med like høy fluorescensintensitet og lav celletoksisitet i fiolett (CTV, eksitasjon / emisjon: 405/450 nm), gul (CTY, 555/580 nm), langt rød (CTFR, 630 / 661 nm eller CPD670, 647/670 nm) og rød (PKH26, 551/567 nm). Ved hjelp av celle merking fargestoffer med ulike emisjonsspekter gir fleksibilitet i eksperimentell design. På den annen side, kan ikke alle av de ovenfor beskrevne celle merking fargestoffer som genererer distinkte celledelings topper. En sammenlignende studie utført ved hjelp avulike celle merking fargestoffer konkluderte med at CTV er en bedre erstatning for CFSE fordi CTV muliggjør deteksjon av et høyere antall klart definerte celledeling topper 13.
begrensninger
Den største begrensningen av magnetisk cellesortering er at det er kun egnet for enkel cellesortering. I vårt eksempel kan vi bruke CD43 å utarme alle ikke-B-celler fra milt; Men vi ville ikke være i stand til å skille follikulære B-celler fra marginal sone B-celler. Disse sub-populasjoner kan bare defineres med flere overflatemarkører. Mens det er mulig å positivt velge celler ved hjelp av magnetisk cellesortering basert på flere overflatemarkører, er det avhengig av spesielt forberedt, kommersielt tilgjengelige reagenser som gjør utgivelsen av mikroperler fra målceller etter den første runden av sortering før du går videre til andre markør. Dermed vil brukeren være helt avhengig av de kommersielt tilgjengelige sett. I et slikt tilfelle, i FACSer mye mer fordelaktig å separere raffinerte cellepopulasjoner.
Betydningen av Technique
Antistoffbaserte celle sortering tilnærminger, for eksempel magnetiske celle sortering og FACS, er den mest pålitelige celle sortering teknikker for å date 15. Andre metoder for celleseparasjon eksisterer, inkludert teknikker tetthetsbaserte og adherens-basert, men lymfocytter er dårlig adherente celler og deres subpopulasjoner er relativt like i tetthet, og dermed adherence- og tetthet baserte teknikker er enten ikke er anvendelig eller er svært ineffektiv 15 .
Som nevnt i innledningen, rask, enkel og høy cellelevedyktighet, og uavhengig av hvilket som helst avansert utstyr er den vinnende trekk ved magnetisk cellesortering i løpet av FACS. Spesielt negativ uttømming ved hjelp av magnetisk cellesortering etiketter og tapper uønskede celler ved anvendelse av en magnetisk separasjonskolonne, mens isolering av målceller med minimal modifications til celleoverflaten og vedlikeholde den naive tilstand.
fremtidige Applications
Den svært anrikede, levedyktige, og naive lymfocytter renset ved hjelp av denne magnetiske baserte renseteknikk kan underkastes forskjellige funksjonelle analyser av lymfocytt oppførsel og signaleringsmekanismer in vitro og in vivo. I denne protokoll har vi demonstrert ved anvendelse av to forskjellige celle proliferasjonsanalyser - [3H] -tymidin inkorporering assay og CFSE celleproliferasjonsanalyse - å undersøke celle proliferative kapasiteten til aktiverte lymfocytter.
Valget mellom [3H] -tymidin inkorporering assay og CFSE celleproliferasjonsanalyse avhenger i stor grad av prøvestørrelse og forsøksbetingelser. Ved anvendelse av [3H] -tymidin inkorporering assay i eksperimenter med store prøvestørrelser genererer high-throughput-celle spredning av data. For å sikre optimal [<sup> 3H] -tymidin-opptak og reproduserbarhet av resultatene, [3H] -tymidin bør tilsettes til kulturen når et flertall av cellene er aktivt delende. Optimalisering av merkingen protokollen kreves for ulike celletyper og stimuli. Videre, på grunn av radioaktiv natur av [3H] -tymidin, kan denne inkorporering analysen ble kun bli utført in vitro, i motsetning til CFSE merking av celler, som kan aktiveres in vitro (figur 2B) eller adoptivt overført til mottager mus (figur 1B og 1C).
Den CFSE celleproliferasjonsanalyse, på den annen side gir mer informasjon om celleformering enn [3H] -tymidin-inkorporering. Siden intensiteten av CFSE i CFSE-merkede celler reduseres til det halve med hver celledeling, kan man bestemme antall celledelinger og andelen av celler i hver avdeling ved telling av antall og størrelse av topper
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Studien er støttet av Kunnskapsdepartementet, Singapore (AcRF Tier1-RG40 / 13 og tier2-MOE2013-T2-2-038). Manuskriptet ble redigert av Amy Sullivan fra Obrizus Communications.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
