Definition substratspecificiteter for lipase og phospholipase Kandidater
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
Mikroorganismer producerer et bredt spektrum af (phospho) lipaser, der udskilles for at gøre eksterne substrater tilgængelige for organismen. Alternativt kan andre (phospho) lipaser være fysisk forbundet med den producerende organisme forårsager en omsætning på iboende lipider og ofte giver anledning til en ombygning af de cellulære membraner. Selvom potentielle (phospho) lipaser kan forudsiges med en række algoritmer når genet / proteinsekvens er til rådighed, har ofte ikke opnået eksperimentelt bevis for enzymaktiviteterne, substratspecificiteter og potentielle fysiologiske funktioner. Dette håndskrift beskriver optimeringen af assay betingelser for potentielle (phospho) lipaser med ukendte substratspecificiteter og hvordan man kan ansætte disse optimerede betingelser i jagten på det naturlige substrat af en respektiv (phospho) lipase. Brug af kunstige chromogene substrater, såsom p-nitrophenyl-derivater, kan bidrage til at detektere en mindreenzymatisk aktivitet for en forudsagt (phospho) lipase under standardbetingelser. Efter at have fundet en mindre enzymatisk aktivitet, kan de forskellige parametre i en enzymassay varieres for at opnå en mere effektiv hydrolyse af det kunstige substrat. Efter at have konstateret, under hvilke betingelser et enzym fungerer godt, bør en række potentielle naturlige substrater analyseres for deres nedbrydning, en proces, der kan følges ansætte forskellige kromatografiske metoder. Definitionen af substratspecificiteter for nye enzymer, ofte giver hypoteser for en potentiel fysiologiske rolle af disse enzymer, som derefter kan testes eksperimentelt. Efter disse retningslinjer, var vi i stand til at identificere en phospholipase C (SMc00171), der nedbryder phosphatidylcholin at phosphocholin og diacylglycerol, i et afgørende skridt for ombygningen af membraner i bakterien Sinorhizobium meliloti på fosfor-begrænsende betingelser for vækst. For to forudsagte patatin-ligesom phospholipaser (SMc00930 og SMc01003) af den samme organisme, kunne vi omdefinere deres substratspecificiteter og præcisere, at SMc01003 er en diacylglycerol lipase.
Introduction
Glycerol-baserede lipider, såsom triacylglyceroler og (glycero) fosfolipider udgør vigtige og formentlig den mest kendte lipidklasser 1. Triacylglyceroler (tags) er fedtstoffer eller olier, der normalt fungerer som opbevaring lipider og dermed som potentielle energi- og kulstof kilder. TAG kan nedbrydes af lipaser, som ofte udskilles af det producerende organisme at fordøje eksterne TAG og gøre dem tilgængelige som kulstofkilder. Desuden har lipaser blevet bredt studeret i årenes løb på grund af deres vigtige bioteknologiske applikationer 2.
På grund af deres amfifile karakter og deres næsten cylindrisk form, (glycero) phospholipider udviser membrandannende egenskaber og sædvanligvis udgør de vigtigste lipid-bestanddele af en dobbeltlagede membran 3. I simple mikroorganismer, såsom bakterien Escherichia coli, kun tre store hoved gruppe varianter, phosphatidylglycerol (PG), cardiolipin (CL), og phosphatidylethanolamine (PE) er stødt på, selv om man skal være klar over, at hver af dem kan være substitueret med et betydeligt antal forskellige fede acylkæder i sn-1- eller sn-2-position giver anledning til et stort antal forskellige molekylspecies 4 . Andre bakterier kan have andre phospholipider foruden eller i stedet. For eksempel, Sinorhizobium meliloti, en jord bakterie, som er i stand til at danne en nitrogen-fikserende rodknold symbiose med bælgplanter lucerne (Medicago sativa), indeholder foruden PE et andet zwitterionisk phospholipid, phosphatidylcholin (PC) 5. Også, lipider, der ikke indeholder fosfor eller glycerol kan være amfifilt og indgår i cellemembranen. For eksempel efter fosfor-begrænsende vækstbetingelser, i S. meliloti, (glycero) phospholipider er i høj grad erstattet af membranlipider, der ikke indeholder phosphor, dvs. sulfolipider, ornithin lipider, og diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. I bakterier er DGTS dannet af diacylglycerol (DAG) i en to-trins pathway 7, men kilden til DAG generation var ikke klart. Pulse-chase eksperimenter foreslog, at PC kan være en forløber for DGTS 8 og ved hjælp af den metode, der er beskrevet i dette manuskript, vi kunne identificere en phospholipase C (PLCP, SMc00171), der er dannet under fosfor-begrænsende betingelser, og som kan konvertere pc til DAG og phosphocholin- 8.
I en separat undersøgelse, opdagede vi, at en acyl-CoA syntetase (FADD) deficiente mutant af S. meliloti eller af Escherichia coli akkumulerede frie fedtsyrer ved indtastning stationær vækstfase 9. Selv om disse fedtsyrer syntes at være afledt af membranlipider, blev den præcise kilde til de frie fedtsyrer eller enzymet (er) befriende dem ikke kendt. Igen, beskæftiger den strategi, der er skitseret i dette manuskript, to patatin-lignende 10 (phospho) lipaser (SMc00930 og SMc01003), der bidrog til dannelsen af frie fedtsyrer i S. meliloti 11 blev forudsagt. Overraskende SMc01003 anvendes DAG som substrat konvertere den til monoacylglycerol og endelig glycerol og frie fedtsyrer 11. Derfor SMc01003 er en DAG-lipase (DGLA).
Selv om en række algoritmer findes for at forudsige potentiale (phospho) lipaser 12,13, deres præcise funktion og fysiologiske rolle er normalt ikke kendt. Her skitserer vi en protokol, til at klone og overudtrykker forudsagte eller potentielle (phospho) lipaser. Dette håndskrift forklarer, hvordan enzymassays kan udvikles og optimeres til den overudtrykt (phospho) lipase ved hjælp af kunstige kromogene substrater. Vi giver eksempler på, hvordan med en optimeret enzym assay den virkelige (phospho) lipase substrat kan opstå, og hvordan disse resultater kan berige vores forståelse af mikrobiel fysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løbet af de sidste 20 år, har genomer af mange organismer blevet sekventeret, og selv om et væld af genom sekvens data er blevet genereret, er funktionel fortolkning halter bagefter og hæmmer derfor vores forståelse af genom-funktion. Genfunktioner i genomer ofte tildeles baseret på lighed med gener med kendt funktion eller forekomsten af konserverede motiver. Den præcise funktion af et givet gen er ofte ikke kendt. Især forudsagte strukturelle gener for enzymer ikke let kan udforskes med OMIC teknikker …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACYT-Mexico) (82.614, 153.998, 253.549 og 178.359 i Investigación Científica basica samt 118 i Investigación en Fronteras de la Ciencia) og fra Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM, PAPIIT IN202616, IN203612).
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
- Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
- De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
- Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
- Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
- Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
- Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
- Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
- Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
- Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
- Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
- Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
- Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
- Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
- Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
- Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
- Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
- Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
