Lipase और phospholipase उम्मीदवारों के लिए सब्सट्रेट specificities की परिभाषा
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
सूक्ष्मजीवों (phospho) lipases कि आदेश में बाहरी substrates जीव के लिए उपलब्ध बनाने के लिए में स्रावित कर रहे हैं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का उत्पादन। वैकल्पिक रूप से, अन्य (phospho) lipases शारीरिक रूप से उत्पादन जीव आंतरिक लिपिड का कारोबार पैदा कर रहा है और अक्सर सेलुलर झिल्ली का एक remodeling को जन्म देने के साथ जुड़ा हो सकता है। हालांकि संभावित (phospho) lipases एल्गोरिदम के एक नंबर जब जीन / प्रोटीन अनुक्रम उपलब्ध है के साथ भविष्यवाणी की जा सकती है, एंजाइम की गतिविधियों, सब्सट्रेट specificities, और संभावित शारीरिक कार्यों की प्रयोगात्मक सबूत अक्सर प्राप्त नहीं किया गया है। यह पांडुलिपि अज्ञात सब्सट्रेट specificities और कैसे एक संबंधित (phospho) lipase के प्राकृतिक सब्सट्रेट के लिए खोज में इन अनुकूलित शर्तों को रोजगार के लिए के साथ संभावित (phospho) lipases के लिए परख की स्थिति के अनुकूलन का वर्णन है। ऐसे पी -nitrophenyl डेरिवेटिव के रूप में कृत्रिम chromogenic substrates, हो सकता का उपयोग करना, एक नाबालिग का पता लगाने में मददमानक परिस्थितियों में एक भविष्यवाणी (phospho) lipase के लिए enzymatic गतिविधि। इस तरह के एक नाबालिग enzymatic गतिविधि का सामना करना पड़ा करने के बाद, एक एंजाइम परख के विशिष्ट मानकों को आदेश कृत्रिम सब्सट्रेट के एक अधिक कुशल हाइड्रोलिसिस प्राप्त करने के लिए अलग किया जा सकता है। स्थिति है जिसके तहत एक एंजाइम अच्छी तरह से काम करता है निर्धारित करने के बाद के बाद, संभावित प्राकृतिक substrates की एक किस्म है, उनकी गिरावट के लिए यत्न किया जाना चाहिए एक प्रक्रिया है कि अलग chromatographic तरीकों को रोजगार का पालन किया जा सकता है। नई एंजाइमों के लिए सब्सट्रेट specificities की परिभाषा, अक्सर इन एंजाइमों, जो तब प्रयोगात्मक परीक्षण किया जा सकता है की एक संभावित शारीरिक भूमिका के लिए परिकल्पना है। इन निर्देशों के बाद, हम एक phospholipase सी (SMc00171) कि phosphocholine और diacylglycerol, विकास की फास्फोरस सीमित शर्तों पर जीवाणु Sinorhizobium meliloti में झिल्ली के पुनर्गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम में करने के लिए phosphatidylcholine degrades की पहचान करने में सक्षम थे। दो patatin- भविष्यवाणी के लिएएक ही जीव की phospholipases (SMc00930 और SMc01003) की तरह, हम उनके सब्सट्रेट specificities को फिर से परिभाषित और स्पष्ट है कि SMc01003 एक diacylglycerol lipase है हो सकता है।
Introduction
ऐसे triacylglycerols और (glycero) फॉस्फोलिपिड के रूप में ग्लिसरॉल आधारित लिपिड महत्वपूर्ण गठन और शायद सबसे प्रसिद्ध लिपिड कक्षाएं 1। Triacylglycerols (टैग) वसा या तेल, जो आम तौर पर भंडारण लिपिड के रूप में कार्य है, और इसलिए संभावित ऊर्जा और कार्बन स्रोत के रूप में कर रहे हैं। टैग lipases, जो अक्सर उत्पादन जीव द्वारा स्रावित होते हैं बाहरी TAGs पचाने और उन्हें कार्बन स्रोत के रूप में उपलब्ध बनाने के लिए द्वारा अपमानित किया जा सकता है। इसके अलावा, lipases व्यापक रूप से उनके महत्वपूर्ण जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों 2 के कारण पिछले कुछ वर्षों में अध्ययन किया गया है।
उनकी amphiphilic प्रकृति और उनके पास बेलनाकार आकृति, (glycero) फॉस्फोलिपिड प्रदर्शनी झिल्ली के गठन गुण और आम तौर पर एक bilayered झिल्ली 3 के प्रमुख घटक lipídic का गठन करने के कारण। ऐसे कोलाई, केवल तीन प्रमुख सिर समूह वेरिएंट, phosphatidylglycerol (पीजी), cardiolipin (सीएल), और phosphatid के रूप में सरल सूक्ष्मजीवों मेंylethanolamine (पीई) सामना कर रहे हैं, हालांकि एक बारे में पता होना चाहिए कि उनमें से हर एक एक काफी अलग आणविक प्रजातियों 4 की एक बड़ी संख्या के लिए एस.एन. पर विभिन्न फैटी एसाइल चेन की संख्या -1 या एस.एन. -2 स्थिति जन्म देने के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । अन्य जीवाणुओं अलावा या बजाय अन्य फॉस्फोलिपिड हो सकता है। 5 उदाहरण के लिए, Sinorhizobium meliloti, एक मृदा जीवाणु, जो फली अल्फला (मेडिकागो पौधा) के साथ एक नाइट्रोजन फिक्सिंग जड़ गुत्थी सहजीवन बनाने में सक्षम है, इसके अलावा में शामिल एक दूसरे zwitterionic फॉस्फोलिपिड, phosphatidylcholine (पीसी) पीई के लिए। फास्फोरस या ग्लिसरॉल इसके अलावा, लिपिड युक्त नहीं सेलुलर झिल्ली की amphiphilic और फार्म का हिस्सा हो सकता है। उदाहरण के लिए, फास्फोरस सीमित विकास की स्थिति पर, एस में meliloti, (glycero) फॉस्फोलिपिड काफी हद तक झिल्ली लिपिड कि फास्फोरस, यानी, sulfolipids, ओर्निथिन लिपिड, और diacylglyceryl trimethylho शामिल नहीं है द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैंmoserine (DGTS) 6। बैक्टीरिया में, DGTS एक दो कदम मार्ग 7 में diacylglycerol (डेग) से बनाई है लेकिन डेग पीढ़ी के लिए स्रोत स्पष्ट नहीं था। पल्स चेस प्रयोगों सुझाव दिया है कि पीसी DGTS 8 के लिए एक अग्रदूत साबित हो सकता है और कार्यप्रणाली इस पांडुलिपि हम एक phospholipase सी (PlcP, SMc00171) की पहचान कर सकता है में वर्णित का उपयोग कर सकता है कि फास्फोरस सीमित शर्तों के तहत गठित किया गया है और जो डेग और phosphocholine में पीसी परिवर्तित कर सकते हैं 8।
एक अलग अध्ययन में, हमें पता चला है कि एक एसाइल सीओए synthetase (Fadd) एस के -deficient उत्परिवर्ती meliloti या कोलाई मुक्त फैटी एसिड संचित जब विकास 9 के स्थिर चरण में प्रवेश। हालांकि इन फैटी एसिड झिल्ली लिपिड से प्राप्त किया जा करने के लिए लग रहा था, मुक्त फैटी एसिड या एंजाइम (s) उन्हें मुक्ति के लिए सटीक स्रोत नहीं जाने जाते थे। फिर, रणनीति काम इस पांडुलिपि में उल्लिखित, दो patatin की तरह 10 (phospho) lipases (SMc00930 और SMc01003) है कि एस में मुक्त फैटी एसिड के गठन के लिए योगदान meliloti 11 भविष्यवाणी की थी। हैरानी की बात है, यह SMc01003 monoacylglycerol और अंत में ग्लिसरॉल और मुक्त फैटी एसिड 11 को परिवर्तित सब्सट्रेट के रूप में डेग इस्तेमाल किया। इसलिए, SMc01003 एक डेग lipase (DGLA) है।
एल्गोरिदम के एक नंबर क्षमता (phospho) की भविष्यवाणी के लिए मौजूद हालांकि 12,13 lipases, उनके सटीक समारोह और शारीरिक भूमिका आम तौर पर नहीं जाना जाता है। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार, क्लोन करने के लिए और overexpress भविष्यवाणी या संभावित (phospho) lipases। यह पांडुलिपि कैसे एंजाइम assays विकसित और कृत्रिम chromogenic substrates का उपयोग करके overexpressed (phospho) lipase के लिए अनुकूलित किया जा सकता बताते हैं। हम कैसे एक अनुकूलित एंजाइम परख के साथ रियल (phospho) lipase सब्सट्रेट सामना किया जा सकता है और कैसे इन निष्कर्षों माइक्रोबियल शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ को समृद्ध हो सकता है उदाहरण देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले 20 वर्षों में, कई जीवों के जीनोम अनुक्रम निर्धारण किया गया है और हालांकि जीनोम अनुक्रम डेटा का धन उत्पन्न किया गया है, कार्यात्मक व्याख्या पिछड़ रहा है और इसलिए जीनोम समारोह के बारे में हमारी समझ क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (Investigación एन Fronteras डे ला Ciencia में Investigación Científica Basica में 82614, 153998, 253549, और 178,359 के साथ ही 118) और Dirección जनरल डी से Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-मेक्सिको (CONACYT-मैक्सिको) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया Asuntos डी व्यक्तिगत Académico-Universidad Nacional ऑटोनोमा डी मेक्सिको (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612)।
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
References
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