Summary

Lipase और phospholipase उम्मीदवारों के लिए सब्सट्रेट specificities की परिभाषा

Published: November 23, 2016
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Summary

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Abstract

सूक्ष्मजीवों (phospho) lipases कि आदेश में बाहरी substrates जीव के लिए उपलब्ध बनाने के लिए में स्रावित कर रहे हैं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का उत्पादन। वैकल्पिक रूप से, अन्य (phospho) lipases शारीरिक रूप से उत्पादन जीव आंतरिक लिपिड का कारोबार पैदा कर रहा है और अक्सर सेलुलर झिल्ली का एक remodeling को जन्म देने के साथ जुड़ा हो सकता है। हालांकि संभावित (phospho) lipases एल्गोरिदम के एक नंबर जब जीन / प्रोटीन अनुक्रम उपलब्ध है के साथ भविष्यवाणी की जा सकती है, एंजाइम की गतिविधियों, सब्सट्रेट specificities, और संभावित शारीरिक कार्यों की प्रयोगात्मक सबूत अक्सर प्राप्त नहीं किया गया है। यह पांडुलिपि अज्ञात सब्सट्रेट specificities और कैसे एक संबंधित (phospho) lipase के प्राकृतिक सब्सट्रेट के लिए खोज में इन अनुकूलित शर्तों को रोजगार के लिए के साथ संभावित (phospho) lipases के लिए परख की स्थिति के अनुकूलन का वर्णन है। ऐसे पी -nitrophenyl डेरिवेटिव के रूप में कृत्रिम chromogenic substrates, हो सकता का उपयोग करना, एक नाबालिग का पता लगाने में मददमानक परिस्थितियों में एक भविष्यवाणी (phospho) lipase के लिए enzymatic गतिविधि। इस तरह के एक नाबालिग enzymatic गतिविधि का सामना करना पड़ा करने के बाद, एक एंजाइम परख के विशिष्ट मानकों को आदेश कृत्रिम सब्सट्रेट के एक अधिक कुशल हाइड्रोलिसिस प्राप्त करने के लिए अलग किया जा सकता है। स्थिति है जिसके तहत एक एंजाइम अच्छी तरह से काम करता है निर्धारित करने के बाद के बाद, संभावित प्राकृतिक substrates की एक किस्म है, उनकी गिरावट के लिए यत्न किया जाना चाहिए एक प्रक्रिया है कि अलग chromatographic तरीकों को रोजगार का पालन किया जा सकता है। नई एंजाइमों के लिए सब्सट्रेट specificities की परिभाषा, अक्सर इन एंजाइमों, जो तब प्रयोगात्मक परीक्षण किया जा सकता है की एक संभावित शारीरिक भूमिका के लिए परिकल्पना है। इन निर्देशों के बाद, हम एक phospholipase सी (SMc00171) कि phosphocholine और diacylglycerol, विकास की फास्फोरस सीमित शर्तों पर जीवाणु Sinorhizobium meliloti में झिल्ली के पुनर्गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम में करने के लिए phosphatidylcholine degrades की पहचान करने में सक्षम थे। दो patatin- भविष्यवाणी के लिएएक ही जीव की phospholipases (SMc00930 और SMc01003) की तरह, हम उनके सब्सट्रेट specificities को फिर से परिभाषित और स्पष्ट है कि SMc01003 एक diacylglycerol lipase है हो सकता है।

Introduction

ऐसे triacylglycerols और (glycero) फॉस्फोलिपिड के रूप में ग्लिसरॉल आधारित लिपिड महत्वपूर्ण गठन और शायद सबसे प्रसिद्ध लिपिड कक्षाएं 1। Triacylglycerols (टैग) वसा या तेल, जो आम तौर पर भंडारण लिपिड के रूप में कार्य है, और इसलिए संभावित ऊर्जा और कार्बन स्रोत के रूप में कर रहे हैं। टैग lipases, जो अक्सर उत्पादन जीव द्वारा स्रावित होते हैं बाहरी TAGs पचाने और उन्हें कार्बन स्रोत के रूप में उपलब्ध बनाने के लिए द्वारा अपमानित किया जा सकता है। इसके अलावा, lipases व्यापक रूप से उनके महत्वपूर्ण जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों 2 के कारण पिछले कुछ वर्षों में अध्ययन किया गया है।

उनकी amphiphilic प्रकृति और उनके पास बेलनाकार आकृति, (glycero) फॉस्फोलिपिड प्रदर्शनी झिल्ली के गठन गुण और आम तौर पर एक bilayered झिल्ली 3 के प्रमुख घटक lipídic का गठन करने के कारण। ऐसे कोलाई, केवल तीन प्रमुख सिर समूह वेरिएंट, phosphatidylglycerol (पीजी), cardiolipin (सीएल), और phosphatid के रूप में सरल सूक्ष्मजीवों मेंylethanolamine (पीई) सामना कर रहे हैं, हालांकि एक बारे में पता होना चाहिए कि उनमें से हर एक एक काफी अलग आणविक प्रजातियों 4 की एक बड़ी संख्या के लिए एस.एन. पर विभिन्न फैटी एसाइल चेन की संख्या -1 या एस.एन. -2 स्थिति जन्म देने के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । अन्य जीवाणुओं अलावा या बजाय अन्य फॉस्फोलिपिड हो सकता है। 5 उदाहरण के लिए, Sinorhizobium meliloti, एक मृदा जीवाणु, जो फली अल्फला (मेडिकागो पौधा) के साथ एक नाइट्रोजन फिक्सिंग जड़ गुत्थी सहजीवन बनाने में सक्षम है, इसके अलावा में शामिल एक दूसरे zwitterionic फॉस्फोलिपिड, phosphatidylcholine (पीसी) पीई के लिए। फास्फोरस या ग्लिसरॉल इसके अलावा, लिपिड युक्त नहीं सेलुलर झिल्ली की amphiphilic और फार्म का हिस्सा हो सकता है। उदाहरण के लिए, फास्फोरस सीमित विकास की स्थिति पर, एस में meliloti, (glycero) फॉस्फोलिपिड काफी हद तक झिल्ली लिपिड कि फास्फोरस, यानी, sulfolipids, ओर्निथिन लिपिड, और diacylglyceryl trimethylho शामिल नहीं है द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैंmoserine (DGTS) 6। बैक्टीरिया में, DGTS एक दो कदम मार्ग 7 में diacylglycerol (डेग) से बनाई है लेकिन डेग पीढ़ी के लिए स्रोत स्पष्ट नहीं था। पल्स चेस प्रयोगों सुझाव दिया है कि पीसी DGTS 8 के लिए एक अग्रदूत साबित हो सकता है और कार्यप्रणाली इस पांडुलिपि हम एक phospholipase सी (PlcP, SMc00171) की पहचान कर सकता है में वर्णित का उपयोग कर सकता है कि फास्फोरस सीमित शर्तों के तहत गठित किया गया है और जो डेग और phosphocholine में पीसी परिवर्तित कर सकते हैं 8।

एक अलग अध्ययन में, हमें पता चला है कि एक एसाइल सीओए synthetase (Fadd) एस के -deficient उत्परिवर्ती meliloti या कोलाई मुक्त फैटी एसिड संचित जब विकास 9 के स्थिर चरण में प्रवेश। हालांकि इन फैटी एसिड झिल्ली लिपिड से प्राप्त किया जा करने के लिए लग रहा था, मुक्त फैटी एसिड या एंजाइम (s) उन्हें मुक्ति के लिए सटीक स्रोत नहीं जाने जाते थे। फिर, रणनीति काम इस पांडुलिपि में उल्लिखित, दो patatin की तरह 10 (phospho) lipases (SMc00930 और SMc01003) है कि एस में मुक्त फैटी एसिड के गठन के लिए योगदान meliloti 11 भविष्यवाणी की थी। हैरानी की बात है, यह SMc01003 monoacylglycerol और अंत में ग्लिसरॉल और मुक्त फैटी एसिड 11 को परिवर्तित सब्सट्रेट के रूप में डेग इस्तेमाल किया। इसलिए, SMc01003 एक डेग lipase (DGLA) है।

एल्गोरिदम के एक नंबर क्षमता (phospho) की भविष्यवाणी के लिए मौजूद हालांकि 12,13 lipases, उनके सटीक समारोह और शारीरिक भूमिका आम तौर पर नहीं जाना जाता है। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार, क्लोन करने के लिए और overexpress भविष्यवाणी या संभावित (phospho) lipases। यह पांडुलिपि कैसे एंजाइम assays विकसित और कृत्रिम chromogenic substrates का उपयोग करके overexpressed (phospho) lipase के लिए अनुकूलित किया जा सकता बताते हैं। हम कैसे एक अनुकूलित एंजाइम परख के साथ रियल (phospho) lipase सब्सट्रेट सामना किया जा सकता है और कैसे इन निष्कर्षों माइक्रोबियल शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ को समृद्ध हो सकता है उदाहरण देते हैं।

Protocol

1. क्लोन और भविष्यवाणी की Lipase के लिए overexpress स्ट्रक्चरल जीन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) 14 और विशिष्ट ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (तालिका 1) 15 का उपयोग करना, ब्याज (smc01003, smc00930, या smc00171) के जी…

Representative Results

Bis- पी -nitrophenyl फास्फेट के साथ पीसी-विशिष्ट phospholipase सी SMc00171 की गतिविधि सेल मुक्त अर्क ई से प्राप्त कोलाई BL21 (DE3) x pLysS, जो था smc00171 व्यक्त की, bis- ?…

Discussion

पिछले 20 वर्षों में, कई जीवों के जीनोम अनुक्रम निर्धारण किया गया है और हालांकि जीनोम अनुक्रम डेटा का धन उत्पन्न किया गया है, कार्यात्मक व्याख्या पिछड़ रहा है और इसलिए जीनोम समारोह के बारे में हमारी समझ क…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम (Investigación एन Fronteras डे ला Ciencia में Investigación Científica Basica में 82614, 153998, 253549, और 178,359 के साथ ही 118) और Dirección जनरल डी से Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-मेक्सिको (CONACYT-मैक्सिको) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया Asuntos डी व्यक्तिगत Académico-Universidad Nacional ऑटोनोमा डी मेक्सिको (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612)।

Materials

Chloroform JT Baker 9180-03 TLC analysis & Lipid extraction
Methanol JT Baker 9070-03 TLC analysis & Lipid extraction
Acetic Acid JT Baker 9507-05 TLC analysis & Lipid extraction
Hexanes JT Baker 9309-02 TLC analysis & Lipid extraction
Diethylether Sigma 32203 Enzymatic assays
bidistilled water  ANY  NA Enzymatic assays
Tris Base Sigma T-1503 Enzymatic assays
HCl Baker 9535-02 Enzymatic assays
NaCl Baker 3624-01 Enzymatic assays
Triton X-100 Sigma X-100 Enzymatic assays
LB broth ANY NA Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water
tryptone Becton Dickinson and Company 211705 Bacterial growth
yeast extract Becton Dickinson and Company 212750 Bacterial growth
TY broth ANY NA Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water
CaCl2 2 H2O Baker 1332-01 Enzymatic assays
isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Invitrogen 15529-019 Bacterial growth
Diethanolamine Sigma D-8885 Enzymatic assays
MnCl2 Sigma 221279 Enzymatic assays
Phospholipase A2 snake venom Sigma P0790 Enzymatic assays
Phospholipase C Clostridium perfingrens Sigma P7633 Enzymatic assays
Bis-p-nitrophenyl phosphate Sigma 07422AH Enzymatic assays
p-nitrophenyl stearate Sigma N3627 Enzymatic assays
p-nitrophenyl dodecanoate Sigma 61716 Enzymatic assays
p-nitrophenyl decanoate Sigma N0252 Enzymatic assays
p-nitrophenyl palmitate Sigma N2752 Enzymatic assays
p-nitrophenyl butyrate Sigma N9876 Enzymatic assays
p-nitrophenyl octanoate Sigma 21742 Enzymatic assays
Acetic Acid, sodium salt [1-14C] Perkin Elmer NEC084 Bacterial growth
dimethylsulfoxide (DMSO) JT Baker 9224-01 Enzymatic assays
Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. Merck 105547 TLC analysis & Lipid extraction
Spectrometer UV/VIS Lambda 35 Perkin Elmer NA Enzymatic assays
Storm 820 Phosphorimager Molecular Dynamics NA Photostimulable Luminescence scanner 
Multipurpose Scintillation Counter Beckman Coulter NA Radioactivity Quantification
French Pressure Cell ThermoSpectronic NA  Breakage of cells
chromatography paper 3MM Chr Whatman 3030917 TLC analysis
Sinorhizobium meliloti 1021our reference 34 studied strain
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells Novagen 69451 protein expression strain
pET9a vector Novagen 69431 protein expression vector
pET17b vector Novagen 69663 protein expression vector
sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon Becton Dickinson 352057 radiolabeling of bacterial cultures
polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) Eppendorf 30125.15 Enzymatic assays
1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol Sigma D9135 lipid standard
L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl Sigma P6267 lipid standard
DL-α-monopalmitin Sigma M1640 lipid standard
palmitic acid Sigma P0500 lipid standard

References

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
  2. Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
  3. Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
  4. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
  5. De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
  6. Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
  7. Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
  8. Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
  9. Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
  10. Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
  11. Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
  12. Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
  13. Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
  18. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
  19. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
  20. Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
  21. Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
  22. Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
  23. Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
  24. Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
  25. Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
  26. Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
  27. Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
  28. Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).

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Sahonero-Canavesi, D. X., Zavaleta-Pastor, M., Martínez-Aguilar, L., López-Lara, I. M., Geiger, O. Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates. J. Vis. Exp. (117), e54613, doi:10.3791/54613 (2016).

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