Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

doi: 10.3791/54618 Published: November 17, 2016

Abstract

civciv embriyo doğrudan bir şekilde gelişim soruları incelemek için kullanılabilecek mükemmel bir omurgalı bir model sağlar. cerrahi girişim sonrasında erişilebilirlik ve sağlamlık önemli deneysel güçlü vardır. Mika levhalar civciv bacak tomurcuk başlamasını 1 önlemek için kullanılan ilk engelleri vardı. kanat tomurcuk veya bacak tomurcuk indüksiyon ve ya başlatılması için geçirimsiz bir bariyer olarak alüminyum folyo kullanmak Protokoller tarif edilmektedir. Biz bariyer tarafından engellendi arz aday endojen faktörlerin dışsal olarak bariyere boncuk yerleştirme yanal ile bu tekniği birleştirir. Sonuçlar daha sonra gen ekspresyonu, in situ hibridizasyon ile analiz edilmiştir. Ana odak indüksiyon retinoik asit sinyalizasyon ve civciv embriyo ön ve hindlimb sonraki başlatılması rolüdür. Bu BMS 493 kullanımı (retinoik asit reseptörleri bir ters agonist (RAR)) yan levha mezoderm (LPM) implante batırılmış boncuklar bir bar etkisini taklit etmek içinrier Somitlerin (retinoik asit kaynağıyla (RA)) ve ekstremite tomurcukları büyümesi olan LPM arasına yerleştirilir. Bu protokollerin değiştirilmiş versiyonları da endüktif ipuçları kökeni ve zamanlaması konusunda diğer soruları kullanılabilir. civciv embriyo bölgesi, ilgili bir gelişim aşamasında erişilebilir sunulmuştur, bir engel çalışılan iki doku ve gelişme sonucu değişiklikler arasında yerleştirilebilir. Örnekler, karaciğer ya da böbrek indüksiyon gibi gelişmekte olan beyin, ekseni uzantısında ve organ gelişiminde bulunabilir.

Introduction

Klasik embriyolog geleneksel embriyonik gelişimini kontrol mekanizmaları sorgulamak için fiziksel teknikler kullandı. 1960'lar ve 1970'lerde araştırmacılar embriyogenez sırasında endüktif sinyallerin önemini göstermek için gelişen embriyonun dokularında arasına eklenen geçirimsiz bariyerler kullanılan teknikleri geliştirdi. Bizim ilgi bacak tomurcuk akıbet önce hangi etkinliklerin omurgalı ekstremite gelişimi ve özellikle olduğunu. Örneğin, bir bariyer yerleştirilmesi bu karşı, ameliyat edilmemiş tarafta normal olarak devam etmesine izin verirken, civciv embriyo bir tarafında meydana gelen bacak tomurcuk büyümesini engelleyebilir. Bu engeller değişik yapmak için kullanılan maddeler; Örneğin, mika plakaları 1 ve tantal folyo 2. Bu engeller etkin bir Somitlerin gelen ekstremite tomurcuğu formları, paraxial mezodermden oluşan hangi yanal plaka mezoderm (LPM), ayrı. Cerrahi aşılama teknikleri bu yakın ilişki zekâ göstermekbacak tomurcuğu başlatılması LPM 3 4 meydana ise H Somitlerin gereklidir. 80'li ve 90'lı yıllarda gelişimsel biyologlar gelişimsel süreçleri kontrol altına alınmasında gerekli olan sinyal molekülleri yayılabilir keşfetti. Bu sinyal molekülleri ile ıslatılmış Boncuk embriyonun belirli bölgelerde implante ve embriyonik gelişim değişiklikler üretmek olabilir. Bir civciv embriyo içine implante ve rakamlardan 5 ayna görüntüsü çoğaltılması üretebilir Örneğin, iyon değişimi boncuklar tarafından alınan retinoik asit (RA) 24 saatlik bir süre içinde serbest bırakılır. FGF protein içeren heparin akrilik boncuk interlimb LPM 6 uzuv tomurcuk büyümesini başlatabilir.

Daha yakın zamanlarda, fare ve balık genetiği (7 gözden) yeni bir dönemin içine omurgalı bacak başlama çalışma almış. bacak tomurcuk başlamadan önce Somitlerin RA mevcut LP tarafından gerekli olan temel yayılabilir sinyal olduğunu iyi kanıtlar bulunmaktadırM bacak tomurcuklanmayı başlatmak için. Biz ekstremite tomurcuğu başlama sefer LPM gen ifadesi üzerinde bariyer implantasyon etkisini incelemek için civciv embriyo erişilebilirliğini ve deneysel sağlamlık istismar etmek istedim. Bizim yöntemin bir roman uyarlaması bir engel birleştirmek olduğunu bariyer tarafından bloke edilmiş dışsal olarak tedarik aday endojen faktörler bariyer boncuk yerleştirme yanal ile eksenel dokulardan blok sinyaller. Aşağıdaki protokoller ekstremite tomurcuk indüksiyon ve inisiyasyon mekanizmalarını didiklemek için geliştirilmiş olanlardır.

bacak tomurcuk başlatılması incelenmesi erken evre embriyolar kullanarak anlamına gelir. ilk derialtı iğne ile hava kesesi yoluyla albumin bazı kaldırarak birçok araştırmacı pencere tavuk yumurtası. sarısı üstüne yatıyor embriyo, daha sonra yumurta düşük yalan olur. Bu, elektroporasyon gibi teknikler, bir avantaj, ancak embriyo cerrahi manipülasyon isteniyorsa bir dezavantaj olabilir.Mümkün bir avantaj olarak biz yumurta açılışına yakın embriyoya sahip bulmak.

Sorular omurgalı bacak tomurcuk indüksiyon ve başlatılmasını kontrol sinyalleri ile ilgili kalır ve aşağıdaki protokoller onlara hitap etmek uygundur. Biz daha erken bir aşamada 12 8 daha aşamada civciv bacak tomurcuk akıbet önlemek için engellerin yerleştirilmesi için bir protokol geliştirmek için ilk bulunmaktadır. Bu protokollerin değiştirilmiş versiyonları da primordium kaynaklı olmak için erişilebilir bir indükleyici doku bitişik yatıyor kökeni ve endüktif ipuçlarının zamanlaması diğer soruları kullanılabilir. embriyo bölgesi, ilgili bir gelişim aşamasında erişilebilir sunulmuştur, daha sonra bir engel çalışılan iki doku ve gelişme sonucu değişiklikler arasında yerleştirilebilir. Örnekler, karaciğer ya da böbrek indüksiyon beyin gelişimi eksen uzantısı ve muhtemelen organ gelişmesinde bulunabilir.

Protocol

Aşağıdaki protokol inkübasyon daha az on gün tavuk embriyoları kullanılır. Tüm deneyler King College London, İngiltere ve Birleşik Krallık Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun olarak yapıldı.

Embriyo Operasyonu Chick önce 1. Hazırlık Gerekli

  1. Hasat ve civciv embriyolar sabitlemek için, işlemleri için gerekli aşağıdaki cerrahi aletler toplayın: Hayır 5 saatçiler forseps İki çift, güçlü örneğin forseps, tip AA bir çift, 2.5 cm uzunluğunda bıçak ile kavisli makas, künt kavisli sona erdi folyo engelleri (1.6.3) yaparken yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda uçları forseps, hem de 4 numaralı saatçiler forseps iki çift kullanmak için.
  2. Bir çelik pim bir mikro bıçak (karşısında 0,3 mm) yapmak bir bileme taşı yağ kullanarak keskin. binoküler mikroskop kullanarak, düz bir bıçak pimi ucunu keskinleştirmek. Bir iğne tutucu pimi yerleştirin ve çaldı ve den olmaktan keskin ucunu korumakTed.
    NOT: 1000 ul pipet ile bıçağı mantolama Bunun için basit bir seçenektir.
  3. plastik yıkama şişe% 70 etanol hazırlayın. öncesi ve sterilize ve onları temizlemek için kullanımdan sonra cerrahi aletler ve mikro bıçak silmek için kağıt dokusu üzerinde bu bir bücür kullanın.
  4. 5 cm genişliğinde açık yapışkan bant ve uygun bir dağıtıcı satın alın. Bul veya yan bir tavuk yumurtası sabit tutmak için uygun bir dinlenme üretmekteyiz.
  5. Yapmak ve ıslatma boncuk mağaza çözümleri.
    1. 30 ul alikotları -20 ° C'de su ve mağaza ile seyreltilerek 1 mg / ml dondurulmuş stoktan Fibroblast Büyüme faktörü 4 (FGF4) proteinin bir 0.35 mg / ml çözeltisi hazırlayın.
    2. Hazırlama çözeltiler, 5 mg / ml stok koyu mikrosantrifüj tüplerinde dimetil sülfoksit (DMSO) ile seyreltilmiş ve all-trans-retinoik asit (RA) (ya da 0.05 ya da 0.1 mg / ml). stok ve -20 ° C 'de 100 ul alikotları saklayın.
    3. Hazırlama çözeltiler BMS 493 (ya da 2.5 ya da 5 mg / ml) (ters ag10 mg / ml stok koyu mikrosantrifüj tüpleri içinde DMSO ile seyreltildi RARlar bölgesinin onist). stok ve -20 ° C 'de 100 ul alikotları saklayın.
  6. aluminyum folyodan engelleri yapın.
    NOT: engelleri yapmak için kullanılan folyo (0.013 mm kalınlığında olarak mikrometre ile ölçülen) standart ikram folyo olduğunu. Herhangi bir iç alüminyum folyo olasılıkla uygun olacaktır.
    1. alüminyum folyo 1 cm kare parça kesin ve bir doku üzerinde% 70 etanol ile silerek sterilize. 6 cm steril plastik Petri kabı üzerine yerleştirin. Kapağı atın ve folyodan yemek için bir kapak yapmak.
      NOT: Bu daha sonra nedeniyle statik çanak plastik kapakla yapışmasını kesme bariyerleri önleyecektir.
    2. 1.6x ayarlanmış büyütme ile bir binoküler mikroskop altında bir sahne mercek ağı üstünde Petri kabı (1 cm uzunluğunda 100 bölümlere ayrılmıştır) yerleştirin. Bir No.15 bıçak küçük neşter kullanılarak, örneğin, tam bir genişliğe 0.7 mm veya 1.3 mm folyo şeritler kesti.
    3. folyo ayırınNo 4 saatçiler forseps iki çift kullanarak şeritler. Daha sonra özel bir genişliğe sahip bir menteşe benzer şekilde, folyo engel merkezinde dik açılı kıvrım oluşturur.
      Not: bariyer Bu şekil, 10, 9 alınır. Menteşeli bariyer düz, yassı bariyer daha iyi yerde kalır. No 4 forseps görece künt ve onlar folyo engelleri ezikler veya puanlar yapmak için daha az olasıdır, çünkü kullanılır.
    4. çanak karşı bir tarafı düz ve çanak dışına yukarı bakacak bir tarafa kalan kesilmemiş folyoyu hareketli diğer Petri kabı merkezinde engelleri hizaya getirin. ameliyat gününden önce 20 ya da daha fazla engelleri hazırlayın. çanak üzerine folyo kapağı yerleştirin ve rahatsız olmayacak bir yerde engelleri saklayın.
      NOT: Hatta hafif bir vuruş üzerinde engelleri ipucu ya da yemeğin yanlarına statik sopa ile anlamına gelebilir.
  7. 38 ° karton yumurta tepsileri kendi yüzüne döllenmiş tavuk yumurtası inkübeAmeliyat günü zaman önce uygun uzunlukta C embriyolar istenen 8 aşamasında olacak şekilde.

Civciv Embriyolar ve Operasyon gününde Boncuk 2. Hazırlık

  1. 'Pencere' tavuk yumurtası inkübe edildi.
    NOT: yumurta açılması için aşağıdaki yöntem Dennis Summerbell tarafından kabul edildi (yayımlanmamıştır).
    1. Yumurta yan yatarken, Tip AA güçlü forseps iç kabuk zarı bozuldu emin olan yumurtanın künt ucu (hava kesesi sonu) delmek. forseps sıkıca birlikte bu kavrayışa yapmak ve serbest el ile yumurta tutarken kontrollü bir bıçaklama hareketi kullanın.
    2. Hala yatay eksen boyunca 180 ° çevirin ve üst oldu yan yanındaki tepsiye şimdi öyle ki yumurta tepsiye yerleştirin (bir ya da yan) iki eliyle, yan yatarken, yumurta atın.
      NOT: Bu kabuk zarlarının embriyo gevşetir ve embriyo olduğu anlamına gelecektir leembriyo üzerinde kabuk kaldırıldığında ss olasılıkla kesilecek.
    3. yaklaşık 5 cm kare net bir parça bant alın ve yumurta açıldığında embriyo üzerine dağılan gelen yumurta kabuğu durdurmak için yumurta üst yüzeyinde yakından bu sopa.
    4. hava hemen altında yatan embriyo üzerinde yumurta (girebilirsiniz böylece nazikçe kabuk ve yumurta üst kısmının merkezinde kendi membranların kırmaya kavisli makas kullanın, makas bir bıçak ile çok küçük bir delik açın kabuğun üst kısmı).
      NOT: Sadece kabuğu yaklaşık 0.5-1 cm yumurta giren hava kabuğundan embriyo ayıracak ve embriyo sarısı üstüne kalanı gelecek, embriyo kapsayan kabuk zarları kırma ve membranların herhangi kırarak değil By .
    5. yaklaşık olarak 1 sm bir çapı olan bir çevreye kabuk deliği büyütmek için kavisli makas kullanın. Bir ile yumurta delik eksize kabuğun parçası kaldırmak ve kapaknet bant parçası yaklaşık 5 cm kare. kolayca bu bantı çıkarmak için, serbest kalan bandı bırakarak, sadece deliğin dudak de sopa bant basın. ücretsiz bant daha sonra yumurta açmak için kavranabilir.
  2. Sahne embriyolar
    1. 38 ° C ve pencereleme (adım 2.1) (adım 1.7 bakınız) kuluçkadan sonra 8'e göre piliç embriyoları sahneye binoküler mikroskop kullanıyoruz. yumurta pencereleme aşağıdaki mühürlü hemen önce bunu yapın. kabuğu her embriyo aşamasına yazın. inkübatör yumurta dönün.
      Not: 8 ile 15 arasında aşamalarında Embriyolar engelleyici ve kordon deneyler için de uygundur. Embriyolar onlar çok uzun öncesinde operasyon için inkübatör dışına bırakılmış değil eğer hayatta kalmak için daha olasıdır.
  3. Ameliyat öncesi ıslatma boncuklar.
    1. FGF4
      1. 1.000 ul pipet sonuna sopa afinite kromatografisi jel boncukları sayısını (150-300 mikron) alın ve oldumikrosantrifüj tüpü içinde, 1 ml fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) içinde H bunları, bunlar 5 sn. Santrifüj depolanan azid kaldırma PBS atmak ve iki kez işlemi tekrarlamak.
      2. 30 dakika boyunca buz üzerinde, steril bir Petri tabağına 0.35 mg / ml FGF4 proteinin bir 30 ul damla jel boncukları bekletin. embriyonun içine No ile yerleştirilmesi için 5 microforceps çapında yaklaşık 150 mikron boncuk seçin.
        NOT: boncuk kırılgandır ve çok sıkı sıkılmış eğer paramparça çünkü No 5 microforceps ve çok yavaşça kavrama onları aşağıdaki adımlarda kullanılan iyon değişim reçinesi boncuk tutun. Bu uyarı 2.3.2-2.3.3 ve tüm reçine boncuk işlemleri için de geçerlidir.
    2. RA
      1. 0.05 ve 0.1 mg bir kısım defrost / all-trans-RA DMSO ile seyreltildi ve daha önce ışıktan RA korumak için folyo ile kaplanmış olan steril bir Petri kabı (9 cm çapında), bir 100 ul damla yer ml. 10 ul pipet alın ve bazı klorür formu iyon değişimi pick upBunu ucunda reçine boncukları ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında ışıktan korunur RA damla bu bekletin.
      2. en az 1 cm uzağa aynı petri tabağına yerleştirilir Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ul 100 birbirini takip eden üç damla boncuk durulayın.
        NOT: boncuk DMEM fenol kırmızı boya alma. Bu yöntem 5 dayanmaktadır.
      3. boncuk tutmak için Petri kabı ve No.5 microforceps altında bir mikroskop sahne graticule slayt kullanarak embriyonun içine sokulmaya, yaklaşık 100 mikron çapındadır (ıslak boncuk 75-180 mikron boyutu aralığı) boncuk seçin. Petri kabı üzerine 100 ul DMEM damla, boncuk aşağı ilk etapta gelen boncuğu alıp damla dışarı boncuk iterek veya kılcal (sonraki boncuk kapalı forseps koyarak ya ondan kalan DMEM kaldırdığınızda eylem) boncuk uzak sıvıyı çeker.
    3. BMS 493
      1. RA (2.3.2) gelince, iyon DEĞİŞ emmek20 dakika boyunca, oda sıcaklığında, DMSO içinde, BMS 493 ml 2.5 veya 5.0 mg, 100 ul damla / in ange reçine boncukları daha sonra DMEM 100 ul damlalar içinde durulayın. embriyonun içine sokulması için boncuk yaklaşık 100 mikron çapındadır seçin.
    4. DMSO kontrolü
      1. RA (2.3.2) için olduğu gibi, daha sonra DMEM 100 ul damlalar içinde durulayın 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir DMSO 100 ul damla iyon değişim reçine boncuklarını ıslatın. embriyonun içine sokulması için boncuk yaklaşık 100 mikron çapındadır seçin.

3. Bariyer ve Boncuk İşlemleri

Şekil 1
Şekil nerede Engeller ve ya Boncuk Olmalı Gösterilen Farklı Aşamaları Chick Embriyolar 1. Şemalar. Presump de Somitlerin ve LPM arasında (A) Aşama 13 civciv embriyo şematik gösteren bariyer pozisyonu (yeşil hat)tif kanat seviyesi (15-20 Somitlerin). RA boncuk (kırmızı daire) bariyer yerleştirilmeden önce konulmalıdır nereye gösteren (B), (A) aynı şematik. (C) bir sahne 15 embriyo içinde olası bacak seviyesinde (Somitlerin 26-32) de şematik gösteren bariyer pozisyonu (yeşil hat). RA boncuk (kırmızı daire) konulmalıdır nereye gösteren (D) (C) aynı şematik. (E) Şematik BMS 493 boncuk (mor daireler) bir sahne 15 embriyo LPM konulmalıdır nereye göstermektedir. (F) olası kanat düzeyinde presomitic mezoderm ve LPM arasında bariyer konumunu (yeşil hat) gösteren bir sahne 9 civciv embriyo şematik diyagramı. (G) bir bariyer (yeşil hat) ve RA boncuk (kırmızı daire) konumlarını gösteren bir sahne 9 embriyonun şeması. (H) olası bacak seviyesinde bariyer pozisyonu (yeşil hat) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagramı. (I 7 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Bariyer kanat tomurcuk başlamasını önlemek için aşamada 13 eklenir.
    1. inkübatör bir sahne 13 embriyo alın ve 3.2X büyütme ya da tercih edilirse daha yüksek ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin. net bant üst katmanı kaldırın.
      1. Bir çelik mikro bıçak kullanarak, vitellin membran ve embriyonun sağ tarafındaki Somitlerin 15 ila 20 (Şekil 1A) bitişik yan plaka mezoderm (LPM) üzerinden bir kesi yapmak (Somitlerin bu aşamada oluşmuş değil hepsi var). oluşan son dört Somitlerin bitişik kesin ve kaudal kesik iki hücre gruplarının uzunlukları devam ediyor.
      2. No: 5 microfo ile (0,7-1 mm genişliğinde) bariyer Pick upPetri kabı çıkıntılı sonunda rceps ve kesi içine bariyer serbest ucunu eklemek için elini bükün. Menteşe şeklinde engeli Somitlerin için kesi distalinde aşağı doğru çıkıntılı yarısı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor. En kısa sürede şeffaf bir bantla yumurta kadar mühür ve inkübatör geri.
        NOT: Mikro bıçak ve forseps vitellin membran ile temas yapışkan hale gelir. Sonraki çalıştırmaya başlamadan önce% 70 etanol ile onları silin önemlidir. Bu sonraki tüm işlem açıklamaları için geçerlidir ve implantasyonu boncuk için.
      3. bir kordon, bir bariyer ile birlikte eklenir ise; öncelikle, No 5 microforceps içinde boncuk alıp kesi uzak tarafında LPM kesme yüzüne takın ve daha sonra boncuk (Şekil 1B) için kesi proksimal içine bariyer yerleştirin. yumurta Seal ve inkübatör derhal iade edin.
    2. Bariyer bacak tomurcuk başlamasını önlemek için aşamada 15 eklenir.
      Not: TBox 4 transkripsiyon faktörü (Tbx4) ifadesi üzerindeki Bu işlemin sonucu bir örneği, Şekil 2 ve 2E'de gösterilmektedir.
      1. inkübatör bir sahne 15 embriyo alın ve 3.2X büyütme ya da tercih edilirse daha yüksek ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin. net bant üst katmanı kaldırın.
        1. Bir çelik mikro bıçak kullanarak embriyonun sağ tarafındaki Somitlerin 26-32 (Şekil 1C) bitişik vitellin membran ve LPM üzerinden bir kesi yapmak (Somitlerin bu aşamada oluşmuş değil hepsi var). oluşan son iki Somitlerin bitişik kesin ve kaudal kesik beş somite uzunlukları devam ediyor.
        2. bir ucunda No 5 mikroforcepslerle bariyer (1.2-1.3 mm genişliğinde) Pick up ve kesi içine serbest ucu eklemek için bariyer bükün. En kısa sürede net bant a ile yumurta kadar mühürnd inkübatör iade.
          NOT: bariyer şeklindeki menteşe bunun yarısı Somitlerin için kesi distalinde aşağı doğru çıkıntılı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor.
        3. Bir boncuk bir bariyer ile birlikte eklenecek ise, öncelikle, No 5 microforceps içinde boncuk alıp kesi uzak tarafında LPM kesme yüzüne takın ve daha sonra kesi proksimal içine bariyer yerleştirin boncuk (Şekil 1D). yumurta Seal ve inkübatör derhal iade edin.
        4. Bir boncuk veya boncuk, bir engel olmadan eklenecek ise, örneğin, sahnede 15 bacak bölgeye BMS 493 boncuk, uzun bir kesi (3.2.2.1) yapmazlar. Vitellin zarından ve boncuk yerleştirileceği konumunda LPM içine küçük bir kesi yapmak. No 5 microforceps içinde boncuk alın ve LPM deliğe takın. Forseps (Şekil 1E) kapalı uçları biraz daha itin.
      2. Bariyer kanat tomurcuk indüksiyon ve başlamasını önlemek için aşamada 9 eklenir.
        1. Bir sahne 8 veya inkübatör 9 embriyo alın ve tercih Eğer 3.2X büyütme veya daha yüksek olarak ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin.
          1. Bir çelik mikro bıçak kullanarak vitellin zarından bir kesi yapmak ve LPM Somitlerin doğrultusunda embriyonun kaudal ucunda, ilkel çizgi yanal ve rostral (Şekil 1F) yaklaşık 5 hücre gruplarının uzun uzunlukları.
          2. Petri kabı çıkıntılı sonunda No. 5 mikroforcepslerle bariyer (0,7-1 mm genişliğinde) Pick up ve kesi içine bariyer serbest ucunu eklemek için elini bükün. En kısa sürede şeffaf bir bantla yumurta kadar mühür ve inkübatör geri.
            NOT: bariyer şeklindeki menteşe yarısı kesiden aşağıya çıkıntılı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor.
          3. bir kordon inserte olması isteniyorsabir engel ile bağlantılı olarak D; öncelikle, No 5 microforceps içinde boncuk alıp kesi uzak tarafında LPM kesme yüzüne takın ve daha sonra boncuk (Şekil 1G) için kesi proksimal içine bariyer yerleştirin. yumurta Seal ve inkübatör derhal iade edin.
      3. Bariyer bacak tomurcuk indüksiyon ve başlamasını önlemek için aşamada 10 eklenir.
        NOT: Tbx4 ifadesi üzerindeki Bu işlemin sonucu bir örneği Şekil 2G'de gösterilmektedir.
        1. inkübatör bir sahne 10 embriyo alın ve 3.2X büyütme ya da tercih edilirse daha yüksek ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin.
          1. Somitlerin doğrultusunda embriyonun kaudal ucunda, bir çelik mikro bıçak ilkel çizgi lateral vitellin membran ve LPM üzerinden bir kesi yapmak kullanarak (Şekil 1H) yaklaşık 6 hücre gruplarının uzun uzunlukları.
          2. (1.2 bariyer Pick upmm petri çıkıntılı sonunda No. 5 mikroforcepslerle) genişliğinde ve eli bükmek kesi içine bariyer serbest ucunu eklemek için. En kısa sürede şeffaf bir bantla yumurta kadar mühür ve inkübatör geri.
            NOT: bariyer şeklindeki menteşe yarısı kesiden aşağıya çıkıntılı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor.
          3. Bir boncuk, bir engel olmadan eklenir ise, örneğin, aşama 10 bacak bölgesine BMS 493 boncuk, Vitellin membrandan ve boncuk yerleştirileceği konumunda LPM küçük bir kesi yapmak. No 5 microforceps içinde boncuk alın ve LPM deliğe takın. Forseps (Şekil 1I) kapalı uçları biraz daha itin.
      4. Gelişmekte olan kontralateral kol tomurcuk ile karşılaştırıldığında bariyerin pozisyonunu kontrol çalıştıktan sonra 24 saat ya da daha fazla. Bariyer açık oppos olmayan her hangi bir embriyolar atınSol bacak tomurcuk ite. Bu durumda bariyer yanlış konumlandırılmıştır.

      İn Situ Hibridizasyon Wholemount 4. Hasat Embriyolar, Fiksasyon ve Hazırlama (DİLERİZ)

      1. Hasat embriyolar operasyonu sonrası.
        1. aşamada 19-23 Hasat embriyolar uzuv tomurcuk morfolojisi açıkça hem işletilen ve kontralateral kontrol tarafı görünür şekilde.
          1. Kullanarak kavisli makas kabuğu daha büyük bir delik kesti. mikroforcepslerle embriyonun soluna büyük kan damarı tutarken embriyo etrafında kesti. embriyo kaldırmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.3 bir Petri tabağına yerleştirin, bu tekne kavrama kullanın.
          2. binoküler mikroskop altında, hayır ve kavisli makas bir arada kullanarak ekstra embriyonik damarları ve membranlar uzak teşrih. 5 microforceps. makas kullanılarak kafasını çıkarın.
      2. Embriyoların Fiksasyon hasat sonrası.
        1. Kavisli blun kullanarakt forseps, embriyo asansör ve iki saatte bir, bir vidalı kapak ile daha sonra 4 ° C'de bir gece boyunca 20 ml'lik bir cam şişeye, sallanma ve oda sıcaklığında PBS içinde 5 ml% 4 paraformaldehit (PFA) yerleştirin.
          Dikkat: PFA sağlığı için ciddi bir tehlike olduğunu. Bu zararlı, aşındırıcı tahriş edicidir ve toz Cilt, göz ve akciğerlere ile temas önlenmelidir. çözüm hazırlarken kişisel koruyucu giysiler ve davlumbaz kullanın. Bir 4% çözüm, eldiven, koruyucu gözlük ve bir laboratuvar önlüğü sonra giyilmelidir.
          NOT: Bu hızlı bir şekilde en iyi düzeltme içine embriyolar elde mRNA bütünlüğünü korumak için çok önemlidir.
      3. In situ hibridizasyon Wholemount önce engellerin kaldırılması.
        NOT: keskindir ve in situ hibridizasyon protokolünde geçmesi gibi embriyolar zarar verebilir, çünkü Engeller birkaç embriyolar tek seferde lekeli, özellikle kaldırılır.
        1. fiksasyon ardından, binoküler mi altında PBS bir tabak embriyo yerleştirincroscope.
        2. No: 5 microforceps iki çift kullanarak, embriyonun ameliyat tarafında yakından bariyerin iki tarafında sol çifti yerleştirin. Sağ çifti ile bariyer tutun ve yavaşça embriyo tutmak için ve kaldırılır olarak bariyer yapışmasını herhangi bir doku önlemek için sol çiftini kullanarak embriyodan bariyer çekin.
      4. 11 de tarif edildiği gibi esas itibarıyla dileği ediniz.

Representative Results

Yukarıda detaylı bir protokol Nishimoto ve arkadaşları kullanılan yöntemleri tarif eder. 2015 kağıt ön ve civciv embriyo hindlimb hem de bacak tomurcuk indüksiyon ve başlatılması inceler. Ön ayakları tomurcuk akıbet önlemek için geçirimsiz engellerin yerleştirilmesi aşağıdaki sonuçlar önceden 1, 2, 9 yayınlanmış ancak bacak tomurcuk başlatılması 1 önlenmesi sadece bir çalışma açıklayan engeller olmuştur. Nishimoto ve ark arka bacak verileri. 2015 bariyer yerleştirme aşağıdaki mRNA ifadesinin çalışmanın temsilcisi sonuçları burada sunulmuştur.

LPM içinde Tbx4 İfade Arka ayağın akıbet başlatın için yeterli değildir:
Şekiller 2B ve C (Tablo 2) aşama 15 (Şekil 2A) o bariyer yerleştirilmesini gösteren iki FGF10 yol açar (protokol 3.2)ve FGF8 ifade işletilen sağ tarafta (braket ile gösterilen) bacak tomurcuk bölgede yok olma. Opere sol tarafı ile karşılaştırın. Ancak, Tbx4 ifade işletilen tarafında (Şekil 2B ve E) hem sahnede 19 ve evre 23'te görülmektedir. Biz yalnız Tbx4 ifade LPM hindlimb akıbet başlatmak için yeterli değildir sonucuna varıldı. Civciv diğer çalışmalar TBX gen ön ayakları tomurcuk oluşumu 12, 13 başlatmak için yeterli olduğunu ileri sürmüşlerdir.

Şekil 2C 'bir engel embriyo sonrası fiksasyon bacak bölgesinde ankastre görünüyor nasıl göstermek için dahil edilmiştir. Vakalar engellerin çoğunda önceden in situ hibridizasyon (protokol 4.3) 'de çıkarıldı.

Somitlerin RA FGF10 İndükler Ekstremite Bud O önce LPM içinde Essentialutgrowth:
Şekil 3A, 15 sahne (protokol 3.2.1.3) eklenen bir bariyere RA batırılmış kordon distal eklenmesini temsil eden bir şemadır. (Bir yıldız işareti ile belirtilmiştir) bu işlem bacak tomurcuk büyümesinin da kontrol sol tarafında olduğu gibi tomurcuk olarak ifade edilmiştir ameliyat sağ tarafta Tbx4, FGF10 ve FGF8 gözlenmektedir takiben (Şekil 3B, C ve D, Tablo 2) . Böylece LPM için RA eklenmesi bariyer ve bacak tomurcuğu başlatılması ilerledikçe etkisini ortadan kaldırır. Biz ekstremite tomurcuk akıbet başlatılabilir önce Somitlerin normal gelişim RA'da LPM gerekli olduğu sonucuna varıldı. Ortaya çıkan hindlimb tomurcukları kontrol tarafında olanlar genellikle daha küçüktür. Bu LPM yabani tip duruma denk olmama RA dozuna bağlı olabilir. RA dozu çok yüksek ise Apikal Ektodermal Ridge (AER) kısaltılabilir ve küçük tomurcukları neden olur14, 15.

LPM içinde (Somitlerin itibaren) o RA doğrulamak için normal bir uzuv tomurcuk başlatılması RAR, BMS 493 ters agonist için gereklidir, kullanılmıştır. Boncuk aşamada 15 bacak bölge LPM implante edilir (Şekil 3E) (protokol 3.2.1.4 bakınız). FGF10 ifade kontrol tarafı (; Tablo 3 Şekil 3F) ile karşılaştırıldığında daha küçük hindlimb tomurcukları sonuçlanan 493 boncuk LPM içinde BMS aşağıdaki uygulama downregüle olmaktadır. Kontrol DMSO boncuklar bu hataları (; Tablo 3 Şekil 3G ve 3H) neden olmaz. BMS 493 Uygulamayı takip eden gözlenen kusurlar bir engel operasyonu ile uyarılan daha hafif olan; yani FGF10 hala ifade edilir ve bacak tomurcukları oluşur. BMS 493 etkileri boncuk etrafında yerel sınırlıdır ve axi tarafından üretilen tüm RA antagonize mümkün olmayabilir, çünkü bu olması muhtemeldirark dokular.

Erken Eksenel Sinyaller sonra Tbx4 Express LPM Hücreleri belirtin:
LPM muhtemel bacak oluşturan bölgede Tbx4 ifade kabiliyetini kazanır Biz test ettik. bir engel daha sonra bacak tomurcuk akıbet bloke edeceği eklenebilir en erken evre, sahnede daha erken aşamalarında paraxial mezoderm ve olası bacak arasına yerleştirilen 12. Engelleri engelleri eklemek için bir protokol geliştirmek için ilk olan aşama 10'dur aşama 10'da LPM aşamasında 10 eksenel dokulardan gelen bir sinyal daha sonra ekspresyon için gerekli olduğunu göstermektedir, blok bacak tomurcuk oluşumu ve bacak oluşturucu LPM bölgesindeki Tbx4 ekspresyonunu (Şekiller 2F ve 2G, Tablo 2) (protokol 3.4) hindlimb LPM içinde Tbx4. Daha sonra bariyer yerleştirme Tbx4 ifade veriyor Şekil 2D ve E bu sonuç karşılaştırkurulacak. Ayrıca, biz bu eksen sinyali RAR ters agonist Tbx4 ifadesini azaltır olmadığını gözlemleyerek RA olup olamayacağını test ettik. Evre 10 (protokol 3.4.1.3 bakınız) hindlimb LPM yerleştirilen bir BMS 493 boncuk DMSO batırılmış kontrol boncuklar Tbx4 ifade (Şekil 2J ve 2K) etkilemez oysa, Tbx4 ifadesini (Şekil 2H ve 2I) downregüle. Birlikte, bu sonuçlar eksenel dokulardan RA sinyali olumlu hindlimb LPM 7 Tbx4 düzenleyerek uzuv indüksiyon düzenleyen bir model destekler.

Post-operatif Ölüm:
Tablo 1, 2 ve 3 ameliyat sonrası ve hasat önce ölen civciv embriyo sayısı da dahil olmak üzere deneysel sonuçların ayrıntılı bilgi veriniz. Bazı ölümler bu tür mikrocerrahi sonra beklenemez. sayılar ölen tutulabilir araçlar temiz olduğundan emin yaparak asgariye, yumurta delik embriyolar bu son nokta operasyonu ile birlikte, asgari süre için yapışkan bant mühür koruması olmadan sol ve olduğunu, minimum boyutu gerekli olan mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde gerçekleştirilir. Bu operasyonların hiçbiri çok zaman alıcı ama boncuk ve engellerin ilgili işlemler biraz daha zaman alabilir vardır. Bu önlemlere rağmen, operasyon erken bir evrede de gerçekleştirilebilir ve kanat bölgesinde, bu ölümüne neden olması muhtemeldir. ölüm nedeniyle kan kaybına yol açabilir bacak oluşturan bölgeler ve bu gemilerin kazayla rüptürü etrafında büyük kan damarları vardır. Biz yumurta olan embriyolar ameliyat değil, sık sık ertesi gün ölecek evre 8 ya da 9, açılan bulabilirsiniz. Bu nedenle, bu sorunlar tek çözüm deneyler yüksek dizi deneyi gerçekleştirmek üzere olan.

d / 54618 / 54618fig2.jpg "/>
Muhtemel Bacak Düzeyde Bariyer veya Boncuk Ekleme aşağıdaki Şekil 2. Marker Gen İfadesi değişiklikler. (A) aşama 15 embriyoda olası bacak seviyesi (Somitlerin 26-32) de şematik gösteren bariyer pozisyonu (yeşil hat). (B - E ve G) işletilen embriyolar üzerinde DİLERİZ analizi. Bacak bölgesi (parantez) belirtilmiştir. (B) FGF10 ifade işletilen LPM eksik olan, fakat sağlam bir sentezleme sol tomurcuk tespit edilir. (C) FGF8 ifadesi hiçbir AER olduğunu düşündüren, ameliyat tarafı yoktur. (C ') bir bariyer çıkarılmadan önce, aynı embriyosu. (D) Tbx4 kontrol tomurcuk aynı Rostro-kaudal düzeyde LPM olarak ifade edilir. (E) Tbx4 ifade ekstremite büyüme olmamasına rağmen sağ bacak bölgesinde tutulur. (F) bir sahnenin şematik varsayımsal bacak seviyesinde bariyer pozisyonu (yeşil hat) gösteren 10 civciv embriyosu. (G) Tbx4 ifade işletilen sağ LPM (braket) 'de yoktur. (H) olası bacak seviyesinde BMS 493 boncuk pozisyonu (mor daire) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagramı. (I) Tbx4 ifade BMS 493. (J) kontrol DMSO boncuk pozisyonu (gri daire) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagram ile tedaviyi takiben ameliyat sağ tarafında downregüle olmaktadır. (K) Tbx4, tek başına DMSO ile işleme tabi kontrolü sol tarafının edilene benzer bir düzeyde çalışan yandaki ifade edilir. Bu şekil 7 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

d / 54618 / 54618fig3.jpg "/>
Şekil 3. RA kurtarır Ekstremite Bud'un Devamsızlık Bariyer Ekleme Yarattığı ve Bacak Bud kıbet öncesinde LPM Essential olduğunu. (A) olası bacak seviyesinde (Somitlerin 26-32) ve RA-batırılmış boncuk (kırmızı daire) bariyer konumunu (yeşil hat) gösteren şematik diyagram. (B - D) (bir yıldızla gösterilir) RA kurtarır bacak tomurcuk sonucudur. (B) Tbx4 ifade un çalışan tarafına benzer kurtarıldı bacak tomurcuk halinde mevcuttur. (C) FGF10 kurtarıldı bacak un çalışan tarafına benzer tomurcuğun ifade edilir. (D) FGF8 kurtarıldı sağ bacak tomurcuk AER olarak ifade edilir. BMS 493 boncuk (mor halkalar) evre 15 embriyo olası bacak LPM yerleştirildi nerede (E) şematik göstermektedir. (F) FGF10 ifade çalışan sağ tarafta downregüle ve bacak tomurcuk küçük aşağıdaki BMS 49 mesafesindedir3 tedavi. Boncuk üst yıldızlı vardır. Kontrol DMSO boncuklar (gri daireler) konumunu gösteren (E) ila (G) 'dekine benzer şematik. (Yıldız ile gösterilen) (H) DMSO boncuk FGF10 ifade ya da bacak tomurcuk büyüklüğü etkilemedi. Bu şekil 7 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sahne bariyer yerleştirilmiş (+ boncuk) * sayı işletilen Kanat eksik ** Kanat mevcut ** sayı ölü
Aşama 12-14 40 24 1 15
Aşama 8/9 65 23 0 42
Aşama 12-13 (FGF4 boncuk) 41 7 (boncuk eksik) 17 17
Aşama 12-13 (RA boncuk) 75 9 (boncuk eksik) 32 34
Aşama 13 (kontrol boncuk) 5 3 0 2
* Somitlerin 15-20 ve yan plaka mezoderm arasına yerleştirilen 0,7-1 mm folyo engelleri. 0.35 mg / ml FGF4 kordon. 0.05-0.1 mg / ml RA kordon.
DMSO kontrolü kordon.
** Chick embriyolar sabit aşamaları 21-23

Tablo 1. Kanat Seviye Bariyer ve Boncuk Deney Sonuçları.

Sahne bariyer yerleştirilmiş (+ boncuk) * sayı işletilen Bacak eksik ** Bacak mevcut ** sayı ölü
Aşama 12-15 43 39 0 4
Aşama 10/11 23 16 0 7
Aşama 15 (FGF4 boncuk) 8 0 5 3
Aşama 15 (RA boncuk) 18 0 18 0
* Somitlerin 26-32 ve yan plaka mezoderm arasına yerleştirilen 0,7-1,3 mm folyo engelleri. 0.35 mg / ml FGF4 kordon. 0.05-0.1 mg / ml RA kordon.
** Chick embriyolar sabit aşamaları 18-24

Tablo 2. Bacak Seviye Bariyer ve Boncuk Deney Sonuçları.

sayı işletilen Bacak küçük tomurcuk Bacak biraz küçük tomurcuk Bacak tomurcuk normal boyut sayı ölü
BMS 493 boncuk *
15 12 3 0 0
DMSO boncuklar **
12 0 3 9 0
* 5 mg batırılmış 2-3 boncuk / ml BMS 493 bacak seviyesinde doğru aşama 14-15 LPM yerleştirilir.
DMSO batırılmış ** 2-3 boncuk yalnız bacak seviyesinde doğru aşama 15 LPM yerleştirilir.
Civciv embriyolar aşamalarında sabit 17-19.

Tablo 3. Ayak Seviye BMS 493 Boncuk Deney Sonuçları.

Discussion

Biz civciv embriyo ekstremite tomurcuğu oluşumunu önlemek için geçirimsiz engellerin kullanımını tanımlamak. Bu teknik, kritik adımlar bir numarası vardır. Ön deneyler ardından, 9 kullanılan menteşe şeklinde bariyerler, 10 düz engelleri çok daha iyi embriyo yerinde olduğunu ortaya koydu. Bariyerin uzak düz tarafı vitellin membran yapışır ve yeri (Şekil 2C ')' de bariyer tutar. protokolün adım 1.6 de tarif edildiği gibi alüminyum folyo menteşe şeklinde engeller dikkatli hazırlanması işleminin başarısı için çok önemlidir. İkinci önemli adım yumurta çok uzun pencereleme takip ve embriyo üzerinde faaliyet öncesinde evreleme için inkübatör dışına bırakılmış değil emin olmaktır. Bizim tecrübelerimize göre, embriyolar operasyon gerçekleştirildiği zaman onlar veya inkübasyon sıcaklığında yakınında ise bir operasyon daha iyi hayatta. Operasyon bu nedenle mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır ve yumurta istemi resealedly iyi sağkalım oranlarını sağlamak. Birçok araştırmacı inkübatör yumurta dönmeden önce mikrocerrahi aşağıdaki embriyoya antibiyotik bir damla ekleyin. sıvının mevcudiyeti pozisyonda de yapışmasını engeller engelledi. antibiyotik eklenmesi de yerleştirilmesinden sonra boncuk yerinden olabilir. Bu nedenle antibiyotik, hızlı operasyonlar ve aletleri ile iyi temizlik kullanmayan enfeksiyonu önlemek için tavsiye edilir. Bir işlemin her aşamasında, aşağıdaki% 70 etanol ile aletleri silme (protokol adım 3.1.2.2 bakınız) engeller veya boncuklar iki forseps bağlı neden olabilir Vitellin membran ile temas yapışkan hale gelen araçlar bilmek esastır. kullanılan boncuk Her iki çeşit operasyondan sonra yersiz düşebilir. bariyer pozisyonu ertesi gün kontrol edildi zaman boncuk yerinde ya da değil kalan olup olmadığını tespit etmek için bariyerini görmek mümkün değildi. boncuk düşmüştü durumlarda kanat tomurcuk akıbet kurtarıldı değildi (

Bu protokol, uzuv tomurcuk başlamasını önlemek için engelleri kullanılan daha önce yayınlanan deneyleri değiştirir bariyerleri özel optimum genişlikleri tanımlar ve gen ekspresyon analizi takiben birleştirerek bariyer ve boncuk yerleştirme tanıttı. Biz ucuz ve tüm laboratuvarlarda hazır olan klasik alüminyum folyo kullanarak bulundu, daha önce tantal folyo kullanılan olanlar eşit sonuçlar üretir. Folyo in situ hibridizasyon (Şekil 2C ')' de yerine getirirken embriyoda yaptı ama birden fazla embriyo embriyolar zarar folyo keskin kenarları önlemek için işleniyor eğer biz genellikle kaldırmak olabilir. Pilot çalışmalar, bacak bölgesi engellerin genişliği özellikle önemli olduğunu göstermiştir. Başlangıçta trialed bariyerler çok kısa ve bacak tomurcuk akıbet engelledi değildi. 1.2-1.3 mm tamamen bacak tomurcuk akıbet engellemek için bir bariyer için optimum genişlik olduğunu. bir doğru yerleştirebilirsiniz dar kanat engelleri tomurcuk akıbet iyi sağkalım oranlarını vermek önlemek için. Bu 0.5-0.7 mm kadar dar olabilir. Ancak, biraz daha geniş olan engelleri (biz 0,7-1 mm kullanılır) onlar yerleştirme küçük bir yanlışlık izin çünkü kanat tomurcuk akıbet tam engellenmesine yol açar olasılığı daha yüksektir. kan damarlarının kaçınma zaman kesi yaparak kanat tomurcuk seviyesi engelleri için kritik öneme sahiptir. Yarı geçirgen bariyerler önce civciv bacak tomurcuk iki eşit parçaya böler için kullanılmıştır. MacCabe ve Parker, 1976 ve Summerbell, 1979 hem kullanılan filtreler sırasıyla 0.45 mikron ve 0,8 mikron gözenek boyutu, 16, 17. Onlar yayılabilir sinyaller filtreleri ve gözenekler yoluyla geçebileceği bildirildiSonuçlar yarı geçirgen bariyerler geçirimsiz bir tantal folyo bariyer ile hiçbir mevcut bariyer ve biriyle bacak tomurcuk arasındaki orta idi kullanılarak kazandı. Bu protokol, boyutu veya sinyal yayılma dinamiklerini değiştirme göre aday sinyalleri ayırt etmek için farklı gözenek büyüklüğü yarı geçirgen bariyerler kullanmak üzere adapte edilebilir.

Bu protokol esas model organizma kendisi ile ilişkili çeşitli sınırlamalar vardır. Bu tür teknikler uzuv gelişiminde başka sorular ve aynı zamanda omurgalı embriyogenez diğer soruları araştırmak için kullanılabilir. Bir şartı civciv embriyo müdahale için erişilebilir olduğu zaman, söz konusu organı / alan geliştirme gerektiğidir. Bir bariyer yerleştirilmesi gereken bölgede büyük kan damarlarının varlığı bariyer yerleştirme sonraki aşamada 13 veya teknik açıdan zorlayıcı 14 daha yapar. büyük kan damarları bariyer yerleştirme sırasında kesilir ise bu embriyo mortaliteye neden olabilir. Transkripsiyon T faktörleri zaman bizim soruşturmaBX5 ve Tbx4 ilk LPM indüklenen daha sonra sırasıyla karşıt ya kanat veya bacak tomurcuk sona ereceğini bir bariyer koyabilirsiniz en erken aşamada sınırlı kalmıştır. Gastrulasyon yakın daha erken aşamaları ile TBX gen indüksiyonunu bloke girişimi aydınlatıcı olabilir. erken bir engel olası kanat bölgesinde yer olabilir başarıyla sahne 8 ve daha sonraki hızlı büyüme bariyer ve sonuçları yerinden çünkü bacak bölgesi aşamasında 10'da Bu protokol muhtemelen bacak tomurcuk aşamalarında ötesinde gen ifadesinin çalışma için uygun değildir sadece bir engel oluşturma başlangıç ​​konumuna geçirilmesi ile ilgilidir.

Bu bağlamda civciv embriyo sınırlamaları ile ilgili olması, diğer omurgalı model organizmalar üzerinde avantajları çoktur. civciv embriyo omurgalı bir embriyo fiziksel müdahale bu tür için çok uygun bir hayvan modeli. Embriyolar, nispeten büyük ve Throu kolayca erişilebiliryumurta kabuğu gh. Bir başka deney için embriyo dönebilirsiniz (örneğin, bir boncuk 18 ya da bir bariyer çıkarılması) veya basitçe bant pencere kaldırarak gidişatını kontrol etmek için. Canlı görüntüleme veya zaman atlamalı görüntüleme dahil etmek mümkün kapsamı vardır. Biz özellikle erken evre embriyolar üzerinde çalışan için uygundur tavuk yumurtası Pencereleme bir yöntem açıklanmaktadır. ekstremite çalışmaları durumda her bir biyolojik deney için ideal bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir her deney için bir kontralateral kontrol uzuv olduğunu çok önemli ve yararlı olduğunu.

sinyal moleküllerinin batırılmış uzuv akıbet ve boncuk önlemek için geçirimsiz bariyerler kullanarak kombinasyonu daha önce rapor edilmemiştir. Bu tür müdahaleleri aşağıdaki mRNA Bizim analizi de romandır. Bu teknikler uzuv özel transkripsiyon Tbx5 ve Tbx4 de LPM uyarılan ve olan faktörleri ne zaman zor bir problemi incelemek için etkinDaha sonra, önceden tomurcuğu başlatılması uzuv olduğunu göstermek için, LPM bu tbx genlerin varlığı FGF10 transkripsiyon aktivasyonu ve bacak tomurcuk büyümesinin başlaması için yeterli değildir. 2G, 2D ve 2E iyi bu bulguları olarak göstermektedir. Şekil 2G aşamasında 10 bir bariyer sokulması şu Tbx4 ifade olmaması Tbx4 indüksiyonundan sonra, aşama 15 bariyer yerleştirilmesi, aşağıdaki 2D ve 2E varlığını taban tabana zıttır. RA batırılmış boncuklar implantasyon bariyer yerleştirilmesi ve bacak tomurcuk akıbet başlamadan önce LPM gerekli olan Somitlerin gelen RA kadar puan aşağıdaki ekstremite tomurcuğu başlatılması kurtarılmasını kolaylaştırdı. Bu tür teknikler uzuv gelişiminde başka sorular değil, aynı zamanda omurgalı embriyogenez diğer soruları çözmek için kullanılabilir. beyin, göz ve gövde alanları uygun olması muhtemeldir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11241-30
Dumont strong forceps, type AA Fine Science Tools  www.finescience.de 11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long Fine Science Tools  www.finescience.de 14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long Fine Science Tools www.finescience.de 11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide Fine Science Tools  www.finescience.de 26002-20
Sharpening stone, square Fine Science Tools  www.finescience.de 29008-01
Mineral oil
Needle holder Fine Science Tools  www.finescience.de 26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m www.5staroffice.com 295985
FGF4 protein A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid Sigma www.sigmaaldrich.com R2625-50MG Remember to protect from light.
BMS 493 Sigma www.sigmaaldrich.com B6688-5MG
Scalpel blade No. 15 www.swann-morton.com cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel Bio-Rad www.bio-rad.com 153-7301 Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin Bio-Rad www.bio-rad.com 140-1251 Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs Memmert www.hce-uk.com LAB128
Paraformaldehyde (PFA) Sigma www.sigmaaldrich.com P6148-1KG Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol Sigma www.sigmaaldrich.com 32221-2.5L
DMEM, high glucose Gibco www.thermofisher.com 41965-039 500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific webshop.fishersci.com D/4121/PB08 500 ml
Binocular Microscope  Leica www.leica-microsystems.com MZ6 Replaced by M60
Chicken eggs Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com Brown Eggs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62, (1), 80-103 (1965).
  2. Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126, (2), 127-149 (1969).
  3. Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268, (26), 3183-3186 (1969).
  4. Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23, (1), 109-151 (1970).
  5. Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142, (2), 542-555 (1984).
  6. Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80, (5), 739-746 (1995).
  7. Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12, (5), 879-891 (2015).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, (1), 49-92 (1951).
  9. Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
  10. Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27, (2), 159-167 (1983).
  11. Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, (7), 1401-1416 (1993).
  12. Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129, (22), 5161-5170 (2002).
  13. Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130, (12), 2729-2739 (2003).
  14. Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
  15. Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106, (4), 691-705 (1989).
  16. MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54, (2), 297-303 (1976).
  17. Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
  18. Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100, (4), 723-733 (1987).
Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).More

Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter