Abstract
병아리 배아은 직접 방식으로 개발 질문을 해부하는 데 사용할 수있는 최상의 척추 동물 모델을 제공합니다. 수술 적 치료 다음의 접근성과 안정성이 중요한 실험의 강점이다. 운모 판 병아리 사지 싹 개시 한 것을 방지하기 위해 사용되는 제 장벽이었다. 날개 꽃 봉오리 또는 다리 꽃 봉오리 유도 또는 개시에 불 투과성 장벽으로 알루미늄 호일을 사용하여 프로토콜 설명한다. 우리는 장벽에 의해 차단 된 공급 후보 내생 적 요인을 외생하는 장벽에 비드 배치 측면과이 기술을 결합합니다. 결과는 다음 유전자 발현 원위치 혼성화에 사용하여 분석된다. 우리의 주요 초점은 유도에서 레티노 산 신호와 병아리 배아 앞과 뒷다리 이후 개시의 역할이다. 우리는 BMS (493) 사용 (레티노 산 수용체의 역작용을 (RAR)) 측면 판 중배엽 (LPM) 이식 불린 비드 바의 영향을 모방rier somites (레티노 산의 소스 (RA)) 및 사지 싹이 자라는에서 LPM 사이에 위치. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 유도 큐의 기원 및 다른 시점에 질문을 해결하기 위해 사용될 수있다. 병아리 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장의 유도로, 현상 뇌 축 확장 및 개발 기관에서 발견 될 수있다.
Introduction
고전 발생 학자들은 전통적으로 배아 발달을 조절하는 메커니즘을 심문하는 물리적 인 기술을 사용. 1960 년대와 1970 년대 연구자들은 배아 동안 유도 신호의 중요성을 보여주기 위해 개발 배아의 조직 사이에 삽입 불 투과성 장벽을 사용하는 기술을 개발했다. 우리의 관심은 사지 꽃 봉오리 가지를 앞에 어떤 이벤트 척추 사지 개발에 특히입니다. 예를 들어, 배리어 삽입는 반대측, 작동이되지 않는 측에서 정상적으로 진행시키면서 병아리 배아의 한쪽에 발생하는 사지 싹 생장을 방지 할 수있다. 이러한 장벽을 변화하기 위해 사용 재료; 예를 들어, 운모 판 (1) 및 탄탈륨 호일이. 이 장벽은 효과적으로 somites에서 사지 꽃 봉오리 형태, 근축 중배엽에서 형성되는 측면 판 중배엽 (LPM)를 분리합니다. 외과 이식 기술은 가까운 관계 위트를 보여사지 꽃 봉오리 개시가 LPM 3 사에서 발생하는 경우 시간이 somites이 필수적이다. 80 년대와 90 년대에 발달 생물 학자들은 발달 과정을 조절하는 필수적인 신호 분자 확산을 발견했다. 이러한 신호 전달 분자와 적신 비즈는 배아의 특정 지역에 이식 및 배아 발달에 변화를 생성 할 수 있습니다. 병아리 배아 주입 및 숫자 5의 거울상 중복을 생성 할 때, 예를 들어, 이온 교환 비드 차지하는 레티노 산 (RA)가 24 시간에 걸쳐 방출된다. FGF 단백질을 함유 헤파린 아크릴 구슬은 interlimb의 LPM 6에서 사지 꽃 봉오리 가지를 시작할 수 있습니다.
최근에 마우스와 물고기 유전학 (7 검토) 새로운 시대로 척추 사지 개시의 연구를 수행하고있다. 사지 싹 개시 전의 somites에서 RA 존재는 LP에 필요한 필수적인 확산 신호 인 것이 좋은 증거가있다M은 사지 신진를 시작합니다. 우리는 사지 꽃 봉오리 개시시 주변의 LPM에서 유전자 발현에 장벽 주입의 효과를 해부하는 병아리 배아의 접근성과 실험 견고성을 악용하고 싶었다. 우리의 방법의 새로운 적응은 장벽을 결합하는 것입니다 장벽에 의해 차단 된 외생 적 공급 후보 내생 적 요인 장벽에 비드 배치 측면과 축 조직에서 블록 신호. 다음 프로토콜은 사지 봉오리 유도 및 개시의 메커니즘을 애타게하기 위해 개발 된 것들이다.
사지 꽃 봉오리 개시를 공부하는 것은 초기 단계의 배아를 사용하는 것을 의미한다. 먼저 피하 주사 바늘로 공기 주머니를 통해 알부민의 일부를 제거하여 많은 연구자 창 닭고기 달걀. 노른자의 상단에 놓여 배아는 다음 계란에 낮은 거짓말을합니다. 이는 전기 일부 기술에 대한 장점이지만, 배아 수술 조작을 원하는 경우 단점이 될 수있다.가능이 장점으로 우리는 계란의 구멍에 가까운 배아를 갖는 찾을 수 있습니다.
질문은 척추 동물의 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 제어하는 신호에 대한 남아 다음과 같은 프로토콜은이를 해결하기 적합하다. 우리는 초기 단계 (12) (8)보다 단계에서 병아리 다리 버드 파생물을 방지하기 위해 장벽의 삽입을위한 프로토콜을 개발하는 첫 번째입니다. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 primordium가 유도되는에 접근 유도부 조직이 인접한 자리하고있는 곳 기원과 유도 단서의 타이밍에 다른 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 다음 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장 유도 뇌 발달 축 확장 가능성이 장기 개발에서 발견 될 수있다.
Protocol
다음 프로토콜은 배양 미만 십일에 닭 배아를 사용합니다. 모든 실험은 킹스 칼리지 런던, 영국, 영국 홈 오피스 동물 관리 지침에 따라 수행되었다.
배아 조작을 병아리에 앞서 1. 준비 필수
- 수확과 병아리 배아 고정, 작업에 필요한 다음과 같은 수술 도구를 수집 : 5 호 워치 포셉 두 쌍의 강력한 예를 들어, 집게, 형 AA의 한 쌍, 2.5 cm 긴 블레이드 곡선 가위, 무딘 곡선 종료 박 장벽 (1.6.3)를 만드는 동안 약 0.5 cm 길이 끝이 집게, 또한 제 4 워치 포셉의 두 쌍 사용할 수 있습니다.
- 강철 핀에서 마이크로 칼 (에서 0.3 mm)를 만드 선명 돌에 기름을 사용하여 날카롭게. 쌍안 현미경을 사용하여, 플랫 블레이드 핀의 끝을 선명. 바늘 홀더에 핀을 삽입하고 노크와 덴되는 날카로운 끝을 보호테드.
참고 : 1,000 μL 피펫 팁과 칼을 피복이에 대한 간단한 옵션입니다. - 플라스틱 세척 병에 70 % 에탄올을 준비합니다. 전에 소독하고 청소 사용 후 수술 도구와 마이크로 칼을 닦아 용지 조직에이의 물총을 사용합니다.
- 5cm 폭 명확한 접착 테이프와 적절한 디스펜서를 주문. 찾기 또는 측면에 닭고기 달걀를 고정하기에 적합한 휴식을 생산하고 있습니다.
- 확인하고 몸을 담글 구슬 저장 솔루션을 제공합니다.
- 30 μL 씩에 -20 ° C에서 물과 상점으로 희석하여 1 ㎎ / ㎖ 냉동 재고 섬유 아세포 성장 인자 4 (FGF4) 단백질의 0.35 ㎎ / ㎖ 용액을 준비합니다.
- 준비 용액 5 ㎎ / ㎖의 스톡 어두운 마이크로 원심 튜브에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)로 희석 올 - 트랜스 - 레티노 산 (RA)의 (하나 또는 0.05, 0.1 ㎎ / ㎖). 주식 및 -20 ° C에서 100 ㎕를 분취를 저장합니다.
- 준비 솔루션 BMS 493 (5 중 2.5 ㎎ / ㎖) (역 AG10 ㎎ / ㎖ 재고에서 어둠의 microcentrifuge 튜브에서 DMSO로 희석의 RAR의 onist). 주식 및 -20 ° C에서 100 ㎕를 분취를 저장합니다.
- 알루미늄 호일에서 장벽을합니다.
참고 : 장벽을 만드는 데 사용되는 호일 (0.013 mm의 두께로 마이크로 미터로 측정) 표준 취사 호일입니다. 모든 국내 알루미늄 호일 가능성이 적합 할 것입니다.- 알루미늄 호일의 1cm 사각형 조각을 잘라 조직에 70 % 에탄올로 닦아하여 소독. 6cm 멸균 플라스틱 페트리 접시에 놓습니다. 뚜껑을 취소하고 박에서 접시의 뚜껑을합니다.
참고 :이 나중에 인해 정적으로 접시의 플라스틱 뚜껑에 달라 붙는 절단 장애를 방지 할 수 있습니다. - 1.6 배로 설정 배율 쌍안 현미경 스테이지 계수 선 상단의 페트리 접시를 (1 센티미터 길이 100 섹션으로 분할) 놓습니다. 15 번 블레이드 작은 메스를 사용하여, 예를 들어, 정확한 폭 0.7 mm 또는 1.3 mm를 호일의 스트립을 잘라.
- 호일을 분리제 4 워치 포셉 두 쌍을 사용하여 제거합니다. 그럼 특정 폭 힌지 유사한되도록 호일 장벽의 중앙에 직각 굽힘 부를 만든다.
참고 : 장벽이 모양 (10), (9)에서 가져온 것입니다. 힌지 장벽은 직선, 평면 장벽보다 더 좋은 곳으로 유지됩니다. 4 번 집게은 상대적으로 무딘 그리고 그들은 호일 장벽에 함몰 또는 성적을 덜하기 때문에 사용된다. - 접시에 대 한면이 평평하고, 접시에서 가리키는 한쪽에 남아있는 포경 박을 이동 서로 페트리 접시의 중앙에 장벽까지 선. 동작 전날 20 이상의 장벽을 준비합니다. 접시 위에 호일 뚜껑을 놓고 그들이 방해되지 않습니다 장소에서 장벽을 저장합니다.
주 : 심지어 약간의 노크를 통해 장벽을 팁을하거나 접시의 측면에 고정 스틱 것을 의미 할 수있다.
- 알루미늄 호일의 1cm 사각형 조각을 잘라 조직에 70 % 에탄올로 닦아하여 소독. 6cm 멸균 플라스틱 페트리 접시에 놓습니다. 뚜껑을 취소하고 박에서 접시의 뚜껑을합니다.
- 38 °에서 판지 계란 트레이에 자신의 측에 수정 된 닭고기 달걀을 품어작업 하루 전에 시간의 적절한 길이 C는 배아 원하는 8 단계에있을 것 같은 것이다.
병아리 배아 및 운영의 날 구슬 2. 준비
- '창'닭의 알을 배양 하였다.
참고 : 계란을 여는 다음과 같은 방법 데니스 Summerbell에 의해 통과되었다 (게시되지 않습니다).- 계란이 옆에 누워 입력 AA 강한 집게는 내부 쉘 막 끊어진 것을 확인한와 계란의 뭉툭한 끝 (공기 주머니 끝을) 피어스. 포셉 단단히 함께이 파악을하고 무료 손으로 계란을 잡고 제어 찌르는 모션을 사용합니다.
- 여전히 수평 축을 따라 180 °를 통해 전원을 켜고 맨이었다 측이 다음 트레이에 지금이되도록 계란 트레이에 교체 (한 쪽) 두 손에 옆에 누워 계란을 가져 가라.
참고 :이 쉘 막으로부터 배아를 풀어과 배아가 있음을 의미합니다 제작배아 상기 쉘을 제거 할 때, SS는 가능성이 절단된다. - 약 5cm 광장 분명 테이프의 조각을 가지고 계란을 열 때 배아에 무너져에서 달걀 껍질을 중지 계란의 최상부 표면에 밀접하게이 막대기.
- 공기가 바로 아래에 놓여 배아 위에 계란 (입력 할 수 있도록 부드럽게 껍질과 계란의 최상부의 중심에서의 막 돌파하기 위해 곡선 가위를 사용하여, 가위 중 하나 블레이드와 매우 작은 구멍을 셸의 최상부).
참고 : 그냥 쉘에서 약 0.5 cm를 계란 들어가는 공기가 쉘에서 배아를 분리하고 배아는 노른자 위에 나머지 올 것이다, 배아를 덮고있는 쉘 세포막을 파괴하고 세포막의 파괴하지 않음으로써 . - 약 1cm의 직경 원에 껍질에 구멍을 확대하기 위해 곡선 가위를 사용합니다. A의 계란에 구멍을 적출 쉘의 조각을 제거하고 커버분명 테이프의 조각 약 5cm 광장. 쉽게 테이프를 제거하려면, 무료 남은 테이프를 떠나, 단지 구멍의 입술에 그것을 스틱 테이프를 누릅니다. 무료 테이프는 다음 달걀 봉인을 해제 파악할 수있다.
- 단계의 배아
- 38 ° C 및 윈도우 (2.1 단계) (단계 1.7 참조)에서 배양 한 후, 8 항에 병아리 배아를 준비하는 쌍안 현미경을 사용합니다. 계란은 윈도우 다음 밀봉하기 직전에이 작업을 수행합니다. 달걀 껍질의 각 배아의 단계를 작성합니다. 인큐베이터에 달걀을 돌려줍니다.
주 : 8과 15 사이의 단계에서 배아가 장벽 비드 실험에 적합하다. 배아는 너무 오래 전에 작동을위한 인큐베이터에서 제외되지 않은 경우 생존 가능성이 더 높습니다.
- 38 ° C 및 윈도우 (2.1 단계) (단계 1.7 참조)에서 배양 한 후, 8 항에 병아리 배아를 준비하는 쌍안 현미경을 사용합니다. 계란은 윈도우 다음 밀봉하기 직전에이 작업을 수행합니다. 달걀 껍질의 각 배아의 단계를 작성합니다. 인큐베이터에 달걀을 돌려줍니다.
- 이전 작업에 잠기기 구슬.
- FGF4
- 1000 μL 피펫 팁의 단부에 부착 친화도 크로마토 그래피, 겔 비드의 개수 (150-300 μm의)를 가지고 있었다미세 원심 분리 튜브에 1 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)에서 H들을 그들이 5 초. 원심 분리기에 저장된 지드를 제거하고 PBS를 버리고 두 번 처리를 반복한다.
- 30 분 동안 얼음에 멸균 페트리 접시에 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 단백질의 30 μl의 드롭에 겔 비드를 만끽 해보세요. 배아에 번호로 삽입 5 microforceps을 직경 약 150 μm의 구슬을 선택합니다.
참고 : 구슬이 과민하고 너무 꽉 압착 깨질 수 있기 때문에 5 번 microforceps 매우 부드럽게 그립을 사용하여 다음 단계에 사용되는 이온 교환 수지 구슬을 처리합니다. 이 경고는 2.3.2-2.3.3 모든 수지 비드 작업에 적용됩니다.
- RA
- 0.05 또는 0.1 mg을 나누어지는을 해동 / 모든 트랜스-RA는 DMSO로 희석하고, 이전에 빛에서 RA를 보호하기 위해 호일에 덮여있다 멸균 페트리 접시 (9cm 직경)에 100 ㎕를 드롭 배치 ml로. 10 μL 피펫 팁을 가지고 어떤 염화 형태의 이온 교환을 데리러그 단부에 수지 비즈 및 20 분 동안 실온에서 빛으로부터 보호 RA 강하 이러한 소크.
- 적어도 1cm 간격 같은 페트리 접시에 배치 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) μL (100)의 3 개의 연속 방울 구슬을 씻어.
참고 : 구슬이 DMEM에서 페놀 빨간색 염료를 차지합니다. 이 방법은도 5에 기초한다. - 구슬을 유지하기 위해 페트리 접시와 5 호 microforceps에서 현미경 스테이지 계수 슬라이드를 사용하여 배아에 삽입, 약 100 μm의 직경 (젖어 비즈 75-180 μm의에서 크기가 다양합니다) 구슬을 선택합니다. 페트리 접시 위에 100 μL의 DMEM 방울, 비드 아래 첫 번째 장소에서 비드를 따기와 드롭 아웃 비드를 눌러 또는 모세관 (다음 비드에 폐쇄 집게를 배치하여 하나 그것에서 남아있는 DMEM를 제거 할 때 조치는) 비드에서 멀리 액체를 그립니다.
- BMS 493
- 적경 (2.3.2)에 관해서는, 이온 EXCH을 흡수20 분 동안 실온에서 DMSO의 BMS 493 ㎖의 2.5 또는 5.0 mg을 100 μL 드롭 / 앤지에서 수지 비드는 DMEM 100 ㎕ 방울로 헹군다. 배아에 삽입 구슬 약 100 μm의 직경을 선택합니다.
- DMSO 제어
- 적경 (2.3.2)에 관해서는, 다음 DMEM 100 ㎕ 방울로 헹구고 20 분 동안 실온에서 DMSO의 100 μL 강하 이온 교환 수지 비드 소크. 배아에 삽입 구슬 약 100 μm의 직경을 선택합니다.
- FGF4
3. 장벽과 구슬 운영
그림 어디 장벽 및 또는 구슬을 배치해야 표시 여러 단계의 병아리 태아의 1. 회로도. presump에서 somites와 LPM 사이 (A) 스테이지 13 병아리 배아 개략적으로 보여주는 장벽 위치 (녹색 선)적인 날개 수준 (15 ~ 20을 somites). RA 비드 (적색 원)이 배리어 삽입에 앞서 배치 될 위치를 나타내는 (B) (A)와 동일한 개략도. (C) 단계 15 배아의 추정 다리 레벨 (somites 26-32)에서 도식 보여주는 장벽 위치 (녹색 선). RA 비드 (적색 원)이 배치 될 위치를 나타내는 (D) (C)에서와 동일한 개략도. (E) 도식 BMS 493 비즈 (보라색 원)가 단계 15 배아의 LPM에 배치 할 위치를 나타냅니다. (F)을 추정 날개 수준에서 presomitic 중배엽과 LPM 사이의 장벽 위치 (녹색 선)를 나타내는 단계 9 병아리 배아의 개략도. (G) 장벽 (녹색 선) 및 RA 비드 (빨간색 원)의 위치를 나타내는 단계 9 배아의 개략도. (H)를 추정 다리 수준에서 차단 위치 (녹색 선)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도. (I 7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 배리어는 날개 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 단계 (13)에 삽입.
- 인큐베이터에서 단계 13 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. 분명 테이프의 상위 계층을 제거합니다.
- 강철 마이크로 칼을 이용하여, 난황 막 및 배아 우측 somites 15 ~ 20 (도 1a)에 인접하는 측판의 중배엽 (LPM)를 통해 절개를 (somites이 단계에서 형성된 모든있다). 형성 마지막 네 somites에 인접 잘라 꼬리 쪽 절단이 체절 길이를 계속합니다.
- 제 5 호 microfo과 (0.7-1 mm 폭) 장벽을 선택페트리 접시로부터 돌출 끝에 rceps 절개에 배리어의 자유 단부를 삽입하기 위해 핸드 트위스트. 경첩 모양의 장벽는 somites에 절개 말단을 통해 아래쪽으로 돌출의 절반으로 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. 가능한 한 빨리 명확한 테이프로 계란을 밀봉 인큐베이터로 돌아갑니다.
주 : 마이크로 나이프와 집게는 난황 막과 접촉에 스티커된다. 후속 작업을 시도하기 전에 70 % 에탄올으로 깨끗이 닦아하는 것이 중요하다. 이 이후의 모든 작업 설명에 적용 주입 비드 할 수 있습니다. - 비드는 배리어와 함께 삽입 할 수있는 경우; 첫째, 제 5 호 microforceps의 구슬을 가지고 절개의 말단 측의 LPM의 절단 얼굴에 삽입 한 후 비드 (그림 1B)에 절개 근위부에 장벽을 삽입합니다. 계란을 밀봉하고 인큐베이터에 즉시 반환.
- 배리어 다리 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 스테이지 (15)에 삽입.
주 : TBOX 4 전사 인자 (Tbx4) 식에이 연산의 결과의 일례는도 2D 및 2E에 도시되어있다.- 인큐베이터에서 단계 15 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. 분명 테이프의 상위 계층을 제거합니다.
- 강철 마이크로 나이프를 사용하여 배아 우측 somites 26-32 (도 1C)에 인접한 난황 막 및 LPM 통해 절개를 (somites이 단계에서 형성된 모든있다). 형성 마지막 두 somites에 인접 잘라 꼬리 쪽 절단 오 체절 길이를 계속합니다.
- 일단 5 호 microforceps와 장벽 (1.2-1.3 mm 폭)를 선택하고 절개로 끝을 삽입 할 장벽을 트위스트. 가능한 한 빨리 명확한 테이프 A의 계란을 밀봉차 인큐베이터로 돌아갑니다.
참고 : 장벽 모양의 힌지는 그것의 절반은 somites에 절개 말단을 통해 아래쪽으로 돌출와 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. - 비드는 배리어와 함께 삽입 할 경우, 우선, 제 5 microforceps에 비드를 가지고 절개의 선단 측에 LPM의 절단면에 삽입 한 다음에 절개 근위로 배리어를 삽입 비드 (그림 1D). 계란을 밀봉하고 인큐베이터에 즉시 반환.
- 구슬이나 비즈, 장벽없이 삽입 할 경우 예를 들어, 스테이지 (15)의 다리 지역 BMS 493 비즈, 긴 절개 (3.2.2.1)를하지 않습니다. 난황 막을 통해 비드가 배치되는 위치에서의 LPM에 작은 절개 부위를 만든다. 제 5 호 microforceps의 비드를 타고 LPM의 구멍에 삽입합니다. 포셉 (그림 1E)의 폐쇄 끝으로 조금 더에 밀어 넣습니다.
- 배리어는 날개 꽃 봉오리 유도 및 개시를 방지하기 위해 스테이지 (9)에 삽입.
- 단계 8 인큐베이터에서 9 배를 타고 선호하는 경우 3.2X 배율 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다.
- 강철 마이크로 칼을 사용하여 난황 막 통해 절개를하고 LPM somites에 맞춰 배아의 꼬리 끝에, 원시 행진에 측면과 주동이 (그림 1 층) 약 5 체절 긴 길이.
- 페트리 접시에서 튀어 나온 말에 5 번 microforceps와 장벽 (0.7-1 mm 폭)를 선택하고 절개로 장벽의 끝을 삽입하기 위해 손을 비틀어. 가능한 한 빨리 명확한 테이프로 계란을 밀봉 인큐베이터로 돌아갑니다.
참고 : 장벽 모양의 힌지는 그것의 절반은 절개를 통해 아래쪽으로 돌출와 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. - 비드는 inserte 될 경우장벽과 함께 D; 첫째, 제 5 호 microforceps의 구슬을 가지고 절개의 말단 측의 LPM의 절단 얼굴에 삽입 한 후 비드 (그림 1G)에 절개 근위부에 장벽을 삽입합니다. 계란을 밀봉하고 인큐베이터에 즉시 반환.
- 단계 8 인큐베이터에서 9 배를 타고 선호하는 경우 3.2X 배율 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다.
- 배리어 다리 봉오리 유도 및 개시를 방지하기 위해 스테이지 (10)에 삽입.
주 : Tbx4 발현이 작업의 결과의 일례는도 2G에 도시된다.- 인큐베이터에서 단계 10 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다.
- somites에 맞춰 배아의 꼬리 끝에, 강철 마이크로 칼은 원시적 인 행진에 측면 난황 막과 LPM을 통해 절개를 사용하여 (그림 1H) 약 6 체절 긴 길이.
- (1.2 장벽 픽업mm 페트리 접시에서 돌출 단부 제 5 microforceps)와 폭 손 트위스트 절개에 배리어의 자유 단부를 삽입한다. 가능한 한 빨리 명확한 테이프로 계란을 밀봉 인큐베이터로 돌아갑니다.
참고 : 장벽 모양의 힌지는 그것의 절반은 절개를 통해 아래쪽으로 돌출와 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. - 비드가 장벽없이 삽입되는 경우 예를 들어, 스테이지 (10)의 다리 영역 BMS 493 비드, 난황 막을 통해 비드가 배치되는 위치에서의 LPM에 작은 절개 부위를 만든다. 제 5 호 microforceps의 비드를 타고 LPM의 구멍에 삽입합니다. 포셉 (그림 1I)의 폐쇄 끝으로 조금 더에 밀어 넣습니다.
- 인큐베이터에서 단계 10 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다.
- 신흥 반대측 사지 싹 비하여 배리어의 위치를 확인 조작 후 24 시간 이상이다. 배리어 명확 oppos되지 않은 모든 배아 폐기왼쪽 사지 버드 ITE. 이 경우, 배리어 잘못 배치되었다.
제자리 교잡에서 Wholemount 4. 수확 배아, 고정 및 준비 (WISH)
- 수확 배아는 작업을 게시 할 수 있습니다.
- 단계 19-23에서 수확 배아 사지 꽃 봉오리의 형태가 명확하게 모두 운영과 반대측 제어 측면에서 볼 수 있도록.
- 사용 곡선 가위는 달걀 껍질에 큰 구멍을 잘라. microforceps와 배아의 왼쪽에있는 큰 혈관을 유지하면서 배아 주위를 잘라. 배아를 제거하고 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.3의 페트리 접시에 배치하는 선박의이 그립을 사용합니다.
- 쌍안 현미경, 아니 및 곡선 위의 조합을 사용하여 여분의 배아 혈관 세포막을 멀리 해부하다. 5 microforceps. 가위를 사용하여 헤드를 제거합니다.
- 단계 19-23에서 수확 배아 사지 꽃 봉오리의 형태가 명확하게 모두 운영과 반대측 제어 측면에서 볼 수 있도록.
- 배아의 고정 수확을 게시 할 수 있습니다.
- 곡선 blun 사용t 집게는 배아를 들어서 두 개의 시간이 스크류 캡 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 20 ml의 유리 병에서 요동하고, 실온에서 PBS 5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 배치.
주의 : PFA 건강에 심각한 위험이 있습니다. 이는 유해한 부식성 자극이고, 분말, 피부, 눈, 폐와 접촉하는 것을 방지해야한다. 솔루션을 준비하는 동안 개인 보호 복 및 흄 후드를 사용합니다. 이 4 % 용액, 장갑, 눈 보호 및 실험실 코트를 일단 착용해야합니다.
참고 : 빨리에 가장 수정으로 배아를 얻을 mRNA의 무결성을 유지하는 것이 중요하다.
- 곡선 blun 사용t 집게는 배아를 들어서 두 개의 시간이 스크류 캡 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 20 ml의 유리 병에서 요동하고, 실온에서 PBS 5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 배치.
- 현장 하이브리드에 wholemount하기 전에 장벽의 제거.
주 :이 날카로운 그들이 현장 하이브리드 프로토콜의 통과로 배아를 손상시킬 수 있기 때문에 장애는 여러 배아가 한 번에 염색 특히, 제거됩니다.- 고정에 이어, 양안 마일에서 PBS의 접시에 배아를 배치croscope.
- 제 5 호 microforceps 두 쌍을 사용하여 배아의 운영 측면에서 밀접한 장벽의 양쪽을 왼쪽 쌍을 배치합니다. 우측 쌍의 배리어를 잡고 부드럽게 배아를 유지하고이 제거 될 때 배리어에 부착되는 임의의 조직을 방지하기 위해, 왼쪽 쌍을 사용하여 배아로부터 장벽을 당긴다.
- (11)에 설명 된대로 본질적 위시을 수행하십시오.
- 인큐베이터에서 단계 15 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. 분명 테이프의 상위 계층을 제거합니다.
- 인큐베이터에서 단계 13 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. 분명 테이프의 상위 계층을 제거합니다.
Representative Results
위에서 설명한 프로토콜은 니시 모토 등의 알에 사용 된 방법을 설명합니다. 2015 년 논문은 전면과 병아리 배아의 뒷다리 모두 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 연구합니다. 앞다리 새싹의 생장을 방지하기 위해 불 침투성 장벽의 삽입 다음과 같은 결과는 이전 1, 2, 9을 발표되었지만 다리 버드 개시 1을 방지 단 하나의 연구 기술 장벽이되고있다. 니시 모토 등의 알에서 뒷다리 데이터입니다. 2015 년은 장벽 삽입 다음 mRNA 발현의 연구의 대표적인 결과로 여기에 표시됩니다.
LPM에서 Tbx4 표현은 뒷다리 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 :
도 2B와 C (표 2) 단계 15 (그림 2A)에서 그 장벽 삽입을 보여 모두 Fgf10 리드 (프로토콜 3.2 참조)및 Fgf8 표현은 운영 오른쪽에 (괄호로 표시) 다리 새싹 지역의 결석. 작동이되지 않는 왼쪽 비교. 그러나 Tbx4 식은 조작 측 (도 2D 및 E)의 양 단 (19)과 스테이지 (23)에서 관찰된다. 우리는 혼자 Tbx4 표현은 LPM에서 사지 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 결론 지었다. 병아리의 다른 연구 TBX 유전자 발현은 앞다리 봉오리 형성 (12, 13)을 개시하기에 충분한 것을 제안했다.
도 2c는 '장벽이 배아 포스트 고정의 다리 부분에 새겨 져 보이는 방법을 설명하기 위해 포함되어 있습니다. 경우 장벽의 대부분에서 사전 현장 하이브리드 (프로토콜 4.3)의에 제거 하였다.
Somites에서 RA는 Fgf10 유도 사지 버드 O 전에 LPM 필수적이다utgrowth :
도 3A는 스테이지 (15) (프로토콜 3.2.1.3)에 삽입 배리어에 RA 침지 비드 선단부의 추가를 나타내는 개략도이다. (별표로 표시)이 작업 사지 꽃 봉오리 가지가 컨트롤 왼쪽에있는대로 봉오리로 표현되는 동작 오른쪽과 Tbx4, Fgf10 및 Fgf8에 관찰 이후 (그림 3B, C 및 D, 표 2) . 따라서, LPM에 RA를 첨가 배리어 사지 싹 개시 진행의 효과를 극복한다. 우리는 사지 꽃 봉오리 가지가 시작되기 전에 somites에서 정상적인 개발 RA의 LPM에 필수적이라고 결론 지었다. 얻어진 사지 싹은 제어 측보다 일반적으로 작다. 이 LPM은 야생형 상황에 해당하지 인에서 RA 용량 때문일 수 있습니다. 적경 용량이 너무 높으면 꼭대기 외배엽 릿지 (AER)를 짧게 할 수 있고 작은 싹 초래14, 15.
LPM에서합니다 (somites에서) 그 RA를 확인하는 것은 정상적인 사지 꽃 봉오리 개시 RAR, BMS (493)의 역작용 필요, 사용되었다. 비즈 스테이지 (15)의 다리 지역 LPM에 주입된다 (그림 3E)을 (프로토콜 3.2.1.4 참조). Fgf10 식 제어 측 (표 3도 3f)에 비해 작은 사지 싹 결과 493 비즈 LPM에서 BMS의 다음 프로그램을 하향 조절한다. 제어 DMSO 비즈는 이러한 결함 (표 3도 3G 및 3H)를 발생하지 않습니다. BMS (493) 애플리케이션에 따라 관찰 된 결함은 배리어 조작에 의한 것보다 온화한; 즉,이 Fgf10 여전히 표현과 사지 싹이 형성된다. BMS 493의 효과가 구슬 주위에 로컬로 제한되며, AXI에 의해 생성 된 모든 RA를 적대시하지 못할 수 있기 때문 될 가능성이 높습니다등 조직.
조기 축 신호는 나중에 Tbx4 급행 LPM 셀을 지정합니다 :
LPM은 미래의 다리 형성 영역에서 Tbx4을 표현하는 능력을 획득 할 때 우리는 시험했다. 장벽 이후 다리 버드 파생물을 차단하는 것 삽입 할 수있는 초기 단계는, 우리는 무대보다 이전 단계에서 근축 중배엽 및 추정 다리 사이에 삽입 (12) 장벽 장벽을 삽입하는 프로토콜을 개발 최초로 단계 10입니다 스테이지 (10)에 LPM은 스테이지 (10)의 축선 조직에서 신호의 이상 발현을 위해 필요하다는 것을 시사 블록 레그 봉오리 형성 레그 형성 LPM을에 Tbx4의 발현 (도 2F 및 2G, 표 2) (프로토콜 34 참조) 뒷다리 LPM에서 Tbx4. 나중에 장벽 삽입 Tbx4 식을 수도 2D 및 E와이 결과를 비교설립합니다. 또한, 우리는이 축 신호가 RAR의 역작용이 Tbx4 발현을 저하 여부를 관찰하여 RA가 될 수 있는지 여부를 테스트했다. 스테이지 (10) (프로토콜 3.4.1.3 참조)에서 뒷다리 LPM에 배치 BMS 493 비드 DMSO에 배어 제어 비즈 Tbx4 식 (도 2J 및 2K)에 영향을주지 않는 반면, Tbx4 식 (그림 하반기 및 2I)을 downregulates. 함께, 이러한 결과는 축 조직에서 RA 신호가 긍정적으로 뒷다리 LPM 7 Tbx4을 조절함으로써 사지 유도를 조절하는 모델을 지원합니다.
수술 후 죽음 :
표 1, 2 및 3에 게시 작업 수확 전에 사망 병아리 배아의 개수를 포함한 실험 결과의 세부 사항을 제공한다. 일부 사망이 자연 미세 후 예상하여야한다. 숫자의 죽음은 유지 될 수있다 악기가 깨끗한 지 확인함으로써 최소로, 계란의 구멍은 배아이 마지막 지점 운영과 함께, 최소한의 시간에 대한 접착 테이프 인감의 보호없이 왼쪽되어, 최소 크기 필요하다 가능한 빨리 수행된다. 이러한 작업 중에 아주 많은 시간이 소요되지만 구슬과 장벽을 포함하는 작업이 좀 더 시간이 걸릴 수 없습니다. 이러한 조치에도 불구하고, 작업은 초기 단계에서 수행과 날개 지역의 사람들은 사망을 초래할 가능성이 더 높습니다. 죽음으로 인한 혈액 손실로 이어질 수있는 사지 형성 지역과 이들 선박의 사고 파열 주변의 큰 혈관이 있습니다. 우리는 계란 누구의 배아에 작동되지 않은, 종종 그 다음날에 의해 죽을 것이다 단계 8 또는 9에서 열 것을 찾을 수 있습니다. 따라서이 문제의 유일한 해결책은 실험의 높은 숫자를 수행하는 것입니다.
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추정 다리 수준에서 배리어 또는 구슬 삽입을 다음 그림 2. 마커 유전자 발현의 변화. (A) 단계 15 배아의 추정 다리 레벨 (somites 26-32)에서 도식 보여주는 장벽 위치 (녹색 선). (B - E 및 G) 운영 배아에 위시 분석. 다리 지역 (괄호)에 설명되어있다. (B) Fgf10 식은 작동 LPM에 존재하지만 강력한 발현 왼쪽 뇌에서 검출된다. (C) Fgf8 발현은 AER이없는 암시 상기 구동 측 부재. (C ') 장벽이 제거되기 전에 동일한 배아. (D)은 제어 Tbx4 새싹 같은 rostro - 꼬리 LPM 수준에서 표현된다. (E) Tbx4 발현 사지 성장의 부재에도 불구하고 오른쪽 다리 영역에 유지된다. (F) 단계의 개략도 추정 적 다리 수준에서 차단 위치 (녹색 선)를 보여주는 10 병아리 배아. (G) Tbx4 표현식은 운영 오른쪽 LPM (브라켓)에 존재하지 않는다. (H)를 추정 다리 수준에서 BMS 493 비드 위치 (보라색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도. (I) Tbx4 식 BMS 493 (J) 제어 DMSO 비드 위치 (회색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도 치료 다음 운영 오른쪽에 하향 조절된다. (K) Tbx4 단독 DMSO로 처리 추종 제어 좌측과 유사한 수준에서 작동 오른쪽에 표시된다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3. RA 구출 사지 버드의 부재는 배리어 삽입에 의한과 다리 버드 파생물에 앞서 LPM에서 필수입니다. (A)를 추정 다리 레벨 (somites 26-32)와 RA-적신 비드 (빨간색 원)에서 차단 위치 (녹색 선)를 나타내는 개략도. (B - D) (별표로 표시) RA 구출 다리 꽃 봉오리 가지. (B) Tbx4 발현은 수술하지 않은면에 동일한 구조의 다리 뇌에 존재한다. (C) Fgf10은 구출 다리되지 않은 운영 측면과 유사한 꽃 봉 오리 표현된다. (D) Fgf8는 구출 오른쪽 다리 버드의 AER 표현된다. BMS 493 비즈 (보라색 원)가 단계 15 배아의 추정 다리 LPM에 배치 된 위치 (E) 도식을 나타낸다. (F) Fgf10 표현은 운영 오른쪽에 하향 조절하고 다리 새싹 작은 다음과 BMS 49입니다(3) 치료. 비즈는 * 표입니다. 제어 DMSO 비드 (회색 원)의 위치를 나타내는 (E) 내지 (G) 유사 개략도. (별표로 표시) (H) DMSO 비즈 Fgf10 표현이나 다리 봉오리의 크기에 영향을 미치지 않았다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * | 수 운영 | 날개없는 ** | 윙 본 ** | 번호 죽은 |
| 스테이지 12 ~ 14 | (40) | (24) | 1 | (15) |
| 단계 8/9 | (65) | (23) | 0 | (42) |
| 스테이지 12 ~ 13 (FGF4 비드) | (41) | 7 (비드 누락) | (17) | (17) |
| 스테이지 12 ~ 13 (RA 비드) | (75) | 9 (비드 누락) | (32) | (34) |
| 스테이지 (13) (제어 비드) | (5) | 삼 | 0 | 이 |
| * somites 15 ~ 20과 측면 판 중배엽 사이에 위치 0.7-1 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. | ||||
| DMSO 제어 비드. | ||||
| ** 병아리 배아 고정 단계 21-23 | ||||
표 1. 윙 레벨 장벽과 구슬 실험 성과.
| 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * 수 운영 | 다리 누락 ** | 다리 본 ** | 번호 죽은 | |
| 스테이지 12 ~ 15 | (43) | (39) | 0 | 4 |
| 무대 10/11 | (23) | (16) | 0 | (7) |
| 스테이지 15 (FGF4 비드) | 8 | 0 | (5) | 삼 |
| 스테이지 15 (RA 비드) | (18) | 0 | (18) | 0 |
| * somites 26-32과 측면 판 중배엽 사이에 0.7-1.3 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. | ||||
| ** 병아리 배아 고정 단계 18 ~ 24 | ||||
표 2. 다리 레벨 장벽과 구슬 실험 성과.
| 수 운영 | 다리는 작은 꽃 봉오리 | 다리가 약간 작은 꽃 봉오리 | 다리 새싹 정상 크기 | 번호 죽은 |
| BMS 493 구슬 * | ||||
| (15) | (12) | 삼 | 0 | 0 |
| DMSO 비즈 ** | ||||
| (12) | 0 | 삼 | 9 | 0 |
| * 5 밀리그램에 담가 2 ~ 3 구슬 / ㎖ BMS 493 다리의 수준에 적절한 단계 14 ~ 15 LPM에 위치. | ||||
| DMSO에 배어 ** 2-3 구슬 혼자 다리의 수준에 적절한 단계 15 LPM에 위치. | ||||
| 병아리 배아 단계에서 고정 (1)7-19. | ||||
표 3. 다리 레벨 BMS 493 구슬 실험 성과.
Discussion
우리는 병아리 배아 사지 싹 형성을 방지하는 불 투과성 장벽의 사용을 설명한다. 이 기술은 중요한 단계들을 갖는다. 예비 실험에 따라, 우리는 9에 사용 된 경첩 모양의 장벽, 10 직선 장벽보다 훨씬 더 나은 배아에 그대로 남아 있음을 발견했다. 장벽의 말단 평평한면은 난황 막에 스틱과 장소 (그림 2C ')의 장벽을 유지합니다. 프로토콜 단계 1.6에 기재된 바와 같이 알루미늄 박의 힌지 형 장벽 조심 준비 동작의 성공에 필수적이다. 두 번째 중요한 단계는 계란이 너무 오래 윈도우를 다음과 배아에서 작동하기 전에 준비를위한 인큐베이터에서 제외되지 않도록하는 것입니다. 우리의 경험에서, 배아는 동작이 수행되는 때까지 또는 배양 온도는 근처에있는 경우 동작 더 생존. 따라서 작업 가능한 빨리 수행되어야하고 계란 프롬프트를 재 밀봉LY 좋은 생존율을 보장합니다. 많은 연구자들은 인큐베이터에 달걀을 반환하기 전에 미세 다음 배아에 항생제의 드롭을 추가합니다. 액체의 존재는 위치에 잘 붙지 장벽을 막았다. 항생제의 추가도 배치 후 구슬을 제거 할 수 있습니다. 따라서 항생제, 빠른 작업 및 악기에 좋은 청결을 사용하지 않는 것이 감염을 방지하는 것이 좋습니다. 작업의 모든 단계 다음 70 % 에탄올로 악기를 닦기 (프로토콜 단계 3.1.2.2 참조) 장벽 또는 구슬 모두 집게에 부착시킬 수있는 난황 막과의 접촉에서 스티커가되는 계기를 방지하기 위해 필수적이다. 사용하는 구슬의 두 종류가 작업 다음과 같은 장소에서 떨어질 수 있습니다. 배리어 위치 다음날 체크되었을 때 비드이 제자리에 남아 있는지 여부를 확인하기 위해 장벽을 볼 수 없었다. 비드 밖으로 떨어진 경우에 날개 꽃 봉오리 가지가 구출되지 않았다 ( 이 프로토콜은, 사지 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 장벽을 사용 이전에 발행 된 실험을 수정 장벽에 대한 특정 최적의 폭을 정의하고 유전자 발현 분석 한 다음 결합 장벽 비드 위치를 소개합니다. 우리는 저렴하고 모든 실험실에서 쉽게 사용할 기존의 알루미늄 호일을 사용하여 발견, 이전에 탄탈륨 포일을 사용하는 것과 동일한 결과를 생성합니다. 호일 계내 혼성화 (도 2C ')에서 수행 할 때 배아에 남아 있지만, 하나 이상의 배아 배아 손상 포일의 날카로운 모서리를 방지하기 위해 처리되는 경우, 우리는 일반적으로 제거 될 수있다. 피ILOT 연구 레그 영역 장벽의 폭이 특히 중요하다는 것을 보여 주었다. 처음 평가판을 장벽이 너무 짧습니다되었고 다리 버드 파생물을 방지하지 않았다. 1.2-1.3 mm 완전히 다리 꽃 봉오리 가지를 차단하는 장벽에 대한 최적의 폭이다. 하나 정확하게 배치 할 수있는 좁은 날개 장벽은 꽃 봉오리 가지가 가장 생존율을 줄 방지합니다. 이것은 0.5 내지 0.7 mm만큼 좁아 질 수있다. 그러나, 조금 더 넓은 장벽 (우리는 0.7-1 mm를 사용)가 배치 약간의 부정확성을 허용하기 때문에 날개 꽃 봉오리 가지의 완전한 차단이 발생할 가능성이 더 높습니다. 혈관의 회피는 때 절개를 만드는 것은 날개 꽃 봉오리 수준의 장벽 중요합니다. 반 투과 장벽은 이전에 병아리 사지 꽃 봉오리를 양분하는 데 사용되었다. MacCabe과 파커, 1976 Summerbell 1979 년 모두 사용되는 필터는 각각 0.45 μm의 0.8 μm의 기공 크기, 16, 17. 그들은 확산 신호가 필터 및 그 구멍을 통과 할 수 있다고보고결과는 반 투과 장벽이 불 침투성 탄탈 박 장벽없이 존재하는 장벽과 하나 사지 꽃 봉오리 사이의 중간이었다 사용되었습니다. 이 프로토콜은 크기 나 확산 신호의 동적을 수정하는 기초 후보 신호를 구별하기 위해 다양한 기공 크기의 반 투과 장벽을 사용하도록 구성 될 수있다. 이 프로토콜은 주로 모델 생물 자체와 관련된 다양한 제한 사항이 있습니다. 이러한 기술은 사지 개발에 추가 질문도 척추 동물 배아의 다른 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 단은 병아리 배아 개입에 액세스 할 때 해당 기관 / 지역 개발해야한다는 것입니다. 장벽이 배치 될 필요가있는 영역의 큰 혈관의 존재는 차단 위치 이후 단계 13 또는 14보다 기술적 도전한다. 큰 혈관 장벽 배치하는 동안 절단하는 경우이 태아 사망의 원인이 될 수 있습니다. 전사가 T 요인을 때의 조사bx5 및 Tbx4가 먼저 LPM에 유도는 우리가 나중에 각각 반대 하나 날개 또는 다리 새싹을 끝낼 것 장벽을 배치 할 수있는 초기 단계에 의해 제한되었다. 낭배에 가까운 초기 단계에서 TBX 유전자 도입을 차단하는 시도를 조명 할 수있다. 초기 배리어가 추정 윙 영역에 배치 될 수 성공적 스테이지 (8)이었고, 이후의 급속한 성장은 배리어 결과를 변위 때문에 다리 영역 스테이지 (10)에서이 프로토콜은 아마도 사지 싹 단계 이후의 유전자 발현 연구에 적합하지 않다 단지 배리어의 초기 위치에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 병아리 배아의 한계를 관련하는 데, 다른 척추 동물 모델 생물을 통해 그 장점이 많다. 병아리 배아는 척추 동물 배아의 물리적 간섭이 유형의 매우 적합한 동물 모델이다. 배아 비교적 크고 throu 쉽게 접근달걀 껍질을 GH. 하나는 추가 실험을위한 배아로 돌아갈 수 있습니다 (예를 들면, 비드 (18) 또는 장벽의 제거) 또는 단순히 테이프 창을 제거하여 진행 상황을 확인. 라이브 영상 또는 시간 경과 영상을 포함 가능 범위가 있습니다. 우리는 특히 초기 단계의 배아에서 작동에 적합 닭 계란을 윈도하는 방법을 설명합니다. 사지 연구의 경우에 각 생물학적 복제 이상적인 내부 대조군으로서 작용 각 실험에 대한 반대측 제어 사지가 매우 중요하고 유용하다. 신호 분자에 침지 사지 가지 비즈 않도록 투과성 장벽을 이용하는 조합은 이전에보고되지 않았다. 이러한 개입을 다음과 mRNA 발현의 우리의 분석은 또한 소설이다. 이러한 기술은 사지 특정 전사가 Tbx5 및 Tbx4도 LPM에 유도하는 요인 때의 어려운 문제를 해부 할 수있게이상, 종래 새싹 개시 사지 것을 보여주기 위해 상기 LPM TBX 이러한 유전자의 존재 Fgf10 전사의 활성화 및 사지 싹 생장 개시 충분하지 않다. 2G, 2D 및 2E는 또한 이러한 결과를 도시한다. 그림 2G에서 스테이지 (10)에서 장벽의 삽입 다음 Tbx4 식의 부재는 Tbx4의 유도 후, 단계 15에서 장벽 삽입 다음 2D 및 2E에서 자신의 존재에 대한 대조적이다. RA 배어 구슬의 주입 장벽 삽입 및 사지 꽃 봉오리 가지 시작하기 전에 LPM에 필수 인 somites에서 RA 너무 포인트를 다음과 사지 버드 개시의 구조를 촉진. 이러한 기술은 사지 개발에 더 질문뿐만 아니라 척추 동물 배아의 다른 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌, 눈과 트렁크의 분야 적합 할 것으로 보인다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
| Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
| Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
| Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
| Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
| Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
| Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
| Mineral oil | |||
| Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
| Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
| FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
| all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
| BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
| Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
| Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
| AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
| Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
| Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
| DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500 ml |
| Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
| Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |
References
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