Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Anvendelse af impermeable barrierer Kombineret med Candidate Factor Soaked Perler til at studere Induktive Signaler i Chick

doi: 10.3791/54618 Published: November 17, 2016

Abstract

Kyllingefosteret giver en fantastisk hvirveldyr model, der kan bruges til at dissekere udviklingsmæssige spørgsmål på en direkte måde. Dens tilgængelighed og robusthed efter kirurgisk indgreb er centrale eksperimentelle styrker. Mica plader var de første barrierer, der anvendes til at forhindre chick lemmer opløbet initiering 1. Protokoller, der bruger aluminiumsfolie som en uigennemtrængelig barriere for fløj knop eller ben knop induktion og eller initiering beskrives. Vi kombinerer denne teknik med perle placering lateral til barrieren at eksogent udbuddet kandidat endogene faktorer, der er blevet blokeret af barrieren. Resultaterne analyseres ved anvendelse af in situ-hybridisering af efterfølgende genekspression. Vores primære fokus er på den rolle, retinsyre signalering i induktion og nyere indledningen af ​​kyllingefosteret forgrunden og bagben. Vi bruger BMS 493 (en invers agonist af retinsyrereceptorer (RAR)) gennemblødt perler implanteret i den laterale plade mesoderm (LPM) at efterligne virkningen af ​​en barRier placeret mellem somitter (en kilde af retinsyre (RA)) og LPM hvorfra Lemanlæggene vokse. Modificerede versioner af disse protokoller kan også bruges til at behandle andre spørgsmål om oprindelse og timingen af ​​induktive signaler. Forudsat området af chick embryo er tilgængelig på det pågældende udviklingstrin, kan en barriere placeres mellem de to væv og deraf følgende ændringer i udviklingen undersøgt. Eksempler kan findes i den udviklende hjerne, akse udvidelse og i organudvikling, såsom lever eller nyre induktion.

Introduction

Klassiske embryologer traditionelt ansat fysiske teknikker til at afhøre de mekanismer, der styrer fosterudviklingen. I 1960'erne og 1970'erne efterforskere udviklede teknikker, der bruges uigennemtrængelige barrierer indsat mellem væv af embryo under udvikling til at vise betydningen af ​​induktive signaler under embryogenese. Vores interesse er i hvirveldyr udvikling lemmer og især hvilke begivenheder forud opløbet lemmer udvækst. For eksempel kan indsættelse af en barriere forhindre lemmer knop udvækst opstår på den ene side af chick embryo samtidig med at den skal fortsætte normalt på den kontralaterale, ikke-opererede side. Materialer, der anvendes til at gøre disse barrierer varieret; for eksempel mica plader 1 og tantal folie 2. Disse hindringer adskille den laterale plade mesoderm (LPM), hvorfra lem-knoppen former, fra de somitter dannet af akseparallelle mesoderm. Kirurgiske podning teknikker viser, at tæt samarbejde with somitter er afgørende, hvis bud lemmer initiering er at forekomme i LPM 3 4. I 80'erne og 90'erne opdagede udviklingsmæssige biologer diffusible signalmolekyler, der er afgørende i at kontrollere udviklingsprocesser. Perler gennemvædet med disse signalmolekyler kan implanteres i bestemte områder af embryo og producere ændringer til fosterudviklingen. For eksempel er retinsyre (RA) optages af ionbytnings perler frigives over en periode på 24 timer, når de implanteres i en chick embryo og kan producere spejlbillede duplikering af cifrene 5. Heparin akryl perler indeholdende FGF-protein kan initiere lemmer knop udvækst fra interlimb LPM 6.

For nylig mus og fisk genetik har taget studiet af hvirveldyr lemmer indvielse i en ny æra (revideret i 7). Der er god dokumentation for, at RA stede i somitter før knop lem initiering er den væsentlige diffunderbart signal kræves af LPM at indlede lemmer spirende. Vi ønskede at udnytte adgangen til og eksperimenterende robusthed chick embryo at dissekere effekten af ​​barrieren implantation på genekspression i LPM omkring tidspunktet for opløbet lemmer indvielse. En hidtil ukendt tilpasning af vores metode er at kombinere en barriere, der blokerer signaler fra aksiale væv med perle placering lateralt til barrieren exogent forsyning kandidat endogene faktorer, der er blevet blokeret af barrieren. Følgende protokoller er dem udviklet til at drille de mekanismer lemmer opløbet induktion og indvielse.

Studere opløbet lemmer indvielse: ved hjælp embryoer tidlige. Mange forskere vindue hønseæg ved først at fjerne nogle af albuminet gennem luftsækken med en kanyle. Embryonet, som ligger på toppen af ​​blommen, vil så ligge lavere i ægget. Dette er en fordel for nogle teknikker, såsom elektroporering, men kan være en ulempe, hvis der ønskes kirurgisk manipulation af embryoet.Vi finder der embryoet så tæt til åbningen i ægget som muligt er en fordel.

Spørgsmål forblive om de signaler, der styrer hvirveldyr lemmer opløbet induktion og indvielse og følgende protokoller er egnede til at løse dem. Vi er de første til at udvikle en protokol for indsættelse af barrierer for at forhindre chick lemmer opløbet udvækst på et stadie tidligere end stadie 12 8. Modificerede versioner af disse protokoller kan også bruges til at behandle andre spørgsmål om oprindelse og timingen af ​​induktive signaler, hvor en tilgængelig overtalelse væv ligger ved siden af ​​primordium blive induceret. Forudsat regionen af ​​embryoet er tilgængelig på det pågældende udviklingstrin, så en barriere kunne placeres mellem de to væv og deraf følgende ændringer i udviklingen undersøgt. Eksempler kan findes i hjernens udvikling, akse udvidelse og eventuelt organudvikling såsom lever eller nyrer induktion.

Protocol

Følgende protokol anvender kyllingeembryoner på mindre end ti dages inkubation. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Kings College London, UK og retningslinjer dyr pleje det britiske indenrigsministerium.

1. Forberedelse Nødvendig Før kyllingeembryo Operation

  1. Saml følgende kirurgiske instrumenter, der er nødvendige for driften, for høst og for fastsættelse af chick embryoner: To par No. 5 urmagere pincet, et par af stærke pincet, f.eks typen AA, buede saks med blade 2,5 cm lang, stump endte buet pincet med enderne ca. 0,5 cm lange, og også to par No. 4 urmagere pincet til at bruge, samtidig med at folie barrierer (1.6.3).
  2. Lav en mikro kniv fra en stål pin (0,3 mm på tværs) skærpet brug af olie på en slibesten. Ved hjælp af en binokulært mikroskop, skærpe spidsen af ​​stiften til en flad klinge. Placer stiften i en nåleholder og beskytte sin skarpe ende fra at blive slået og huleted.
    BEMÆRK: kapper kniven med en 1000 pi pipettespids er en enkel løsning for dette.
  3. Forbered 70% ethanol i en plastik vaskeflaske. Brug en sprøjte af dette på et papir væv til at tørre de kirurgiske instrumenter og mikro kniv før og efter brug for at sterilisere og rense dem.
  4. Køb 5 cm bred klar tape og en egnet dispenser. Find eller fremstille en hvile egnet til at holde en kylling æg stabilt på sin side.
  5. Foretag og butiksløsninger til iblødsætning perler.
    1. Forbered en 0,35 mg / ml opløsning af fibroblast vækstfaktor 4 (FGF4) protein fra 1 mg / ml frossen lager ved at fortynde den med vand og opbevares ved -20 ° C i 30 pi prøver.
    2. Fremstilles opløsning (enten 0,05 eller 0,1 mg / ml) af all-trans-retinsyre (RA) fortyndet med dimethylsulfoxid (DMSO) i mørke mikrocentrifugerør fra en 5 mg / ml stamopløsning. Opbevar bestanden og 100 pi alikvoter ved -20 ° C.
    3. Fremstilles opløsning (enten 2,5 eller 5 mg / ml) af BMS 493 (en invers agonist af RAR) fortyndet med DMSO i mørke mikrocentrifugerør fra en 10 mg / ml stamopløsning. Opbevar bestanden og 100 pi alikvoter ved -20 ° C.
  6. Foretag barrierer fra aluminiumsfolie.
    BEMÆRK: Folien anvendes til fremstilling af barriererne er standard catering folie (målt ved mikrometer som 0,013 mm tyk). Enhver indenlandsk aluminiumsfolie ville sandsynligvis være egnet.
    1. Skær en 1 cm firkantet stykke aluminiumsfolie og sterilisere den ved at tørre den med 70% ethanol på en væv. Placer den på en 6 cm steril plastik petriskål. Kassér låget og gøre et låg til skålen fra folien.
      BEMÆRK: Dette vil forhindre de afskårne barrierer fra senere klæber til plastlåg af skålen på grund af statisk.
    2. Placer petriskålen på toppen af ​​en scene stregglasset (1 cm lang opdelt i 100 sektioner) under en binokulært mikroskop med forstørrelse indstillet til 1,6X. Ved hjælp af en No.15 klinge lille skalpel, skæres strimler af folien til en præcis bredde, fx 0,7 mm eller 1,3 mm.
    3. Adskil folienstrimler bruger to par No. 4 urmagere pincet. Derefter foretage en retvinklet bøjning i midten af ​​folien barriere, således at den ligner et hængsel af den specifikke bredde.
      BEMÆRK: Denne form for barriere er taget fra 9, 10. En hængslet barriere bliver på plads bedre end en straight, flad barriere. No. 4 pincet er relativt stumpt og anvendes, fordi de er mindre tilbøjelige til at gøre buler eller ridser i folie barrierer.
    4. Line up de barrierer i midten af ​​petriskålen med den ene side fladt mod skålen og anden peger op ud af skålen, flytter de resterende ubeskåret folie til den ene side. Forbered 20 eller flere barrierer før operation dag. Sæt folien låg over fadet og gemme barrierer i et sted, hvor de ikke bliver forstyrret.
      BEMÆRK: Selv en lille knock kan tippe barrierer end eller betyde, at de holde sig statisk til siderne af skålen.
  7. Inkuber befrugtede hønseæg på deres sider på pap æggebakker ved 38 °C til passende længde af tid, før driften dag sådan, at embryonerne vil være på den ønskede 8 scenen.

2. Udarbejdelse af Chick embryoner og Perler på Operation Dagsværk

  1. 'Window' inkuberes hønseæg.
    BEMÆRK: Følgende metode til at åbne æggene blev videregivet af Dennis Summerbell (ikke offentliggjort).
    1. Med ægget ligger på siden, gennembore den stumpe ende (luftsækken ende) af æg med typen AA stærke pincet at sikre, at den indre skal membran er blevet brudt. For at gøre dette greb tangen fast sammen og bruge en kontrolleret stikkende bevægelse, mens du holder ægget med den frie hånd.
    2. Tag ægget, stadig liggende på siden, i begge hænder (én på hver side) drej den 180 ° langs den vandrette akse og erstatte det i æggebakken, således at den side, der var øverst er nu ud for bakken.
      BEMÆRK: Dette løsner embryonet fra skallen membranerne og vil betyde, at fosteret er less sandsynligvis skal skæres, når skallen over embryonet fjernes.
    3. Tag et stykke klar tape ca. 5 cm firkantet og holde dette nøje i den øverste overflade af ægget til at stoppe æggeskallen fra smuldre på embryo når ægget åbnes.
    4. Brug krum saks til forsigtigt bryde gennem skallen og dens membraner i midten af ​​den øverste del af ægget, lave en meget lille hul med en klinge af saksen, således at luft kan trænge ind i ægget over embryon (som ligger lige under den øverste del af skallen).
      BEMÆRK: Ved bare at bryde skallen membraner og ikke bryde nogen af ​​membranerne, der dækker embryo, luft ind i ægget vil adskille embryo fra skallen og embryoet vil komme til at hvile på toppen af ​​blommen ca 0,5-1 cm fra skallen .
    5. Brug krum saks for at forstørre hullet i skallen til en cirkel med en diameter på ca. 1 cm. Fjern det stykke af udskårne skal og dække hullet i ægget med enstykke klar tape ca. 5 cm firkantet. For nemt at fjerne denne tape, skal du trykke på båndet for at holde det kun på hulkanten, forlader resterende bånd fri. Den frie tape kan derefter gribes at bryde forseglingen ægget.
  2. embryoer
    1. Efter inkubation ved 38 ° C (se trin 1.7) og vinduesystemet (trin 2.1), skal du bruge en kikkert mikroskop til at iscenesætte de chick embryoner i henhold til otte. Gør dette lige før æggene er forseglet efter vinduesystemet. Skriv den fase af hvert embryo på æggeskallen. Retur æggene til inkubatoren.
      BEMÆRK: Embryoner i etaper mellem 8 og 15 er velegnet til eksperimenter barriere og perle. Embryoner er mere tilbøjelige til at overleve, hvis de ikke er blevet udeladt af inkubatoren for længe før operation.
  3. Iblødsætning perler før operation.
    1. FGF4
      1. Tag det antal affinitetskromatografi gelperler (150-300 um), som sidder fast til enden af ​​en 1.000 pi pipettespids og varh dem i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) i et mikrocentrifugerør at fjerne azidet de opbevares i. Centrifuger i 5 sek, kasseres PBS og gentage processen to gange.
      2. Soak gelperlerne i en 30 pi dråbe 0,35 mg / ml FGF4 protein på en steril petriskål på is i 30 minutter. Pick perler ca. 150 um i diameter med Nr 5 microforceps til indføring i embryoet.
        BEMÆRK: Håndter ionbytterharpiks perler, der anvendes i de følgende trin med No. 5 microforceps og greb dem meget forsigtigt, fordi perlerne er skør og kan splintre hvis presset for hårdt. Denne advarsel gælder for 2.3.2-2.3.3 og alle harpiksperle operationer.
    2. RA
      1. Afrime en alikvot på 0,05 eller 0,1 mg / ml all-trans-RA fortyndet med DMSO og placere en 100 pi dråbe på en steril petriskål (9 cm i diameter), som tidligere har været dækket i folie til beskyttelse af RA mod lys. Tag en 10 pi pipettespids og hente nogle chlorid formular ionbytningharpiks perler på sin ende og suge disse i RA drop beskyttet mod lys ved stuetemperatur i 20 minutter.
      2. Skyl perlerne i tre på hinanden følgende dråber 100 gl Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) placeret på samme petriskål mindst 1 cm fra hinanden.
        BEMÆRK: Perlerne tage op phenolen rødt farvestof fra DMEM. Denne metode er baseret på fem.
      3. Pick perler ca. 100 um i diameter (perler varierer i størrelse fra 75-180 um i våd tilstand) til indføring i embryo, ved hjælp af et mikroskop stadium gradnet dias under petriskålen og No.5 microforceps at holde perlerne. Når optagning perlen fra 100 pi dråbe DMEM, første sted perlen ned på petriskålen, og fjern eventuelt resterende DMEM fra det enten ved at skubbe perlen ud af dråben eller ved at placere de lukkede pincet siden af ​​perlen (kapillær handling trækker væsken væk fra perlen).
    3. BMS 493
      1. Som for RA (2.3.2), sættetid ion exchange resin perler i en 100 pi fald på 2,5 eller 5,0 mg / ml BMS 493 i DMSO ved stuetemperatur i 20 minutter og derefter skylles i 100 pi dråber af DMEM. Pick perler omkring 100 um i diameter til indsættelse i embryoet.
    4. DMSO kontrol
      1. Som for RA (2.3.2), sættetid ionbytterharpiks perler i 100 pi dråbe DMSO ved stuetemperatur i 20 minutter og derefter skylles i 100 pi dråber af DMEM. Pick perler omkring 100 um i diameter til indsættelse i embryoet.

3. Barrier og Bead Operations

figur 1
Figur 1. Skema af Chick Embryoner af forskellige stadier Viser Hvor Barrierer og eller perler skal placeres. (A) Stage 13 chick embryo skematisk viser barriere position (grøn linje) mellem somitter og LPM på presumptive fløj niveau (somitter 15-20). (B) Det samme skematiske som i (A), hvilket indikerer, hvor RA vulst (rød cirkel) skal placeres før barriere indsættelse. (C) Skematisk viser barriere position (grøn linje) på den formodede ben niveau (somitter 26-32) i en fase 15 embryo. (D) den samme skematiske som i (C), der angiver, hvor en RA vulst (rød cirkel) skal placeres. (E) Skematisk angivelse af, hvor BMS 493 perler (lilla cirkler) bør placeres i LPM af en scene 15 embryo. (F) Skematisk diagram af en scene 9 chick embryo indikerer barriere position (grøn linje) mellem presomitic mesoderm og LPM på den formodede fløj niveau. (G) Skematisk diagram af en scene 9 embryo viser positionerne for en barriere (grøn linje) og RA perle (rød cirkel). (H) Skematisk diagram af en scene 10 chick embryo viser barriere position (grøn linje) på den formodede ben niveau. (I 7. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Barrier indsat på trin 13 for at forhindre fløj opløbet indvielse.
    1. Tag en etape 13 embryo fra inkubatoren og placer æg på et æg hvile under et binokulært mikroskop indstillet til 3,2x forstørrelse eller højere, hvis det foretrækkes. Fjern det øverste lag af klar tape.
      1. Ved hjælp af en stål mikro kniv, lave et snit gennem vitellinmembranen og laterale plade mesoderm (LPM) tilstødende somitter 15 til 20 (figur 1A) på højre side af embryo (somitter har ikke alle dannet på dette stadium). Skær støder op til de sidste fire somitter dannet og fortsætte snittet to somit længder kaudalt.
      2. Saml barrieren (0,7-1 mm bred) med No. 5 microforceps ved enden rager ud fra petriskålen og vride hånd til at indsætte den frie ende af barrieren ind i indsnittet. Hængslet formet barriere ligger fladt på vitellinmembranen over LPM med halvdelen af ​​det fremspringende nedad gennem snittet distalt for somitter. Så hurtigt som muligt forsegle ægget med klar tape og returnere det til inkubatoren.
        BEMÆRK: mikro kniv og pincet blive klæbrig ved kontakt med vitellinmembranen. Det er vigtigt at tørre dem rene med 70% ethanol, før du forsøger en efterfølgende operation. Dette gælder for alle efterfølgende drift beskrivelser og perle implantationer.
      3. Hvis en perle skal indsættes sammen med en barriere; for det første tage perlen i Nr 5 microforceps og indsætte det i snittet ansigt LPM på den distale side af snittet og derefter indsætte barrieren ind i indsnittet nærmest perlen (figur 1B). Seal ægget og returnere det straks til inkubatoren.
    2. Barrier indsat på trin 15 for at forhindre ben opløbet indvielse.
      BEMÆRK: Et eksempel på resultatet af denne handling på Tbox 4 transkriptionsfaktor (Tbx4) ekspression er vist i figur 2D og 2E.
      1. Tag en etape 15 embryo fra inkubatoren og placer æg på et æg hvile under et binokulært mikroskop indstillet til 3,2x forstørrelse eller højere, hvis det foretrækkes. Fjern det øverste lag af klar tape.
        1. Ved hjælp af en stål micro kniv lave et snit gennem vitellinmembranen og LPM støder op til somitter 26 til 32 (figur 1c) på højre side af embryo (somitter har ikke alle dannet på dette stadium). Skær støder op til de sidste to somitter dannet og fortsætte de afskårne fem somit længder kaudalt.
        2. Saml barrieren (1,2-1,3 mm bred) med nr 5 microforceps i den ene ende og sno barrieren for at indsætte den frie ende ind i snittet. Så hurtigt som muligt forsegle ægget med klar tape ennd returnere den til inkubatoren.
          BEMÆRK: Hængslet formet barriere ligger fladt på vitellinmembranen over LPM med halvdelen af ​​det fremspringende nedad gennem snittet distalt for somitter.
        3. Hvis en perle skal indsættes sammen med en barriere for det første tage perlen i No. 5 microforceps og indsætte det i snittet flade af LPM på den distale side af snittet og derefter indsætte barrieren ind i indsnittet proximalt til vulsten (figur 1D). Seal ægget og returnere det straks til inkubatoren.
        4. Hvis en perle eller perler skal indsættes uden en barriere, f.eks do BMS 493 perler på benet region på stadium 15, ikke gøre den lange indsnit (3.2.2.1). Lave et lille snit gennem vitellinmembranen og ind i LPM ved positionen perlen skal placeres. Tag perlen i Nr 5 microforceps og sæt den ind i hullet i LPM. Skub den i lidt videre med de lukkede ender af tangen (figur 1E).
      2. Barrier indsat på trin 9 for at forhindre fløj opløbet induktion og indvielse.
        1. Tag en scene 8 eller 9 embryo fra inkubatoren og placer æg på et æg hvile under et binokulært mikroskop indstillet til 3,2x forstørrelse eller højere, hvis det foretrækkes.
          1. Ved hjælp af en stål micro kniv lave et snit gennem vitellinmembranen og LPM lateral og rostralt for primitivstriberne, ved den kaudale ende af embryo i overensstemmelse med de somitter (figur 1F) omkring 5 somit længder lang.
          2. Saml barrieren (0,7-1 mm bred) med Nr 5 microforceps ved enden rager ud fra petriskålen og vride hånd til at indsætte den frie ende af barrieren ind i indsnittet. Så hurtigt som muligt forsegle ægget med klar tape og returnere det til inkubatoren.
            BEMÆRK: Hængslet formet barriere ligger fladt på vitellinmembranen over LPM med halvdelen af ​​det fremspringende nedad gennem snittet.
          3. Hvis en perle er at være inserted sammenholdt med en barriere; for det første tage perlen i Nr 5 microforceps og indsætte det i snittet ansigt LPM på den distale side af snittet og derefter indsætte barrieren ind i indsnittet nærmest perlen (figur 1G). Seal ægget og returnere det straks til inkubatoren.
      3. Barrier indsat på trin 10 for at forhindre ben opløbet induktion og indvielse.
        BEMÆRK: Et eksempel på resultatet af denne handling på Tbx4 ekspression er vist i figur 2G.
        1. Tag en etape 10 embryo fra inkubatoren og placer æg på et æg hvile under et binokulært mikroskop indstillet til 3,2x forstørrelse eller højere, hvis det foretrækkes.
          1. Ved hjælp af en mikro kniv stål lave et snit gennem vitellinmembranen og LPM lateralt for primitivstriberne, ved den kaudale ende af embryo i overensstemmelse med de somitter (figur 1H) ca. 6 somit længder lang.
          2. Saml barrieren (1,2mm bred) med Nr 5 microforceps i slutningen rager ud fra petriskålen og vride hånd til at indsætte den frie ende af barrieren ind i indsnittet. Så hurtigt som muligt forsegle ægget med klar tape og returnere det til inkubatoren.
            BEMÆRK: Hængslet formet barriere ligger fladt på vitellinmembranen over LPM med halvdelen af ​​det fremspringende nedad gennem snittet.
          3. Hvis en perle skal indsættes uden en barriere, fx BMS 493 vulst til benet region ved trin 10, lave et lille snit gennem vitellinmembranen og ind i LPM ved positionen perlen skal placeres. Tag perlen i Nr 5 microforceps og sæt den ind i hullet i LPM. Skub den i lidt videre med de lukkede ender af tangen (figur 1 i).
      4. 24 timer eller mere efter betjening kontrollere placeringen af ​​barrieren sammenlignet med den spirende kontralaterale lem-knoppen. Kassér eventuelle embryoner, hvor barrieren er tydeligvis ikke opposITE venstre lem-knoppen. I dette tilfælde barrieren er blevet forkert placeret.

      4. Høst Embryoner, Fiksering og Forberedelse til wholemount in situ-hybridisering (WISH)

      1. Høst embryoner skrive operation.
        1. Harvest embryoner på stadium 19-23 sådan, at knop lemmer morfologi er klart synlig i både drives og kontralaterale kontrol sider.
          1. Ved hjælp krum saks skære et større hul i æggeskallen. Skær omkring fosteret, mens du holder den store blodkar til venstre for foster med microforceps. Brug denne greb af beholderen for at fjerne fosteret og læg den i en petriskål af phosphatpufret saltvand (PBS) pH 7,3.
          2. Under et binokulært mikroskop, dissekere væk ekstra embryonale skibe og membraner ved hjælp af en kombination af buede sakse og nej. 5 microforceps. Fjern hovedet ved hjælp af en saks.
      2. Fiksering af embryoner skrive høst.
        1. Brug buet blunt pincet, løft embryo og placere den i 5 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS ved stuetemperatur i to timer rokkende og derefter ved 4 ° C natten over i en 20 ml glasflaske med skruelåg.
          Advarsel: PFA er en alvorlig fare for sundheden. Det er en skadelig, ætsende lokalirriterende og pulveret skal forhindres i at komme i kontakt med hud, øjne og lunger. Anvend personlig beskyttelsesdragt og et stinkskab samtidig forbereder løsningen. Når det er en 4% opløsning, handsker, øjenbeskyttelse og en kittel skal bæres.
          BEMÆRK: Det er vigtigt at få de embryoner i fix hurtigt på bedst bevare mRNA integritet.
      3. Fjernelse af barrierer før wholemount in situ hybridisering.
        BEMÆRK: Barrierer er fjernet, fordi de er skarpe og kan skade fostre, når de går gennem in situ hybridisering protokol, især hvis flere embryoner er plettet på en gang.
        1. Efter fiksering, placere embryo i en skål af PBS under en kikkert microscope.
        2. Brug to par nr 5 microforceps placere venstre par nøje hver side af barrieren i den opererede side af fosteret. Tag fat i barrieren med de rigtige par og træk forsigtigt barrieren fra foster ved hjælp af den venstre parret at holde fosteret ned og forhindre væv fra at tilslutte sig barriere, som det er fjernet.
      4. Udfør WISH væsentlige som beskrevet i 11.

Representative Results

Protokollen beskrevet ovenfor beskriver metoder, der anvendes i Nishimoto et al. 2015. Papiret studerer lemmer opløbet induktion og indvielse i både for- og bagben af ​​chick embryo. Resultater efter indsættelse af impermeable barrierer til at forhindre udvæksten af forben knop er tidligere blevet publiceret 1, 2, 9, men der har kun været én undersøgelse beskriver barrierer, der forhindrer ben knop initiering 1. Bagben data fra Nishimoto et al. 2015 præsenteres her som repræsentative resultater af undersøgelsen af ​​mRNA-ekspression følgende barriere indsættelse.

Tbx4 ​​Expression i LPM er ikke tilstrækkeligt Igangsætte bagben Udvækst:
Figurerne 2B og C (tabel 2) viser, at barriere insertion i trin 15 (figur 2A) (se protokol 3.2) fører til både Fgf10og FGF8-ekspression er fraværende i benet knop region (angivet med beslag) på den opererede højre side. Sammenligne med den ikke-opererede venstre side. Imidlertid er Tbx4 ekspression observeret ved både trin 19 og trin 23 på den opererede side (figur 2D og E). Vi konkluderer, at Tbx4 udtryk alene ikke er tilstrækkelig til at initiere bagben udvækst fra LPM. Andre undersøgelser i chick har antydet, at TBX genekspression er tilstrækkelig til at initiere forben bud formation 12, 13.

Figur 2C 'er medtaget for at illustrere, hvordan en barriere ser indlejret i benet område af embryo efter fiksering. I de fleste tilfælde barrierer blev fjernet før in situ-hybridisering (protokol 4.3).

RA fra somitter er afgørende i LPM før Fgf10 inducerer Limb Bud Outgrowth:
Figur 3A er en skematisk repræsenterer tilføjelsen af en RA gennemblødt vulst distalt til en dæmning indsat på trin 15 (protokol 3.2.1.3). Efter denne operation knop lemmer udvækst (angivet med en asterisk) er observeret på den opererede højre side og Tbx4, Fgf10 og FGF8 udtrykkes i fødslen, som de er i kontrollen venstre side (figur 3B, C og D, Tabel 2) . tilsætning af RA til LPM overvinder således effekten af ​​opløbet initiation provenuet barriere og lemmer. Vi konkluderer, at i normal udvikling RA fra somitter er afgørende i LPM før knop lemmer udvækst kan initieres. De resulterende bagbenenes knopper er generelt mindre end dem på kontrolsiden. Dette kan skyldes RA dosis i LPM er ikke ækvivalent med vildtype-situationen. Hvis RA dosis er for høj den apikale ectodermal Ridge (AER) kan afkortes og mindre knopper ville resultere14, 15.

At bekræfte, at RA (fra somitter) i LPM er påkrævet for normal bud lemmer initiering en invers agonist af RAR, BMS 493, blev anvendt. Perler implanteres i benet region LPM i trin 15 (se protokol 3.2.1.4) (figur 3E). Fgf10 ekspression nedreguleres efter applikation af BMS 493 perler i LPM, hvilket resulterer i mindre bagbenenes knopper sammenlignet med kontrollen side (figur 3F, tabel 3). Kontrol DMSO perler forårsager ikke disse defekter (figurerne 3G og 3H, tabel 3). De fejl observeret efter BMS 493 ansøgning er mildere end dem, der fremkaldes af en barriere operation; dvs Fgf10 stadig udtrykt og Lemanlæggene dannes. Dette vil sandsynligvis være fordi virkningerne af BMS 493 er begrænset lokalt omkring perlerne og er måske ikke i stand til at antagonisere alle RA produceret af axial væv.

Tidlig Axial Signaler Angiv de LPM Celler, Senere Express Tbx4:
Vi testede da LPM erhverver sin evne til at udtrykke Tbx4 i prospektive ben-dannende region. Det tidligste tidspunkt, hvor en barriere kan indsættes, som efterfølgende vil blokere ben opløbet udvækst, er stadie 10. Vi er de første til at udvikle en protokol til at indsætte barrierer på etaper tidligere end stadie 12. Barrierer indsat mellem akseparallelle mesoderm og den formodede ben LPM i trin 10 (se protokol 3.4) knop-dannelse blok ben og ekspressionen af Tbx4 i benet-dannende LPM (fig 2F og 2G, tabel 2), hvilket antyder, at et signal fra aksiale væv ved trin 10 er påkrævet for senere ekspression af Tbx4 i bagben LPM. Sammenlign dette resultat med figurerne 2D og E hvor senere barriere tilføjelse muliggør Tbx4 ekspressionder skal etableres. Desuden testede vi, om denne aksiale signal kunne være RA ved at observere, om den omvendte agonist af RAR reducerer Tbx4 ekspression. En BMS 493 perle placeret i bagbenet LPM på trin 10 (se protokol 3.4.1.3) nedregulerer Tbx4 udtryk (figur 2H og 2i), mens kontrol-perler gennemvædet med DMSO ikke påvirker Tbx4 udtryk (figur 2J og 2K). Tilsammen understøtter disse resultater en model, et RA signal fra aksiale væv regulerer lemmer induktion ved positivt at regulere Tbx4 i bagbenet LPM 7.

Postoperativ Død:
Tabel 1, 2 og 3 give nærmere oplysninger om eksperimentelle resultater, herunder antallet af chick embryoner, der døde efter operation og før høsten. Nogle dødsfald kan forventes efter mikrokirurgi af denne art. Numrene døende kan holdes til et minimum ved at sikre, at instrumenterne er rene, hullet i ægget er mindstestørrelse den krævede, at embryonerne tilbage uden beskyttelse af tape segl i minimum tid og sammen med det sidste punkt, at operationen udføres så hurtigt som muligt. Ingen af ​​disse operationer er meget tidskrævende, men operationer, der indebærer perler og barrierer tage lidt mere tid. På trods af disse foranstaltninger, der udføres i de tidligste stadier, og dem i fløjen regionen er mere tilbøjelige til at resultere i dødsfald. Der er store blodkar omkring lemmer-dannende regioner og utilsigtet brud på disse fartøjer kan føre til dødsfald på grund af blodtab. Vi finder, at æggene åbnet på trin 8 eller 9, hvis fostre er ikke blevet opereret, vil ofte dø ved den næste dag. Derfor er den eneste løsning på disse problemer er at udføre et stort antal forsøg.

d / 54.618 / 54618fig2.jpg "/>
Figur 2. Marker genekspression Ændringer efter Barrier eller Bead Indsættelse på Antageligt Leg niveau. (A) Skematisk viser barriere position (grøn linje) på de formodede ben niveau (somitter 26-32) i en scene 15 embryo. (B - E og G) WISH analyse på betjente embryoner. Benet region er skitseret (parentes). (B) Fgf10 udtryk er fraværende i det opererede LPM, men robust udtryk detekteres i venstre opløbet. (C) FGF8-ekspression er fraværende i den opererede side, tyder der ingen AER. (C) Den samme embryo før barrieren blev fjernet. (D) Tbx4 udtrykkes i LPM på samme Rostro-caudale niveau som kontrol opløbet. (E) Tbx4 ekspression bevares i højre ben region trods fravær af vækst lemmer. (F) Skematisk diagram af en fase 10 chick embryo viser barriere position (grøn linje) på den formodede ben niveau. (G) Tbx4 udtryk er fraværende i den opererede højre LPM (beslag). (H) Skematisk diagram af en fase 10 chick embryo viser BMS 493 bead position (lilla cirkel) ved den formodede ben niveau. (I) Tbx4 ekspression nedreguleres på den opererede højre side efter behandling med BMS 493. (J) Skematisk diagram af en fase 10 chick embryo viser kontrol DMSO bead position (grå cirkel). (K) Tbx4 udtrykkes på den opererede højre side på et tilsvarende niveau som kontrollen venstre side efter behandling med DMSO alene. Dette tal er blevet ændret fra 7. Klik her for at se en større version af dette tal.

d / 54.618 / 54618fig3.jpg "/>
Figur 3. RA Rescues Limb Bud fravær forårsaget af Barrier Indsættelse og er afgørende i LPM Før Leg Bud Udvækst. (A) Skematisk diagram angiver barriere position (grøn linje) på den formodede ben niveau (somitter 26-32) og en RA-gennemblødt perle (rød cirkel). (B - D) RA redninger ben opløbet udvækst (vist med en stjerne). (B) Tbx4 udtryk er til stede i den reddede ben opløbet ligner den un-opererede side. (C) Fgf10 udtrykkes i den reddede ben opløbet svarer til un-opererede side. (D) FGF8 udtrykkes i AER den reddet højre ben opløbet. (E) Skematisk viser, hvor BMS 493 perler (lilla cirkler) blev placeret i den formodede ben LPM af stage 15 embryoner. (F) Fgf10 ekspression nedreguleres på den opererede højre side og benet knop er lille følgende BMS 493 behandling. Perler er mærket med en stjerne. (G) Lignende skematisk til (E), hvilket indikerer positionen af kontrol- DMSO perler (grå cirkler). (H) DMSO perler (vist med en asterisk) påvirkede ikke Fgf10 udtryk eller ben opløbet størrelse. Dette tal er blevet ændret fra 7. Klik her for at se en større version af dette tal.

Stage barriere placeret (+ perle) * Nummer drives Wing mangler ** Wing nuværende ** Antal døde
Stage 12-14 40 24 1 15
Stage 8/9 65 23 0 42
Stage 12-13 (FGF4 perle) 41 7 (perle mangler) 17 17
Stage 12-13 (RA perle) 75 9 (perle mangler) 32 34
Stage 13 (kontrol perle) 5 3 0 2
* 0,7-1 mm folie barrierer anbragt mellem somitter 15-20 og den laterale plade mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05-0,1 mg / ml RA perle.
DMSO kontrol perle.
** Kyllingeembryoer faste faser 21-23

Tabel 1. Wing Level Barrier og Bead Experiment Resultater.

Stage barriere placeret (+ perle) * Nummer drives Leg mangler ** Leg nuværende ** Antal døde
Stage 12-15 43 39 0 4
Stage 10/11 23 16 0 7
Stage 15 (FGF4 perle) 8 0 5 3
Stage 15 (RA perle) 18 0 18 0
* 0,7-1,3 mm folie barrierer anbragt mellem somitter 26-32 og den laterale plade mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05-0,1 mg / ml RA perle.
** Chick embryoner faste trin 18-24

Tabel 2. Ben Level Barrier og Bead Experiment Resultater.

Nummer drives Leg opløbet små Leg opløbet lidt lille Leg opløbet normale størrelse Antal døde
BMS 493 perler *
15 12 3 0 0
DMSO perler **
12 0 3 9 0
* 2-3 perler gennemvædet i 5 mg / ml BMS 493 monteres i den rigtige fase 14-15 LPM på benet niveau.
** 2-3 perler gennemvædet med DMSO alene placeret i den rigtige fase 15 LPM på benet niveau.
Chick embryoner fastsat til trin 17-19.

Tabel 3. Leg Level BMS 493 Bead Experiment Resultater.

Discussion

Vi beskriver anvendelsen af ​​impermeable barrierer til at forhindre lemmer knop dannelse i chick embryo. Denne teknik har en række kritiske trin. Efter indledende forsøg fandt vi, at hængslet formede barrierer, der anvendes i 9, 10, forbliver på plads i embryoet langt bedre end lige barrierer. Den distale flade side af barrieren klæber til vitellinmembranen og holder barrieren på plads (figur 2C). Omhyggelig forberedelse af hængsel formede barrierer fra aluminiumsfolie, som beskrevet i protokol trin 1.6 er afgørende for succesen af ​​operationen. Et andet vigtigt skridt er at sikre, at æg ikke efterlades ud af kuvøsen for længe efter vinduesystemet og iscenesættelse før betjening på fosteret. Det er vores erfaring, embryoner overleve en operation bedre, hvis de er på eller nær inkubationstemperatur når operationen udføres. Operationer bør derfor udføres så hurtigt som muligt og æggene genforseglet promptly at sikre gode overlevelsesrater. Mange forskere tilføje en dråbe af antibiotika til embryo efter mikrokirurgi før han vendte tilbage æggene til inkubatoren. Tilstedeværelsen af ​​væsken forhindret barriererne klistrer godt i position. Tilsætning af antibiotika kan også løsne perler efter placering. anbefales derfor ikke at bruge antibiotika, hurtige operationer og god renlighed med instrumenter for at undgå infektion. Aftørring instrumenter med 70% ethanol efter hvert trin af en operation er afgørende for at forhindre, at instrumenter bliver klistret fra kontakt med vitellinmembranen som kan forårsage både barrierer eller perler til at overholde pincet (se protokol trin 3.1.2.2). Begge sorter af perler, der anvendes kan falde ud af sted efter operationen. Når barrieren holdning blev kontrolleret den næste dag var det ikke muligt at se gennem barrieren for at fastslå, om perlen forblev på plads eller ej. I tilfælde, hvor perlen var faldet ud var fløj opløbet udvækst ikke reddet (

Denne protokol ændrer tidligere publicerede eksperimenter, brugte barrierer for at forhindre lemmer opløbet initiering, definerer specifikke optimale bredder for barrierer og indfører kombinere barriere og perle placering efterfulgt af genekspression analyse. Vi fandt anvendelse af konventionel aluminiumsfolie, som er billig og let tilgængelige i alle laboratorier, producerer resultater svarende til dem, der tidligere er benyttet tantal folie. Folien kan efterlades i embryoet, når de udfører in situ hybridisering (Figur 2C), men vi normalt fjerne det, hvis mere end ét embryon er under behandling for at forhindre de skarpe kanter af folien skade fostre. PIlot undersøgelser viste, at bredden af ​​benet region barrierer er særlig vigtig. Oprindeligt barriererne prøvelicens var for kort, og ben opløbet udvækst blev ikke forhindret. 1,2-1,3 mm er den optimale bredde for en barriere for at blokere ben opløbet udvækst helt. De smalleste fløj barrierer, som man kan placere præcist at forhindre opløbet udvækst giver de bedste overlevelsesrater. Dette kan være så smal som 0,5-0,7 mm. Men barrierer, der er lidt bredere er mere tilbøjelige til at resultere i fuldstændig blokering af fløj opløbet udvækst, fordi de giver mulighed for en lille unøjagtighed af anbringelserne (vi brugte 0,7-1 mm). Undgåelse af blodkar når de foretager indsnit er kritisk for fløj knop niveau barrierer. Semipermeable barrierer er tidligere blevet anvendt til at gennemskære opløbet chick lem. MacCabe og Parker, 1976 og Summerbell, 1979 begge anvendte filtre 0,45 um og 0,8 um porestørrelse, henholdsvis 16, 17. De rapporterede, at diffunderbare signaler kan passere gennem porerne i filtrene, og atresultater opnået ved hjælp af semi-gennemtrængelige barrierer var midtvejs mellem et lem knop med ingen hindring nuværende og én med et uigennemtrængeligt tantal folie barriere. Denne protokol kan tilpasses til anvendelse semipermeable barrierer af varierende porestørrelse for at differentiere kandidat signaler baseret på størrelse eller ændre dynamikken i signal diffusion.

Denne protokol har forskellige begrænsninger primært forbundet med model organisme selv. Sådanne teknikker kan bruges til at undersøge yderligere spørgsmål i udvikling lemmer og også andre spørgsmål hvirveldyr embryogenese. En forudsætning er, at organet / pågældende område skal udvikle når chick embryo er tilgængelig for intervention. Tilstedeværelsen af ​​store blodkar i det område, hvor en barriere skal placeres gør barriere placering senest stadium 13 eller 14 teknisk udfordrende. Hvis store blodkar er skåret under barriere placering dette kan medføre embryo dødelighed. Vores undersøgelse af, når transkriptionsfaktorer TBX5 og Tbx4 først induceret i LPM var begrænset af den tidligste fase, hvor vi kunne placere en barriere, der senere ville ende modsatte enten vingen eller ben opløbet henholdsvis. Det kunne oplysende at forsøge at blokere TBX gen induktion på tidligere stadier, tættere på gastrulation. Den tidligste en barriere kunne placeres i den formodede fløj region held var etape 8 og i benet regionen fase 10. Denne protokol er formentlig ikke egnet til undersøgelse af genekspression ud bud lemmer stadier fordi efterfølgende hurtig vækst ville forskyde barriere og resultater ville kun vedrøre den oprindelige position af barrieren.

Efter at have forbundet de begrænsninger af kyllingefosteret i denne forbindelse, dens fordele frem for andre hvirveldyr modelorganismer er mange. Kyllingefosteret er en meget velegnet dyremodel for denne form for fysisk indgriben i et hvirveldyr embryo. De embryoner er relativt store og er let tilgængelige through æggeskallen. Man kan vende tilbage til embryo til yderligere eksperimenter (f.eks, fjernelse af en vulst 18 eller endda en barriere) eller for at kontrollere om fremskridt ved blot at fjerne vinduet tape. Der er muligt anvendelsesområde til at omfatte direkte billedvisning eller tid bortfalder billeddannelse. Vi beskriver en fremgangsmåde til windowing hønseæg, der er særligt egnet til drift på embryoer tidligt. I tilfælde af lemmer undersøgelser er det meget vigtigt og nyttigt, at der er en kontralateral kontrol lemmer for hver eksperiment, der fungerer som en ideel intern kontrol for hver biologisk replikat.

Kombinationen af ​​at bruge uigennemtrængelige barrierer for at forhindre lemmer udvækst og perler dyppet i signalmolekyler er ikke blevet rapporteret før. Vores analyse af mRNA-ekspression efter sådanne indgreb er også hidtil ukendt. Disse teknikker muligt for os at dissekere det vanskelige problem med når lemmer specifik transskription faktorer Tbx5 og Tbx4 induceres i LPM og ogsåat vise, at senere, før lemmer knop initiering, tilstedeværelsen af disse TBX gener i LPM er ikke tilstrækkelig for aktiveringen af Fgf10 transkription og starten af lem-knoppen udvækst. Figurerne 2G, 2D og 2E illustrerer disse resultater godt. Fraværet af Tbx4 ekspression efter indsættelse af en barriere på trin 10 i figur 2G er i skarp kontrast til sin tilstedeværelse i 2D og 2E følgende barriere insertion i trin 15, efter induktionen af Tbx4. Implantation af RA gennemblødt perler lettet redningen af ​​lemmer opløbet indledning efter barriere indsættelse og så peger på RA fra somitter bliver afgørende i LPM før opløbet lemmer udvækst kan begynde. Sådanne teknikker kan bruges til at løse yderligere spørgsmål i udviklingen lemmer, men også andre spørgsmål om hvirveldyr embryogenese. Områder af hjernen, øjet og stammen vil sandsynligvis være egnede.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11241-30
Dumont strong forceps, type AA Fine Science Tools  www.finescience.de 11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long Fine Science Tools  www.finescience.de 14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long Fine Science Tools www.finescience.de 11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide Fine Science Tools  www.finescience.de 26002-20
Sharpening stone, square Fine Science Tools  www.finescience.de 29008-01
Mineral oil
Needle holder Fine Science Tools  www.finescience.de 26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m www.5staroffice.com 295985
FGF4 protein A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid Sigma www.sigmaaldrich.com R2625-50MG Remember to protect from light.
BMS 493 Sigma www.sigmaaldrich.com B6688-5MG
Scalpel blade No. 15 www.swann-morton.com cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel Bio-Rad www.bio-rad.com 153-7301 Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin Bio-Rad www.bio-rad.com 140-1251 Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs Memmert www.hce-uk.com LAB128
Paraformaldehyde (PFA) Sigma www.sigmaaldrich.com P6148-1KG Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol Sigma www.sigmaaldrich.com 32221-2.5L
DMEM, high glucose Gibco www.thermofisher.com 41965-039 500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific webshop.fishersci.com D/4121/PB08 500 ml
Binocular Microscope  Leica www.leica-microsystems.com MZ6 Replaced by M60
Chicken eggs Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com Brown Eggs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62, (1), 80-103 (1965).
  2. Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126, (2), 127-149 (1969).
  3. Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268, (26), 3183-3186 (1969).
  4. Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23, (1), 109-151 (1970).
  5. Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142, (2), 542-555 (1984).
  6. Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80, (5), 739-746 (1995).
  7. Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12, (5), 879-891 (2015).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, (1), 49-92 (1951).
  9. Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
  10. Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27, (2), 159-167 (1983).
  11. Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, (7), 1401-1416 (1993).
  12. Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129, (22), 5161-5170 (2002).
  13. Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130, (12), 2729-2739 (2003).
  14. Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
  15. Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106, (4), 691-705 (1989).
  16. MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54, (2), 297-303 (1976).
  17. Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
  18. Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100, (4), 723-733 (1987).
Anvendelse af impermeable barrierer Kombineret med Candidate Factor Soaked Perler til at studere Induktive Signaler i Chick
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).More

Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter