Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.
鸡胚提供了可用于解剖直接的方式发展的问题,一个极好的脊椎动物模型。它的可访问性和健壮性以下外科干预是关键的实验优势。云母板是用来防止小鸡肢芽开始1第一障碍。使用铝箔作为防渗屏障翅芽或腿芽诱导和或启动协议描述。我们与珠放置横向这种技术结合了障碍外生已封锁的壁垒供应候选人内生因素。结果是使用在随后的基因表达的原位杂交分析。我们的主要焦点是在诱导和维甲酸信号鸡胚前后肢和后来萌生的作用。我们使用的BMS 493(视黄酸受体的反向激动剂(RAR))在侧板中胚层(LPM)注入浸泡珠以模仿杆的作用垒放置在体节(视黄酸源(RA)),并从该肢芽生长LPM之间。这些协议的修改版本也可以使用,以解决对感应线索的起源和定时的其他问题。提供的鸡胚的区域是在有关发育阶段访问,阻挡可以被放置在两个组织中的发展随之变化研究之间。实例可以在脑发育,轴延伸和在器官发育中找到,如肝脏或肾脏的诱导。
古典传统的胚胎学家采用物理技术审问控制胚胎发育的机制。在20世纪60年代和70年代,研究人员开发出了用于插入胚胎发育的组织之间的胚胎发育过程中表现出的感应信号的重要性防渗屏障技术。我们的兴趣是在脊椎动物肢体发育,特别是什么事件之前肢芽生长。例如,阻挡插入可以防止肢芽生长从鸡胚的一侧发生,同时使其上的对侧,腭裂侧正常进行。用于制造这些障碍不同的材料;例如,云母板1和钽箔2。这些障碍有效分离的侧板中胚层(LPM),从该肢芽形成,从体节从近轴中胚层形成。外科移植技术证明,密切联系机智h如果肢芽开始在LPM 3 4要发生的体节是必不可少的。在80年代和90年代,发育生物学家发现扩散的信号是在控制发育过程中必不可少的分子。与这些信号分子浸泡珠可在胚胎的特定区域被植入并产生改变胚胎发育。例如,当植入到鸡胚和可产生的位5镜像复制通过离子交换珠粒溶于视黄酸(RA)被释放,在24小时内。含FGF蛋白质肝素压克力珠可以从interlimb LPM 6发起肢芽生长。
最近,鼠标和鱼类遗传学采取脊椎动物肢体发起的研究进入一个新的时代(7审查)。有足够的证据表明存在于前肢芽萌生体节RA是由LP所需的基本扩散信号M键启动肢体萌芽。我们希望利用鸡胚的可访问性和鲁棒性实验解剖围绕肢芽开始时的LPM屏障植入对基因表达的影响。我们的方法的小说改编是一个屏障相结合,从与珠横向放置的障碍已被封锁的壁垒外生供给的候选人内生因素的轴向组织块的信号。以下协议是那些发展梳理出肢芽诱导和引发的机制。
研究肢芽萌生指利用早期胚胎。许多研究者窗口鸡卵由第一至气囊用皮下注射针除去一些白蛋白。胚胎,它坐落在蛋黄上面,然后将趴在低蛋。这对于某些技术,如电穿孔的优点,但如果胚胎的手术操作需要可以是一个缺点。我们发现有胚胎接近鸡蛋开幕尽可能是一个优势。
问题依然是关于控制脊椎动物肢芽诱导和启动信号和下面的协议适用于解决这些问题。我们是第一个制定的障碍插入,以防止鸡肢芽生长在早于12阶段8阶段的协议。这些协议的修改版本也可以使用,以解决对起源和电感线索定时其它问题,其中,向所述原基被感应的访问的诱导组织位于相邻。所提供的胚胎的区域是在相关的发育阶段访问,则阻挡可以被放置在两个组织中的发展随之变化研究之间。例如可以在大脑发育,轴延伸和可能的器官发育找到,如肝脏或肾脏感应。
我们描述了使用的不可渗透屏障,以防止在鸡胚肢芽形成。该技术具有若干关键的步骤。以下初步实验中,我们发现,在9中使用的铰链形状的障碍,10保持就位在胚胎远比直障碍更好。阻挡的远侧平面侧粘到卵黄膜,并保持就位( 图2C')的屏障。从作为协议的步骤描述1.6铝箔铰链形障碍精心准备是手术成功的关键。第二个重要的步骤是确保鸡蛋不会被排除在外的孵化时间过长以下窗口和之前对胚胎操作分期。在我们的经验,胚胎存活,如果他们是在或接近培养温度时操作被执行的操作更好。操作因此应尽可能迅速地进行,并且鸡蛋重新密封提示LY以确保良好的存活率。许多研究者抗生素滴添加至胚胎返回鸡蛋孵化之前以下显微。液体的存在下从位置粘附以及阻止的障碍。抗生素的添加也可以放置后打跑珠。因此,不使用抗生素,迅速行动,并与仪表整洁良好的建议,以避免感染。擦拭用70%乙醇文书以下的操作的每一个阶段是必须防止文书成为从与卵黄膜可引起两个屏障或珠粘附到镊子(见协议步骤3.1.2.2)接触粘。这两个品种的使用珠子可能掉出的操作下列的地方。当阻挡位置被检查,第二天这是不可能通过屏障看,以确定胎圈是否仍然存在与否。在珠已经降到了案件翅芽生长没有被救出( <st荣>表1)。避免植入时将它们转移液体与珠意味着珠粘更容易向LPM的切割面(见协议2.3.2.3)。最后,确保胚胎固定后,立即收获是良好的后续基因表达分析的关键(见协议的步骤4.2)。
该协议将修改此前公布的实验中所使用的障碍,防止肢芽开始,具体的定义最适用于宽度障碍和介绍相结合的屏障及胎圈的位置后基因表达分析。我们发现使用传统的铝箔,这是价格便宜,在所有实验室一应俱全,产生的结果等同于以前使用钽箔。箔片可在胚胎原位杂交( 图2C')进行时,可以离开,但如果被处理多于一个的胚胎以防止箔片损坏胚胎的锋利的边缘,我们通常将其删除。 Pilot研究表明的腿部区域的障碍的宽度是特别重要的。最初试用过障碍太短,不妨碍腿部芽生长。 1.2-1.3毫米为屏障完全阻挡腿芽生长的最佳宽度。一个可以精确地放置最窄翼屏障以防止芽生长提供最佳的存活率。这可能是为0.5-0.7毫米窄。然而,这是一个小更宽障碍更可能导致翼芽生长的完全阻断,因为它们允许用于放置的一个小的误差(我们使用0.7-1毫米)。血管时避免使切口是翅芽水平壁垒的关键。半透障碍已使用过平分小鸡肢芽。 MacCabe和帕克,1976年和Summerbell,1979年都使用过滤器0.45微米和0.8微米孔径,分别为16,17,他们报告说,扩散的信号可以通过在过滤器和毛孔结果使用半透障碍是一肢芽,无阻挡本和一个用不渗透的钽箔屏障之间中途获得的。这个协议可以适于使用不同的孔径大小的半渗透屏障来区分基于尺寸或修改信号的扩散的动力学候补信号。
该协议主要有与模型生物体本身相关的各种限制。这种技术可用于探测在肢体发育进一步的问题,并且也脊椎动物胚胎发生的其他问题。一个条件是,当鸡胚是干预访问有问题的器官/地区应发展。大血管中,其中的阻挡需要放置的区域的存在使得屏障放置比阶段13或14的技术上的挑战后。如果大血管屏障放置过程中削减这可能会导致胚胎死亡。我们在转录因子T的调查BX5和TBX4在LPM首先诱导是由在此,我们可以放置一个屏障,后来分别结束了相反无论是翼或腿芽的最早阶段的限制。它可以照亮试图在早期阶段,更接近原肠阻塞TBX基因诱导。最早的一个屏障可以被放置在该推定翼区域成功是级8和腿部区域级10该协议可能是不适合的基因表达以外肢芽阶段研究,因为随后的快速增长将取代屏障和结果将仅涉及到阻挡的初始位置。
具有相关的在此上下文中鸡胚的限制,它的优点在其它脊椎动物模型生物体是很多的。鸡胚是一种用于在脊椎动物胚胎这种类型的物理干预一个非常合适的动物模型。胚胎是比较大的,而且THROU方便GH蛋壳。可以返回到胚胎用于进一步的实验( 例如,去除一个珠18或甚至一个屏障),或通过简单地移除胶带窗口检查进展情况。有可能的范围,使其包括实时成像或延时成像。我们描述了窗口化鸡卵是特别适合于在早期胚胎操作的方法。肢体的研究的情况下,这是非常重要的和有益的,有对每个在作为理想的内部控制为每个生物复制实验一对侧控制肢体。
使用不可渗透屏障防止肢体向外生长和珠子在信号分子中浸泡的组合以前尚未报道。我们的基因表达的这种干预的分析也是小说。这些技术使我们能够解剖时肢体特异性转录因子Tbx5中和TBX4诱导的LPM,也是难的问题表明以后,前肢芽开始,在LPM这些TBX基因的存在不足以FGF10转录的激活和肢芽生长的开始。 图2G,2D和2E说明了这些研究结果良好。阻挡的在阶段10, 如图2G的插入以下的情况下TBX4表达的是在阶段15形成鲜明对比,其在2D和2E存在以下屏障插入,TBX4诱导后。 RA的浸泡珠植入促进肢芽萌生以下屏障插入和从体节是在LPM之前必不可少的肢芽生长就可以开始这么点RA救援。可以使用这种技术来解决肢体发育进一步的问题,也是脊椎动物胚胎发育的其他问题。脑,眼和躯干的区域很可能是合适的。
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.
Dumont No.5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
Dumont No.4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
Blunt ended curved forceps, | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
ends approx 0.5 cm long | |||
Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
Mineral oil | |||
Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500ml |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500ml |
Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |