Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.
लड़की भ्रूण एक शानदार कशेरुकी मॉडल है कि एक सीधे रास्ते में विकासात्मक सवाल काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसकी पहुंच और मजबूती शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप निम्न कुंजी प्रयोगात्मक ताकत हैं। मीका प्लेटों पहली लड़की अंग कली दीक्षा 1 रोकने के लिए इस्तेमाल बाधाओं थे। प्रोटोकॉल है कि दक्षिणपंथी कली या पैर कली प्रेरण और या दीक्षा के लिए एक अभेद्य अवरोध के रूप में एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग वर्णित हैं। हम आपूर्ति उम्मीदवार अंतर्जात कारक है कि बाधा द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया है exogenously के लिए बाधा को मनका प्लेसमेंट के पार्श्व के साथ इस तकनीक गठबंधन। परिणाम बाद में जीन अभिव्यक्ति की स्वस्थानी संकरण में उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। हमारा मुख्य ध्यान प्रेरण में retinoic एसिड संकेतन और लड़की भ्रूण सामने और hindlimb के बाद दीक्षा की भूमिका पर है। हम बीएमएस 493 का उपयोग करें (retinoic एसिड रिसेप्टर्स की एक उलटा एगोनिस्ट (RAR)) लथपथ पार्श्व प्लेट mesoderm (LPM) में प्रत्यारोपित मोती एक बार के प्रभाव की नकल करने के लिएrier somites (retinoic एसिड का एक स्रोत (आरए)) और LPM से अंग कलियों बढ़ने के बीच रखा। इन प्रोटोकॉल का संशोधित संस्करण भी मूल और प्रेरक संकेतों के समय पर अन्य प्रश्न के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परंतु लड़की भ्रूण के क्षेत्र प्रासंगिक विकास के चरण में पहुँचा जा सकता है, एक बाधा दो ऊतकों और विकास में परिणामी परिवर्तन का अध्ययन बीच में रखा जा सकता है। उदाहरण ऐसे जिगर या गुर्दे की प्रेरण के रूप में, विकासशील मस्तिष्क, एक्सिस विस्तार में और अंग विकास में पाया जा सकता है।
शास्त्रीय embryologists पारंपरिक रूप से तंत्र भ्रूण के विकास को नियंत्रित करने से पूछताछ करने के भौतिक तकनीक कार्यरत हैं। 1960 के दशक और 1970 के दशक में जांचकर्ताओं तकनीक है कि विकासशील भ्रूण के ऊतकों के बीच डाला embryogenesis दौरान प्रेरक संकेतों के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए अभेद्य अवरोध का उपयोग किया विकसित की है। हमारे हित कशेरुकी अंग विकास में और विशेष रूप से है क्या घटनाओं पूर्व में होना अंग कली परिणाम। उदाहरण के लिए, एक बाधा की प्रविष्टि लड़की भ्रूण के एक तरफ से होने वाली है, जबकि यह सामान्य रूप से contralateral, unoperated पक्ष पर आगे बढ़ने के लिए इजाजत देने से अंग कली परिणाम रोका जा सकता है। इन बाधाओं को विविध बनाने के लिए इस्तेमाल सामग्री, उदाहरण के लिए, अभ्रक प्लेटों 1 और टैंटलम पन्नी 2। इन बाधाओं को प्रभावी ढंग से पार्श्व प्लेट mesoderm (LPM), अंग कली रूपों, somites से paraxial mesoderm से गठित जिसमें से अलग। सर्जिकल ग्राफ्टिंग तकनीक है कि निकट सहयोग से बुद्धि का प्रदर्शनज somites यदि अंग कली दीक्षा LPM 3 4 में होने के लिए आवश्यक है। 80 और 90 के दशक में विकासात्मक जीव अणुओं है कि विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करने में आवश्यक हैं संकेत प्रसारण की खोज की। इन संकेतन अणुओं से लथपथ मोती भ्रूण के विशिष्ट क्षेत्रों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और भ्रूण विकास के लिए परिवर्तन का उत्पादन। उदाहरण के लिए, retinoic एसिड (आरए) आयन एक्सचेंज मोती द्वारा हाथ में लिया है जब एक लड़की भ्रूण में प्रत्यारोपित और अंक 5 का दर्पण छवि दोहराव उत्पादन कर सकते हैं एक 24 घंटे की अवधि में जारी की है। हेपरिन एक्रिलिक FGF प्रोटीन युक्त मोती interlimb LPM 6 से अंग कली परिणाम आरंभ कर सकते हैं।
अभी हाल ही में माउस और मछली आनुवंशिकी एक नए युग (7 में समीक्षा) में कशेरुकी अंग दीक्षा के अध्ययन के लिए ले लिया है। अच्छा सबूत है कि somites अंग कली दीक्षा के लिए पूर्व में आरए उपस्थित आवश्यक प्रसारण संकेत एल.पी. द्वारा अपेक्षित है नहीं हैएम अंग नवोदित आरंभ करने के लिए। हम अंग कली दीक्षा के समय के आसपास LPM में जीन की अभिव्यक्ति पर बाधा आरोपण के प्रभाव काटना पहुँचा और लड़की भ्रूण की प्रयोगात्मक मजबूती का फायदा उठाने के लिए करना चाहता था। हमारे पद्धति का एक उपन्यास अनुकूलन एक बाधा गठबंधन करने के लिए है कि exogenously आपूर्ति उम्मीदवार अंतर्जात कारक है कि बाधा द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया है, के लिए बाधा मनका प्लेसमेंट के पार्श्व के साथ अक्षीय ऊतकों से ब्लॉकों का संकेत है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अंग कली प्रेरण और दीक्षा के तंत्र बाहर तंग करने के लिए विकसित होते हैं।
के अध्ययन के अंग कली दीक्षा प्रारंभिक चरण भ्रूण का प्रयोग होता है। पहले एक चमड़े के नीचे सुई के साथ हवा की थैली के माध्यम से एल्बुमिन से कुछ को हटाने से कई शोधकर्ताओं खिड़की चिकन अंडे। भ्रूण है, जो की जर्दी के शीर्ष पर स्थित है, तो अंडे में कम झूठ होगा। इस तरह के electroporation के रूप में कुछ तकनीक, के लिए एक फायदा है, लेकिन अगर भ्रूण की शल्य हेरफेर वांछित है एक नुकसान हो सकता है।हम भ्रूण के रूप में अंडे में खोलने के करीब होने लगता है संभव है एक फायदा है।
सवालों का संकेत है कि कशेरुकी अंग कली प्रेरण और दीक्षा नियंत्रण के बारे में रहते हैं और निम्नलिखित प्रोटोकॉल उन्हें संबोधित करने के लिए उपयुक्त हैं। हम पहले बाधाओं की प्रविष्टि चरण 12 8 से पहले एक मंच पर लड़की अंग कली परिणाम को रोकने के लिए के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए कर रहे हैं। इन प्रोटोकॉल का संशोधित संस्करण भी है, जहां एक सुलभ उत्प्रेरण के ऊतकों को उत्स प्रेरित किया जा रहा आसन्न निहित है उत्पत्ति और प्रेरक संकेतों के समय पर अन्य प्रश्न के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परंतु भ्रूण के क्षेत्र प्रासंगिक विकास के चरण में पहुँचा जा सकता है, तो एक बाधा दो ऊतकों और विकास में परिणामी परिवर्तन का अध्ययन बीच में रखा जा सकता है। उदाहरण ऐसे जिगर या गुर्दे की प्रेरण के रूप में मस्तिष्क के विकास, एक्सिस विस्तार और संभवतः अंग विकास में पाया जा सकता है।
हम अभेद्य बाधाओं का उपयोग लड़की भ्रूण में अंग कली गठन को रोकने का वर्णन है। इस तकनीक को महत्वपूर्ण कदम की एक संख्या है। प्रारंभिक प्रयोगों के बाद हमने पाया कि काज के आकार 9 में इस्तेमाल बाधाओं, 10 भ्रूण दूर सीधे बाधाओं की तुलना में बेहतर जगह में रहते हैं। बाधा के बाहर का फ्लैट की ओर पीतक झिल्ली करने के लिए लाठी और जगह (चित्रा -2 ') में बाधा रहती है। एल्यूमीनियम पन्नी प्रोटोकॉल 1.6 चरण में वर्णित के रूप में से काज के आकार बाधाओं में से सावधान तैयारी ऑपरेशन की सफलता के लिए आवश्यक है। एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम सुनिश्चित करने के लिए कि अंडे भी लंबे समय गवाक्षन निम्न और भ्रूण पर परिचालन करने से पहले मंचन के लिए इनक्यूबेटर से बाहर नहीं छोड़ रहे है। हमारे अनुभव में, भ्रूण एक ऑपरेशन बेहतर होगा अगर वे कम या ऊष्मायन तापमान के पास हैं जब ऑपरेशन किया जाता है जीवित रहते हैं। संचालन इसलिए जितनी जल्दी संभव हो बाहर किया जाना चाहिए और अंडे resealed शीघ्रLy अच्छा जीवित रहने की दर सुनिश्चित करने के लिए। कई शोधकर्ताओं इनक्यूबेटर अंडे लौटने से पहले निम्नलिखित microsurgery भ्रूण के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की एक बूंद जोड़ें। तरल की उपस्थिति की स्थिति में अच्छी तरह से चिपके से बाधाओं को रोका। एंटीबायोटिक के अलावा भी नियुक्ति के बाद मोती को बेदखल कर सकता है। इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं, स्विफ्ट संचालन और उपकरणों के साथ अच्छा साफ-सफाई का उपयोग नहीं कर संक्रमण से बचने के लिए सिफारिश की है। एक ऑपरेशन के हर चरण के बाद 70% इथेनॉल के साथ उपकरणों पोंछते पीतक झिल्ली जो दोनों अवरोध या मोती संदंश का पालन करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं (प्रोटोकॉल कदम 3.1.2.2 देखें) के साथ संपर्क में आने से चिपचिपा बनने से उपकरणों को रोकने के लिए आवश्यक है। इस्तेमाल किया मोतियों की दोनों किस्मों के आपरेशन के बाद जगह से बाहर गिर सकता है। जब बाधा स्थिति अगले दिन की जाँच की थी यह बाधा के माध्यम से देखने के लिए पता लगाने के लिए मनका जगह में है या नहीं बना रहा है कि क्या यह संभव नहीं था। मामलों में जहां मनका बाहर गिर गयी थी विंग कली परिणाम को बचाया नहीं गया था ( <stरोंग> 1 टेबल)। बचना मनका के साथ तरल स्थानांतरित जब उन्हें दाखिल मतलब यह है कि मोती LPM की कटौती सामना करने के लिए और अधिक आसानी से चिपके रहते हैं (प्रोटोकॉल 2.3.2.3 देखें)। अंत में यह सुनिश्चित करना भ्रूण तय कर रहे हैं कि तुरंत बाद कटाई अच्छा बाद जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है (प्रोटोकॉल 4.2 कदम देखें)।
इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रयोगों है कि अवरोध का उपयोग किया अंग कली दीक्षा को रोकने के लिए संशोधित करता है, बाधाओं के लिए विशिष्ट इष्टतम चौड़ाई परिभाषित करता है और संयोजन बाधा और मनका प्लेसमेंट के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के बाद का परिचय। हम पारंपरिक एल्यूमीनियम पन्नी, जो सस्ते और सभी प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध है का उपयोग कर पाया, उन है कि पहले से टैंटलम पन्नी इस्तेमाल करने के लिए बराबर परिणामों पैदा करता है। पन्नी भ्रूण में छोड़ा जा सकता है जब सीटू संकरण (चित्रा -2 ') में बाहर ले जा रहा है, लेकिन हम आम तौर पर इसे हटाने यदि एक से अधिक भ्रूण पन्नी को नुकसान पहुँचाए भ्रूण के तेज किनारों को रोकने के लिए कार्रवाई की जा रही है। पीilot अध्ययनों से दिखा दिया है कि पैर क्षेत्र बाधाओं की चौड़ाई विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। प्रारंभ में बाधाओं trialed भी कम थे और पैर की कली परिणाम रोका नहीं गया था। 1.2-1.3 मिमी पैर कली परिणाम पूरी तरह से ब्लॉक करने के लिए एक बाधा के लिए अधिकतम चौड़ाई है। सबसेसंकरेमें विंग बाधाओं है कि एक सही जगह कर सकते हैं कली परिणाम सबसे अच्छा जीवित रहने की दरों देने को रोकने के लिए। यह 0.5-0.7 मिमी के रूप में के रूप में संकीर्ण हो सकता है। हालांकि, बाधाओं है कि एक छोटे से व्यापक हैं (हम 0.7-1 मिमी) का इस्तेमाल किया और अधिक विंग कली परिणाम की पूरी अवरुद्ध में परिणाम है क्योंकि वे नियुक्ति के लिए एक छोटे से अशुद्धि के लिए अनुमति देने की संभावना है। रक्त वाहिकाओं से बचाव जब चीरा विंग कली स्तर बाधाओं के लिए महत्वपूर्ण है। अर्द्ध पारगम्य बाधाओं को पहले से लड़की अंग कली दोटूक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। MacCabe और पार्कर, 1976 और Summerbell, 1979 दोनों का इस्तेमाल किया फिल्टर 0.45 माइक्रोन और 0.8 माइक्रोन ताकना आकार क्रमश: 16, 17. उन्होंने बताया कि प्रसारण संकेतों फिल्टर में और उस छिद्रों के माध्यम से पारित कर सकता हैपरिणामों का उपयोग अर्द्ध पारगम्य बाधाओं को कोई बाधा वर्तमान और एक एक अभेद्य टैंटलम पन्नी बाधा के साथ साथ एक अंग कली के बीच बीच में थे प्राप्त की। इस प्रोटोकॉल के आकार पर या संकेत प्रसार की गतिशीलता को संशोधित करने के आधार पर उम्मीदवार संकेतों अंतर करने के लिए अलग-अलग छेद के आकार के अर्द्ध पारगम्य बाधाओं का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से मॉडल जीव के साथ ही जुड़े विभिन्न सीमाएँ हैं। इस तरह की तकनीक अंग विकास में आगे सवाल और भी कशेरुकी embryogenesis के अन्य सवालों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक प्रावधान है कि प्रश्न में अंग / क्षेत्र के विकास किया जाना चाहिए जब लड़की भ्रूण हस्तक्षेप करने के लिए सुलभ है। ऐसा क्षेत्र है जहां एक बाधा रखा जाना चाहिए में बड़े रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति चरण 13 या 14 से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बाधा प्लेसमेंट के बाद में आता है। बड़े रक्त वाहिकाओं बाधा प्लेसमेंट के दौरान काट रहे हैं, तो इस भ्रूण मृत्यु दर का कारण बन सकता है। जब प्रतिलेखन कारक टी की हमारी जांचbx5 और Tbx4 पहले LPM में प्रेरित कर रहे हैं जल्द से जल्द मंच है जिस पर हम एक बाधा है कि बाद में विपरीत या तो दक्षिणपंथी या पैर कली क्रमश खत्म होगा जगह सकता द्वारा सीमित था। यह पहले चरण, gastrulation के करीब पर TBX जीन प्रेरण ब्लॉक करने के लिए प्रयास करने के लिए रोशन किया जा सकता है। जल्द से जल्द एक बाधा के प्रकल्पित विंग क्षेत्र में रखा जा सकता है सफलतापूर्वक चरण 8 था और पैर क्षेत्र चरण 10 में इस प्रोटोकॉल की वजह से बाद में तेजी से विकास के लिए बाधा और परिणाम विस्थापित होगा शायद नहीं अंग कली चरणों से परे जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए उपयुक्त है केवल बाधा की प्रारंभिक स्थिति से संबंधित होगा।
इस संदर्भ में लड़की भ्रूण की सीमाओं से संबंधित बीत रहा है, अन्य हड्डीवाला मॉडल जीवों पर अपने फायदे कई हैं। लड़की भ्रूण एक कशेरुकी भ्रूण में शारीरिक हस्तक्षेप के इस प्रकार के लिए एक बहुत ही उपयुक्त पशु मॉडल है। भ्रूण अपेक्षाकृत बड़े हैं और throu आसानी से सुलभ हैंखोल gh। एक प्रयोग के लिए आगे भ्रूण पर लौट सकते हैं (जैसे, एक मनका 18 या यहां तक कि एक बाधा को हटाने के) या बस टेप खिड़की को हटाने के द्वारा प्रगति पर जाँच करें। वहाँ संभव गुंजाइश रहते इमेजिंग या समय चूक इमेजिंग शामिल करने के लिए है। हम चिकन अंडे कि विशेष रूप से प्रारंभिक चरण भ्रूण पर परिचालन के लिए अनुकूल है windowing की एक विधि का वर्णन है। अंग के अध्ययन के मामले में यह बहुत ही महत्वपूर्ण और उपयोगी है हर प्रयोग है कि प्रत्येक जैविक को दोहराने के लिए एक आदर्श आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के लिए एक contralateral नियंत्रण अंग नहीं है।
अंग परिणाम और मोती संकेतन अणुओं में भिगो को रोकने के लिए अभेद्य बाधाओं का उपयोग कर के संयोजन से पहले नहीं बताया गया है। इस तरह के हस्तक्षेप के बाद mRNA अभिव्यक्ति के हमारे विश्लेषण भी उपन्यास है। इन तकनीकों में हमें सक्षम जब अंग विशिष्ट प्रतिलेखन कारक Tbx5 और Tbx4 LPM में प्रेरित किया है और यह भी कर रहे हैं की कठिन समस्या टुकड़े करनाकि बाद में, कली दीक्षा अंग से पहले दिखाने के लिए, LPM में इन TBX जीनों की उपस्थिति Fgf10 प्रतिलेखन के सक्रियण और अंग कली परिणाम की शुरुआत के लिए पर्याप्त नहीं है। आंकड़े 2 जी, 2 डी और 2 ई इन निष्कर्षों में अच्छी तरह से व्याख्या करते हैं। चित्रा 2 जी में 10 स्टेज पर एक बाधा की प्रविष्टि निम्न Tbx4 अभिव्यक्ति के अभाव Tbx4 के शामिल होने के बाद चरण 15 पर 2 डी और 2 ई में अपनी उपस्थिति बाधा प्रविष्टि निम्न के विपरीत में है। आरए लथपथ मोती का आरोपण बाधा डालने और इतने somites LPM में आवश्यक किया जा रहा अंग कली परिणाम शुरू कर सकते हैं पहले से Ra को अंक निम्नलिखित अंग कली दीक्षा के बचाव में मदद की। इस तरह की तकनीक अंग विकास में आगे के प्रश्न लेकिन यह भी कशेरुकी embryogenesis के अन्य सवालों को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मस्तिष्क, आंख और ट्रंक के क्षेत्रों उपयुक्त होने की संभावना है।
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.
Dumont No.5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
Dumont No.4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
Blunt ended curved forceps, | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
ends approx 0.5 cm long | |||
Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
Mineral oil | |||
Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
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BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
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Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500ml |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500ml |
Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |