Abstract
Dendrittiske celler (DCS) er viktig for å initiere immunresponser, blant annet gjennom sin evne til å tilegne seg og shuttle antigen til drenering lymfeknute (DLN). Mobilisering av DC til DLN er kompleks og er fortsatt ikke helt klarlagt i løpet av infeksjon. Beskrevet heri er bruken av en innovativ, enkel analyse som er avhengig av fluorokrom 5- og 6-karboksyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) for å spore migrering av DC i løpet av fotputen infeksjon med Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) i C57BL / 6 mus. Denne analysen gjør det mulig for karakterisering av hud DC undergrupper som aktivt flytter til drenering, popliteal LN i respons til BCG. Denne protokollen stammer fra en BCG modell hvor hud trekkende DC ble identifisert ved strømningscytometri. Analysen er elskverdig til studiet og identifisering av DC eller andre celler som hjem til popliteal LN etter inokulering av mikrober, deres metabolitter eller andre betennelsesstimuli i fotbladet, og følgelig for å studere faktorer som regulerer den migrering av disse cellene.
Introduction
DC lokalisert i kroppsoverflater forstand mikrober eller deres produkter, og dermed mobilisere via lymfekar til drenering LN (DLN) 1,2. Denne flyttingen er nødvendig for transport av mikrobiell antigen til DLN og den påfølgende grunning av immunresponser mot invaderende mikroben. Faktisk, blokade eller svikt i DC for å migrere fra infisert vev til DLN demper T-celle respons 3-5. Følgelig analyser konstruert for å spore migrasjon på enkeltcellenivå er nyttige for å bidra til å tilskrive vandringsfunksjon til en gitt like delsett.
Det er en stor mengde data om mobilisering av hud DC til DLN. Sistnevnte står for mye av kunnskapen om DC migrasjon fra betente eller infiserte områder 2. Dette er ikke overraskende ettersom huden huser en stor bestand av DC og er en svært tilgjengelig overflate for eksperimentering i laboratoriet mus. Flere teknikker har derfor blitt utviklet for å vurderemigrasjon av murine DC fra huden til DLN to. FITC hud maleriet er den desidert mest brukte tilnærmingen. I dette assay den fluorkrom fluorescein-5-isotiocyanat (FITC) ble fremstilt i en blanding med aceton og en kontakt irriterende. Dette cocktail påtrykkes hårfrie eller barbert hud og akkumulering av FITC-merkede celler i sin tur er analysert i DLN. Migrasjon kan også bli studert ved å injisere huden med fluorokrom-merket nano- eller mikropartikler, som muliggjør sporing av fagocytiske celler som har internalisert fluorescerende partikler i huden. Lymfekar kan også cannulated å direkte trekke migrerer DC fra lymfe. Dette er imidlertid teknisk krevende, særlig hos mus. Antallet DC erholdt for påfølgende analyser er også en begrensende faktor.
På tross av mange tidligere studier på huden DC migrasjon, er det fortsatt et sparsomt med informasjon om hud DC mobilisering til DLN følgende vaccinasjon med Bacille Calmette-Guérin (BCG), den levende, svekket stamme av Mycobacterium bovis brukes til å vaksinere mot M. tuberkulose. BCG er vaksinert i huden, forårsaker en begrenset infeksjon som utløser en T hjelpercelle type 1 reaksjon. Både DC sub-populasjoner som mobiliserer til DLN fra BCG-infisert hud og de faktorer som regulerer deres migrasjon under denne prosessen ikke er fullt ut forstått. I lys av det ovenfor, ble en enkel, men ny fremgangsmåte utviklet hvor fluorokrom 5- og 6-karboksyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) injiseres in situ for å spore migrering av DC inn i DLN 3. C57BL / 6 mus injiseres i den bakre fotpute med et inokulum av BCG og dagen før avlivning, ble dyrene injisert i den samme fotputen med en høy konsentrasjon av CFSE. Tjuefire timer senere avlives dyrene og drenering popliteal LN (PLN) fjernet og klargjort for flowcytometri. Denne analysen gjør det mulig for identification av celler som migrerer over natten fra fotputen huden til DLN (figur 1).
Videre kan genet målrettet mus brukes til å identifisere faktorer som kreves for cellene å mobilisere til DLN. Ved hjelp av denne analysen, har forfatterne av denne rapporten tidligere funnet at EpCAM lav CD11b høy trekkfugl hud DCs transport BCG til DLN i en prosess regulert av Interleukin-1 reseptoren og den intracellulære adapter molekyl MyD88 tre. Protokollen for dette CFSE basert migrasjon analyse som stammer fra den ovennevnte rapport fra Bollampalli et al. 3 hvor strømningscytometri ble anvendt for å detektere og analysere trekk hud DC, er beskrevet her. Fordelene og ulempene ved denne analysen blir diskutert.
Protocol
MERK: C67BL / 6 mus ble brukt for eksperimentene er vist i dette manuskriptet. Disse dyrene var hus under patogenfrie forhold ved MTC dyret anlegget, Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige. Dyreforsøk ble utført i henhold til de direktiver og retningslinjer for det svenske of Agriculture, den svenske Animal Protection Agency, og Karolinska Institutet. Forsøk ble godkjent av Stockholm Nord Animal Etisk Råd.
1. Utarbeidelse av CFSE Aksjer og Lagring
- Forbered en 5 mM lager av 5- og 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) i dimetylsulfoksid. Vortex. Tilsett 100 ul porsjoner i sterile, 0,5 ml skrukork mikrorør. Oppbevar alikvoter ved -80 ° C.
2. Mus
- Bruk innavlet mannlige eller kvinnelige mus mellom 8 og 12 ukers alder. Sex-og alderstilpassede dyr er å foretrekke. Sørg for at de nødvendige dyreetiske tillatelser are på plass før initieringen av eksperimenter.
3. Immobilisering av dyr med isofluran Gas Anesthesia
- Last anestesi enhet med isofluran. Fyll 10 ml gasstett glassprøyte med isofluran. Unngå å innføre luftbobler. Koble sprøyten og væske innløp med den medfølgende slangen og flytt pusher frem til væsken i forbindelsesrøret er synlig bare om å gå inn i fordamperen.
MERK: Ikke oppbevar isofluran i sprøyten når den ikke er i bruk. - Bedøve dyrene med isofluran i induksjonskammeret, med en luftstrøm opprettholdes ved omtrent fra 400 - 500 ml / min, og konsentrasjonen av isofluran på 3,5%.
MERK: Enheten kan ikke brukes uten luftstrøm. - Når dyrene sover, slår stengeventilen på anestesienheten å rute isofluran gass til masken stykke. Sjekk at masken stykket er intakt for å unngå lekkasje av gass. Airflow kan opprettholdes på 400 ml / min, alternasvis redusert til 200 ml / min. Reduser isofluran konsentrasjon til 2,6%.
MERK: anestesieffekten kan økes og / eller redusert ved å justere strømningshastigheten.
4. BCG Injeksjoner og gjenoppretting
- Visuelt bekrefte og utføre tester som tå klype refleks test for å fastslå at mus er immobilisert / sover på isofluran masken stykke før du utfører injeksjoner.
- Inokuler i den bakre fotpute, 1 x 10 6 kolonidannende enheter av Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) i 30 ul PBS ved hjelp av en sprøyte utstyrt med en 29 G x? Tommer nål.
MERK: generasjonen av mykobakterielle aksjer er kort beskrevet i den opprinnelige beskrivelse av denne prosedyren tre, og i betydelig detalj andre steder 6. BCG er også lett tilgjengelig fra kommersielle kilder. Forfatterne anbefaler at BCG være puls-ultralydbehandlet eller gått gjennom en sprøyte for å forstyrre klumper før sine inoculatipå i mus. BCG gjentas her som en mikrobiell stimuli gitt sin ansettelse i den opprinnelige beskrivelse av denne protokollen 3, men forfatterne absolutt oppfordre testing av andre mikrobielle stimuli. - Utføre den samme prosedyren som er beskrevet ovenfor for injeksjon av PBS inn i kontrollmusene.
- Overvåk dyrene etter injeksjoner for å bekrefte at utvinning fra anestesi er vellykket og at dyr kan støtte seg på den injiserte, hind footpad.
5. CFSE Injeksjoner
- Utarbeidelse av CFSE for injeksjoner:
- Tine en ampulle med 5 mM CFSE stamløsning fra -80 ° C. Fortynne CFSE 10 ganger i PBS. Resuspender løsningen grundig før du fyller sprøyten i forberedelse til injeksjonen.
- CFSE Injeksjon og gjenoppretting:
- Gjenta prosedyren for bedøvelse dyr i § 3. Injiser 20 mL av 0,5 mM CFSE i hind fotbladet som tidligere har fått BCG eller PBS.
- Gjenta prosedyren for bedøvelse dyr i § 3. Injiser 20 mL av 0,5 mM CFSE i hind fotbladet som tidligere har fått BCG eller PBS.
6. kirurgisk fjerning av Popliteal Lymph Node (PLN)
MERK: Bruk av steriliserte kirurgiske instrumenter og deres gjentatte dekontaminering i 70% etanol oppfordres gjennom dette trinnet.
- Avlive mus. Spray dyret med 70% etanol. Pin dyret i ryggposisjon, på en disseksjon bord.
MERK: Forfatterne kan anbefale dødshjelp gjennom halshugging. - Nøye lage en vertikal snitt i hind lår. Clear muskler og fett ved hjelp av saks og pinsett for å avsløre og dermed skjære PLN ligger dypt i fett posen, i knehasen.
- Overfør PLN til 0,5 ml steril PBS, på is.
7. generasjon Single-celle Suspensjon fra PLN
- Homogenisere PLN gjennom en 70-micron celle sil placed i en 6 well-plate inneholdende 5 ml PBS eller fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) buffer (PBS inneholdende 2% kalvefosterserum (FCS), 5 mM ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), og 1 mM natriumazid). Homogen gjennom silen med baksiden av en 3 ml sprøyte.
MERK: Natriumazid er giftig og må behandles med forsiktighet. - Vask filteret med ytterligere 5 ml PBS eller FACS-buffer, samle materialet i et 15 ml rør og pelletere cellene ved 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) i 5 min, 4 ° C. Alternativt homogen pLNs direkte i Mikrosentrifugerør ved hjelp av polypropylen homogenizers.
- På bakgrunn av pelletstørrelse, resuspender PLN suspensjon i et passende volum av PBS eller FACS-buffer, for eksempel 200 - 1000 pl. Bruke et tellekammer for å kvantifisere det totale celletallet oppnådd fra hvert LN suspensjon. Bruk trypanblått å ekskludere døde / døende celler.
8. Cell Farging og flowcytometri
- transfer 1 - 10 x 10 6 celler til 5 ml rundbunnet polystyren-reagensrør. Vask med FACS-buffer, og pellet ved sentrifugering ved 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) i 5 min, 4 ° C.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 50 - 100 ul av antistoff cocktail (se Dendrittiske celle [DC] markører for overflatefarging, Materials tabell) inneholdende 0,5 - 1 pg anti-mus CD16 / CD32 (for å blokkere uspesifikk Fc-mediert interaksjoner) i FACS buffer i 30 - 45 min, på is. Beskytt prøvene mot lys.
- Etter inkubering vaskes cellene med FACS-buffer og pellet ved sentrifugering ved 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) i 5 min, 4 ° C.
- Resuspender cellene i 50 - 100 ul FACS-buffer. Innhenting av data på et flowcytometer 7-10.
MERK: For gode anmeldelser på flowcytometri vi henviser leseren til følgende publikasjoner som stafett både teoretisk og praktisk informasjon om denne metoden.
Representative Results
Den CFSE basert migrasjon analysen (figur 1) ble brukt sammen med flowcytometri å oppdage og karakterisere CFSE-merkede celler som vises i PLN etter BCG-infeksjon i fotbladet. En stor del av CFSE merking i PLN finnes på MHC-II-høy og CD11c + / lav-celler (figur 2A), i samsvar med hud DC som har migrert til huden DLN 11. Både frekvens og antall CFSE-merkede, MHC-II høy CD11c + / lav-celler er økt i pLNs fra BCG-infiserte mus sammenlignet med PBS-injiserte kontroller (figur 2B-C), noe som tyder på at BCG forbedrer flytting av disse celler til DLN. Etter denne analysen måler migrasjon i løpet av en 24-timers periode, var det mulig å fastslå at huden DC fremdeles inn i DLN 5 dager etter infeksjon (figur 2C). Dette utvider DC migrasjon i dagens modell godt utover tidslinjen for første activatipå av antigen-spesifikke CD4 + T-celler i pln 3. Videre trekkende hud DCs uttrykker forhøyede nivåer av co-stimulerende molekyler CD80 og CD86 (figur 2D). Dette er konsistent med tidligere observasjoner fra huden eksplantering kulturer og FITC hud maleri 11, støtter konseptet at trekkende DC er aktiverte cellene. Viktigere, både LN-resident DC (MHC-II + CD11c høye celler) og plasmacytoid DCS (MHC-II lav CD11c lave PDCA-1 + celler), som angir betente LNS gjennom høye endotelceller venules og ikke afferente lymfekar 12, hvor negativ for CFSE (figur 2EF), noe som tyder faktisk på at CFSE merking skjedde hovedsakelig i fotbladet.
Gitt at MHC-II høy CD11c + / lav celler representerer ikke én, men flere DC subpopulasjoner 13, de ekstra overflatemarkører CD103, EpCAM (CD326) og CD11b ble inkludert i antistoff farging panelet som brukes for flowcytometrisk påvisning (Materialer tabell) for ytterligere å karakterisere bestanden av trekkende DC (figur 3). Ved å gjøre dette, ble en sub-populasjon av EpCAM lave CD11b høy-celler er identifisert som hoved vandrende huden DC undergruppe som reaksjon på BCG-infeksjon (figur 3).
De strømningscytometriske data vises her ble kjøpt på et flowcytometer utstyrt med 4 lasere (488, 532, 640 og 405 nm). Dataene ble analysert med celleanalyseprogramvare. Andre flerfarge væskestrømsfotometere enn den ene som er angitt i Materialer tabell kan anvendes for en vellykket påvisning av markørene som er nevnt i de ovennevnte studier, eller påvisning av andre markører, på andre celletyper for den saks skyld. For protokollen beskrevet heri, en cytometer stand til å påvise 6 forskjellige fluorokromer er nøssary. Viktigere er de kloner for hvert antistoff brukes spesifisert (Materialer tabell). Valget av fluorokromkonjugerte konjugat må vurderes da dette kan avhenge av lasere og deteksjonskanaler på strømningscytometer tilgjengelig. Tilsvarende antistoffer må bli titrert for å bestemme den mest hensiktsmessige fortynninger for farging.
Befolknings frekvenser i BCG- og PBS-injiserte prøvene ble fremstilt grafisk og brukes sammen med totale celletall for å beregne absolutte tall av definerte, gated undergrupper av DC. Betydningen av forskjellene i datagruppen midler ble analysert ved Student 'st test eller ANOVA eventuelt med en cut-off på p <0,05. Uteliggere ble ekskludert fra analysen følgende Grubbs 's test for uteliggere.
Figur 1. Outline: BCG footpad InfeksjonModell og CFSE basert migrasjon analysen. BCG er vaksinert i hind fotbladet av C57BL / 6 mus. På ulike tidspunkter etter infeksjon, og 24 timers før offer, er fluorochrome CFSE injiseres i samme fotblad som tidligere har fått BCG. Drenering, popliteal lymfeknute er isolert og CFSE-merkede celler preget av flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Trekk Skin DC er en Major Befolkning Flytting til DLN Etter BCG footpad infeksjon. C57BL / 6 mus ble infisert med 1 x 10 6 CFU av BCG i fotbladet. Tjuefire timer før offeret ble dyrene injisert med 0,5 mM CFSE i samme fotblad. Knehasen LNS ble høstet, homogenisertinn i enkeltcellesuspensjoner og underkastet flowcytometri. For målinger gjort en dag etter BCG ble CFSE injisert 2t etter BCG. (A og B) Zebra plott som viser dominerende uttrykk for CFSE på MHCII høye og CD11c + / lave celler i BCG-drenering PLN 3 dager etter smitte. (C) Frekvens og totalt antall CFSE-merket MHCII høy CD11c + / lave celler i PLN fra BCG- og PBS-injiserte mus ble fremstilt grafisk ved ulike tidspunkt. (D) Mean fluorescens intensitet (MFI) for CD80 og CD86 ble bestemt på CFSE + og CFSE neg MHC-II høy CD11c + / lave hud DCs i PLN 3 dager etter BCG-infeksjon. (E) CFSE uttrykk innen hud DC (MHC-II høy CD11c + / lav), LN-resident DC (MHC-II + CD11c høy) og (F) plasmacytoid DC (MHC-II lav CD11c lav PDCA-1 +)ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri 3 dager etter BCG. For hvert eksperiment ble minst 5 mus benyttes for BCG-infiserte grupper og 3 for PBS-injiserte kontroller. Linjene viser standard feil av gjennomsnittet. Totalt antall CFSE-merkede celler innenfor hver undergruppe er gitt i Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 tre. * Betegner statistisk signifikante forskjeller mellom BCG-smittede og PBS kontroller. En av to uavhengige eksperimenter er vist. Figur tilpasset fra Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 tre, med tillatelse fra forlaget Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. EpCAM lav CD11b høye DC er hoved Skin DC Delsett trafficking til DLN Etter BCG footpad infeksjon. C57BL / 6 mus ble injisert med BCG og CFSE som i figur 2. (A) Zebra plott som viser gating strategi ansatt (øverst panel) og hyppigheten av CFSE + celler i hver, definert undergruppe på ulike tidspunkter etter BCG-infeksjon (bunnpaneler). Frekvenser innenfor hver undergruppe kan variere avhengig av tidspunktet etter infeksjon. Etter 3 dager med BCG kan man forvente å finne om lag 0,2% MHC-II høy CD11c + / lave celler blant alle LN celler. Av disse var ca 6% er CD103 + celler. For undergrupper innenfor MHC-II høy CD103 negativ gate, kan man finne ca 42% CD11b høy EpCAM lave celler, 27% CD11b lav EpCAM lave celler og 7% LCS. (B) Totalt antall CFSE + celler i hver, er definert delmengde ved forskjellige tidspunkter etter BCG-infeksjon er vist. For hver experiment, ble minst 5 mus benyttes for BCG-infiserte grupper og 3 for PBS-kontroller. Linjene viser standard feil av gjennomsnittet. * Betegner statistisk signifikante forskjeller i forhold til PBS-injiserte kontroller. Ett av tre uavhengige eksperimenter er vist. Figur re-skrives ut fra Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 tre, med tillatelse fra forlaget Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
FBT er spesialiserte antigenpresenterende celler som kan svare på mikrobiell utfordring på kroppsoverflater ved å kjøpe mikrobiell antigen og migrere til DLN via lymfekar. Der DC presentere dette antigenet til T-celler på en måte som driver primære T-celle responser. Prosessen med DC-migrering fra vev til DLN er derfor meget viktig for å forstå hvordan en produktiv T-cellerespons blir initiert. Metoder for å måle DC migrasjon er derfor svært nyttig i utfolder de ovennevnte.
En musemodell ble anvendt for å studere hud DC migrering til DLN etter infeksjon med BCG, en levende vaksine som injiseres klinisk i huden. I tråd, er BCG injiseres i hind fotbladet å etterligne dette kutan ruten for vaksinasjon. En enkel analyse ble utviklet og dermed innlemmet til denne modellen for å undersøke overføringen av hud DC sub-populasjoner fra BCG vaksinen nettstedet i fotbladet huden til drenering PLN. Denne protokollen relies på å injisere fluorokrom CFSE inn i samme fotblad som tidligere har mottatt BCG og deretter isolering av det drenerende PLN 24 timer senere for å analysere tilstedeværelsen av CFSE-merkede celler ved flow cytometri. Selv om det ikke er beskrevet i protokollen, kan LNS fra dette oppsettet også fremstilles for analyse ved konfokal mikroskopi for å undersøke migrasjonsprosesser slik som plassering av trekklegemer i LN 3. Videre har lignende resultater på BCG-utløst huden DC migrasjon er oppnådd ved hjelp av både BCG Pasteur 1173P2 3 og BCG SSI 1331 14.
CFSE er vanlig å merke celler in vitro og for å spore slike merkede celler in vivo etter celle overføringer 15. I dagens protokollen skjønt, ble det brukt til direkte merke hudceller in situ. Den molekylære basis for CFSE merking er lik FITC, som også er en amin-reaktivt fluorescerende fargestoff. CFSE er imidlertid å foretrekke fremfor FITC for konjugering som det CreAtes svært stabile carboxamide obligasjoner 16. Videre er CFSE meget permeabel membran og passivt diffunderer inn i cellene. Når du er inne, danner den intracellulære amin (fluorescerende) konjugater som er beholdt i den merkede cellen 15.
Den CFSE basert migrasjon analyse utviklet av forfatterne gjør identifisering av celler flytting fra huden til DLN innenfor en 24-timers periode i respons til BCG. Den måler dermed akutt migrasjon under en definert tidsramme og gjør det mulig å undersøke muligheten for forskjellige, injisert stimuli for å utløse migrasjon. Denne analysen er forskjellig fra den klassiske teknikken for FITC hud maleri, som måler en kumulativ migrering hendelse utløst av kutan, topisk påføring av en kontakt-sensibiliserende middel. Således kan det CFSE basert migrasjon analysen anvendes for å identifisere trekkende hud DC eller andre celler som huser den PLN etter injeksjonen av mikrober, mikrobielle produkter eller andre inflammatoriske stimuli i footpad. Faktisk, både nøytrofile granulocytter og γ: har S T-celler er vist å flytte fra huden til DLN i respons til BCG 17,18. Faktisk ble analysen nylig brukt i en co-infeksjon innstillingen for å vise at en gut-lokalisert nematode infeksjon kan dempe BCG-utløst huden DC migrasjon til DLN 14.
DC migrasjon ofte vurderes mellom 24-72 timer i FITC hud maleri siden FITC-merket DC er vanskelige å oppdage fire til fem dager etter maleri 19. Tap av CFSE signal på merket DC er ikke et problem i analysen som presenteres her siden analyse av migrasjon var begrenset til 24 timer; Årsaken bak dette er at forfatterne ønsket å spesifikt studere "over natten" migrasjon hendelser. Andre som er interessert i denne analysen er imidlertid oppfordres til å undersøke tidligere eller senere tidspunkter for CFSE-basert sporing. Dessuten, siden CFSE innføres ved injeksjon kan det gis ved en hvilken som helst definert tid. Denne fleksibiliteten tillot enuthors å vurdere DC migrasjon mellom dag 5 og 6 etter BCG-infeksjon (figur 2C) 3. Injisering CFSE kan potensielt begrenser celletypene tilgjengelig in situ for merkingsreaksjonen. For eksempel Langerhans-celler (LCS), som er DCS som befinner seg i topplaget av huden, epidermis, migrere dårlig respons på BCG i CFSE basert migrasjon analysen (figur 3) 3. Men under FITC hud maleri, DC plassert i dermis, laget under overhuden, er lett merket og migrere til DLN raskere enn LCS 20,21. Dette tyder på at cellene kan bli fluorkrom-merket uten nødvendigvis ønsker å lokalisere til det lag av huden hvor merking oppløsningen påføres.
Som modell for BCG-infeksjon, gir musen øret en bona fide intradermal ruten for vaksinasjon som er mer i tråd med den kliniske administrasjonen av BCG som tuberkulose vaksine. footpad injeksjon på den annen side, er sannsynligvis en kombinasjon av de intradermal og subkutant. Når det er sagt, det krever dyktighet og opplæring til riktig og reproduserbart levere BCG til dermis 22, så det kan ikke alltid gis i klinisk praksis virkelig intradermal men heller subkutan eller en kombinasjon av begge. Som en vaksinasjon nettstedet fotbladet har to veldig klare fordeler over øret som fortjener å nevne. Først blir immunresponsen konsentrert til tømme- PLN følgende en footpad injeksjon og dette letter behandlingen av responser. Forfatterne av denne rapporten fant PLN å være den første og viktigste LN drenering fotbladet tre. Andre har foreslått delt drenering mellom knehasen og subiliac LNS etter injeksjon av Evans blue 23. Ikke desto mindre, i forhold til øret, er det mer enn ett øre DLN hos mus, og disse kan ikke være regelmessig til stede eller lett å lokalisere 24. Sistnevnte klart introduserer en Liability i studier som søker å undersøke responser i DLN. For det andre, kan større mengder være podet inn i fotputen (minst 10 - 50 ul) i forhold til øret. Dette i sin tur både reduserer ansvar for å innføre store endringer i lymfatisk flyt og for å måtte jobbe med svært små injeksjonsvolumer, som er i seg selv et problem når det kommer til inoculating store mengder mykobakterier. I øret hvor injeksjonsvolumer må være liten (1-10 ul), kan til og med 5 pl forandre lymfatisk flyt og potensielt tvinge frem en større mengde av det injiserte materiale direkte inn i DLN på en ukontrollert måte. Det er derfor viktig å ta hensyn til injeksjonsvolumer. Dette er spesielt viktig i eksperimenter adressering bidraget av celler i frakte bakterier til LN. I BCG fotpute-modellen, kan noen BCG ha nådd DLN i fravær av cellulær transport. Dette er basert på den observasjon at man likevel kan detektere BCG i DLN av mus hvor cellemigrasjon fra fotenpad ble helt ablated ved lokal injeksjon av kikhoste toksin tre. Hvorvidt dette er en indikasjon på at BCG kan få direkte tilgang lymfekar og nå DLN i en virkelig celle-fri måte gjenstår å fastslå, siden det ikke kan utelukkes at mykobakterier i dette tilfellet der det er gitt adgang til lymfekar med makt av den injiserte volumet.
Et praktisk hensyn til immuniseringer i øret eller fotpute er at dyrene har til å være tilstrekkelig immobilisert for injeksjoner kan utføres på riktig måte, og på en reproduserbar måte. Isofluran gass er beskrevet i den aktuelle protokoll som en metode for å holde dyrene i forberedelse for fotputen injeksjoner. De relativt rask induksjon og gjenvinningstider for isofluran-bedøvelse mediert gjør det til en populær metode, men i likhet med andre anestetika, påvirker fysiologi, som kan interferere med eksperimentelle resultater 25. Ja, både flyktige og injiserbare bedøvelse redusere lymfe flyt ved å avskaffefrivillige muskelbevegelser, redusere muskel tone, og avtagende lymphangion sammentrekning 26. Videre har en 5-fold reduksjon i migrasjon til DLN av DC adoptiv overført i fotbladet blitt rapportert i bedøvede dyr 27. Gitt de ovennevnte, og ettersom håndteringsprosedyrer før bedøvelse vil sannsynligvis føre til mer stress for dyrene enn injeksjonen selv, noe som er både hurtig å administrere og krever ikke en gjenvinningstrinn, muligheten til tilstrekkelig holde dyret uten bedøvelse bør bli vurdert. En mus rainer tilpasset for fotbladet injeksjoner, hvor dyret hurtig kan bringes til en immobilisert stilling og inokulert i fotbladet i løpet av 30 til 40 sekunder ville være ideelt å injisere mus i den bakre fotpute uten å endre andre aspekter av sin fysiologi i prosessen , og vil være svært nyttig i studier adressering celle migrasjon gjennom lymfekar.
Som konklusjon, denne rapportenfremhever en ny protokoll for sporing hud DCs under mobilisering til DLN ved hjelp av en analyse som overvåker migrasjon løpet av en definert 24-timers vindu. Dette CFSE basert migrasjon analysen tillater påvisning og analyse av migrerende celler ved flowcytometri, som angitt her, så vel som ved konfokal mikroskopi tre. Det gir en fleksibel plattform for å studere en rekke injisert stimuli og deres evne til å utløse DC migrasjon, og viktigst av alt, kan brukes til å spore ikke bare DC, men også andre bestander flytter fra huden til DLN under forskjellige eksperimentelle innstillinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10 ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
References
- Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206 (2015).
- Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
- Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11 (2007).
- Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
- Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1 (2002).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3 (2001).
- Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
- Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
- Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
- Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9 (2009).
- Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
- Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
- Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
- Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).
