Abstract
Dendritische cellen (DCs) zijn belangrijk voor het initiëren van immuunresponsen, mede door hun vermogen tot verwerven en shuttle antigeen aan de drainerende lymfeklier (DLN). De mobilisatie van DCs aan de DLN is complex en blijft niet volledig opgehelderd tijdens infectie. Hierin beschreven is het gebruik van een innovatieve, eenvoudige test die is gebaseerd op het fluorochroom 5- en 6-carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidyl ester (CFSE) om de migratie van DCs volgen tijdens voetzool infectie met Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) in C57BL / 6 muizen. Deze test maakt de karakterisering van huid DC subpopulaties die actief verplaatsen wegvloeien, knieholte LN reactie op BCG. Dit protocol is ontstaan uit een BCG model waar trekkende huid DCs werden geïdentificeerd door middel van flowcytometrie. De test is vriendelijk de studie en identificatie van DC's of andere cellen die thuis van de knieholte LN na inoculatie van microben, metabolieten of andere inflammatoirestimuli in de voetzool en derhalve factoren die de migratie van deze cellen reguleren bestuderen.
Introduction
DCs gelokaliseerd in lichaamsoppervlakken voelen microben of hun producten, en zo te mobiliseren via de lymfevaten naar de drainerende LN (DLN) 1,2. Deze verplaatsing is noodzakelijk voor het transport van microbiële antigeen aan de DLN en de daaruit priming van immuunresponsen tegen de binnenvallende microbe. Inderdaad, blokkade of falen van DCs te migreren van het geïnfecteerde weefsel de DLN dempt de T-celrespons 3-5. Dienovereenkomstig assays ontwikkeld om de migratie in de single-cell niveau te volgen zijn nuttig om toeschrijven trekkende functie helpen om een bepaalde DC deelverzameling.
Er is een grote hoeveelheid gegevens over het gebruik van huid DCs aan de DLN. Dit laatste is goed voor een groot deel van de kennis over de DC migratie van ontstoken of geïnfecteerde websites 2. Dit is niet verrassend aangezien de huid herbergt een grote populatie van DCs en is een zeer toegankelijke oppervlak voor experimenten in het laboratorium muis. Verschillende technieken zijn derhalve ontwikkeld om te beoordelende migratie van muizen DCs van de huid naar de DLN 2. FITC huid schilderij is veruit de meest gebruikte aanpak. In deze test het fluorochroom fluoresceïne-5-isothiocyanaat (FITC) wordt bereid in een mengsel van aceton en een contact irriterend. Deze cocktail wordt toegepast op onthaarde of geschoren huid en de accumulatie van FITC-gemerkte cellen weer in de DLN geanalyseerd. Migratie kan ook worden onderzocht door het injecteren van de huid met fluorochroom gelabeld nano- of microdeeltjes, die het volgen van fagocytische cellen die de fluorescerende deeltjes in de huid hebben geïnternaliseerd maakt. Lymfevaten kan ook worden voorzien van een canule om direct te extraheren migreren DCs van lymfe. Dit is echter technisch moeilijk, vooral bij muizen. Het aantal DCs verkregen voor daaropvolgende analyse ook een beperkende factor.
Ondanks de vele eerdere studies op de huid DC migratie, blijft er een gebrek aan informatie met betrekking tot de huid DC mobilisatie DLN volgende gevaccineerdnatie met Bacille Calmette-Guérin (BCG), de levende, verzwakte stam van Mycobacterium bovis gebruikt om te vaccineren tegen M. tuberculose. BCG is geïnoculeerd in de huid, waardoor een beperkte infectie die een soort helper T-cel respons 1 triggers. Gelijk- subpopulaties die mobiliseren om de DLN van de BCG-geïnfecteerde huid en de factoren die de migratie reguleren tijdens dit proces niet volledig begrepen. Gezien het bovenstaande werd een eenvoudige maar nieuwe werkwijze ontwikkeld waarbij het fluorochroom 5- en 6-carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidyl ester (CFSE) geïnjecteerd in situ om de migratie van DCs volgen in de DLN 3. C57BL / 6 muizen worden geïnjecteerd in de voetzool met een inoculum van BCG en de dag vóór opoffering worden de dieren geïnjecteerd in dezelfde voetzool met een hoge concentratie van CFSE. Vierentwintig uur later worden de dieren opgeofferd en de afvoerende knieholte LN (PLN) verwijderd en geprepareerd voor flowcytometrie. Deze test maakt de identification cellen die overnacht migreren van de voetzool huid aan de DLN (figuur 1).
Verder kan van transgene muizen worden gebruikt om factoren te identificeren die nodig is voor cellen te mobiliseren om de DLN. Met behulp van deze test, hebben de auteurs van dit rapport eerder geconstateerd dat EpCAM laag CD11b hoge trekkende huid DCs vervoer BCG aan de DLN in een proces geregeld door interleukine-1 receptor en de intracellulaire adapter molecule MyD88 3. Het protocol voor deze CFSE-gebaseerde migratieanalyse dat afkomstig is van het bovengenoemde verslag door Bollampalli et al. 3 waarin flowcytometrie werd gebruikt voor het detecteren en analyseren trekkende huid DCs, wordt hierin beschreven. De voor- en nadelen van deze test worden besproken.
Protocol
OPMERKING: C67BL / 6 muizen werden gebruikt voor de in dit manuscript experimenten. Deze dieren waren huis onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden in het MTC dier faciliteit, Karolinska Institutet, Stockholm, Zweden. Animal experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en richtlijnen van de Zweedse Raad voor de landbouw, de Zweedse Animal Protection Agency, en Karolinska Institutet. Experimenten werden goedgekeurd door de Stockholm Noord Animal Ethics Council.
1. Bereiding van CFSE Stocks and Storage
- Bereid een 5 mM voorraadoplossing van 5- en 6-carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidyl ester (CFSE) in dimethylsulfoxide. Vortex. Verdeel 100 ul aliquots in steriele 0,5 ml schroefdop microbuisjes. WINKEL aliquots bij -80 ° C.
2. Muizen
- Gebruik ingeteelde mannelijke of vrouwelijke muizen tussen 8 en 12 weken. Sexe en leeftijd gematchte dieren hebben de voorkeur. Zorg ervoor dat de nodige dier ethische vergunningen are in plaats vóór de aanvang van de experimenten.
3. Immobilisatie van dieren met isofluraan Gas Anesthesia
- Laad de anesthesie unit met isofluraan. Vul het 10 ml gasdichte glazen spuit met isofluraan. Voorkomen dat er luchtbellen. Sluit de spuit en vloeistofinlaat met bijgeleverde slang en beweeg de stoter naar voren totdat de vloeistof in de verbindingsbuis zichtbaar op het punt om de verdamper voeren.
LET OP: Niet bewaren isofluraan in de spuit wanneer niet in gebruik. - Verdoven dieren met isofluraan in de inductie kamer met een luchtstroom op ongeveer 400 gehouden - 500 ml / min en de concentratie van isofluraan op 3,5%.
LET OP: Het apparaat werkt niet zonder luchtstroom. - Zodra de dieren in slaap zijn, zet de kraan op de anesthesie-eenheid voor het routeren van de isofluraan gas om het masker stuk. Controleer of het masker stuk intact is om lekkage van gas te voorkomen. Airflow kan bij 400 ml / min, Alterna worden gehandhaafdtief daalde tot 200 ml / min. Verminder isofluraan concentratie tot 2,6%.
OPMERKING: verdovend effect kan worden verhoogd en / of verminderd door aanpassing van de stroomsnelheid.
4. BCG Injecties and Recovery
- Visueel te bevestigen en het uitvoeren van tests zoals de teen knijpen reflex test om te vernemen dat muizen geïmmobiliseerd / slaap op de isofluraan masker stuk voor het uitvoeren van injecties.
- Inoculeer in de achtervoet, 1 x 10 6 kolonievormende eenheden van Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) in 30 pl PBS met behulp van een injectiespuit voorzien van een 29 G x ½ inch naald.
LET OP: Het produceren van mycobacteriële voorraden wordt kort beschreven in de oorspronkelijke beschrijving van deze procedure 3, en in aanzienlijke detail elders 6. BCG is ook gemakkelijk verkrijgbaar bij commerciële bronnen. De auteurs bevelen dat BCG puls gesoniceerd of door een spuit klonters vóór de inoculati verstorenop in muizen. BCG wordt hier herhaald als een microbiële stimuli de werkgelegenheid die in de originele beschrijving van dit protocol 3, maar de auteurs zeker het testen van andere microbiële prikkels te stimuleren. - Voer dezelfde procedure hierboven voor de injectie van PBS in controlemuizen.
- Monitor dieren na injecties om dat het herstel te bevestigen van de anesthesie succesvol is en dat dieren zich kunnen steunen op de geïnjecteerde, voetzool.
5. CFSE Injecties
- Bereiding van CFSE voor injectie:
- Dooi een flacon van 5 mM CFSE voorraad oplossing van -80 ° C. Verdun de CFSE 10-maal in PBS. Resuspendeer de oplossing grondig voor het vullen van de spuit in voorbereiding voor de injectie.
- CFSE Injection en Recovery:
- Herhaal de procedure voor verdoven dieren in hoofdstuk 3 Injecteer 20 pi 0,5 mM CFSE in de voetzool die eerder BCG of PBS ontvangen.
- Herhaal de procedure voor verdoven dieren in hoofdstuk 3 Injecteer 20 pi 0,5 mM CFSE in de voetzool die eerder BCG of PBS ontvangen.
6. chirurgische verwijdering van knieholte lymfkliertest (PLN)
OPMERKING: Gebruik van gesteriliseerde chirurgische instrumenten en de herhaalde zuivering in 70% ethanol wordt gestimuleerd in deze stap.
- Euthanaseren de muizen. Spray het dier met 70% ethanol. Speld het dier in de dorsale ligging, aan een dissectie board.
NB: De auteurs kan aanbevelen euthanasie door middel van cervicale dislocatie. - maak voorzichtig een verticale insnijding in de achterste dij. Duidelijke spieren en vet met een schaar en pincet bloot te leggen en daarmee de te snijden pLN diep in de buidel vet in de knieholte.
- Breng de pLN tot 0,5 ml steriel PBS, op ijs.
7. generatie van single-cell Suspension vanaf PLN
- Homogeniseer de pLN door een 70-micron cel zeef placed in een 6 goed plaat met 5 ml PBS en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer (PBS dat 2% foetaal kalfsserum (FCS), 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 1 mM natriumazide). Meng door de zeef met de achterkant van een 3 ml spuit.
OPMERKING: Natriumazide is giftig en moet met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. - Was de zeef met een andere 5 ml PBS of FACS buffer, verzamel het materiaal in een 15 ml buis en pellet de cellen bij 277 xg (1200 rpm, R = 172 mm) gedurende 5 min, 4 ° C. Als alternatief, homogeniseren pLNs direct in microcentrifugebuizen met behulp van polypropyleen homogenisatoren.
- Op basis van de korrelgrootte, resuspendeer de pLN suspensie in een geschikt volume PBS of FACS buffer, bijvoorbeeld 200 - 1000 ul. Gebruik een telkamer voor het totale aantal cellen verkregen uit elke LN suspensie kwantificeren. Gebruik trypan blauw om dode / stervende cellen uit te sluiten.
8. cel kleuring en flowcytometrie
- Transfer 1-10 x 10 6 cellen 5 ml ronde bodem polystyreen buizen. Wassen met FACS-buffer en pellet door centrifugeren bij 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) gedurende 5 min, 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 - 100 pi antilichaam cocktail (zie Dendritische cellen [DC] markers gebruikt voor oppervlakte kleuring, Materials Table) met 0,5-1 ug anti-muis CD16 / CD32 (om niet-specifieke Fc-gemedieerde blokkeren interacties) in FACS buffer gedurende 30 - 45 min, op ijs. Bescherm monsters van licht.
- Na incubatie, wassen cellen met FACS buffer en pellet door centrifugeren bij 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) gedurende 5 min, 4 ° C.
- Resuspendeer cellen in 50-100 pi FACS-buffer. Verwerven van gegevens op een flowcytometer 7-10.
LET OP: Voor uitstekende recensies op flowcytometrie verwijzen we de lezer naar de volgende publicaties die zowel theoretische en praktische informatie over deze methode relais.
Representative Results
De CFSE-gebaseerde assay migratie (figuur 1) werd gebruikt samen met flowcytometrie de CFSE-gelabelde cellen die in de pLN na BCG infectie in de voetzool weergegeven detecteren en te karakteriseren. Een groot deel van CFSE labeling in pLN wordt gevonden op MHC-II hoog en CD11c + / laag cellen (Figuur 2A), in overeenstemming met de huid DCs die zijn gemigreerd naar de huid 11 DLN. Zowel de frequentie en aantal CFSE gemerkte MHC-II hoge CD11c + / laag cellen verhoogd pLNs van BCG-geïnfecteerde muizen vergeleken met PBS-geïnjecteerde controles (figuur 2B-C), wat suggereert dat BCG verbetert de verplaatsing van deze cellen aan de DLN. Aangezien deze migratie assay meet gedurende een 24-uurs periode, kon worden vastgesteld dat de huid DCs nog invoeren van de DLN 5 dagen na infectie (figuur 2C). Dit strekt zich DC migratie in het huidige model ver buiten de tijdlijn voor de eerste activatiop antigeen-specifieke CD4 + T-cellen in de pLN 3. Verder, trekkende huid DCs drukken verhoogde niveaus van co-stimulerende moleculen CD80 en CD86 (Figuur 2D). Dit komt overeen met eerdere waarnemingen van de huid explantkweken en FITC huidstudies 11, ondersteunen het concept dat trekkende DCs geactiveerde cellen. Belangrijk is dat zowel de LN-resident DCs (MHC-II + CD11c hoog cellen) en plasmacytoïde DCs (MHC-II laag CD11c laag PDCA-1 + cellen), die ontstoken LNS te voeren door middel van hoge endotheliale venules en niet afferente lymfevaten 12, waarbij negatief voor CFSE (figuur 2EF), wat suggereert inderdaad dat CFSE labeling deed zich vooral voor in de voetzool.
Gezien het feit dat MHC-II hoge CD11c + / laag cellen vormen niet één maar meerdere DC subpopulaties 13, de extra oppervlakte markers CD103, EpCAM (CD326) en CD11b werd opgenomen in het antilichaam kleuring paneel gebruikt voor flowcytometrische detectie (Materials Table) verder karakteriseren populatie trekkende DCs (figuur 3). Daarbij een subpopulatie van EpCAM laag CD11b hoog cellen werd geïdentificeerd als de belangrijkste trekkende huid DC set in reactie op BCG infectie (Figuur 3).
De flowcytometrische data hier werd verkregen op een flowcytometer met 4 lasers (488, 532, 640 en 405 nm). De gegevens werden geanalyseerd met een mobiele analysesoftware. Andere multi-color flowcytometers dan aangegeven in de tabel Materials kan worden gebruikt voor de succesvolle detectie van de in de hierboven genoemde studies markers of de detectie van andere markers, op andere celtypen dan ook. Voor de hierin beschreven protocol, een cytometer opsporen van 6 verschillende fluorochromen is necessary. Belangrijk is dat de klonen voor elk antilichaam gebruikte gespecificeerd (Materials Table). De keuze van fluorochroom-conjugaat moet worden geacht die hangt af van de lasers en detectiekanalen op de flowcytometer beschikbaar. Evenzo moet antilichamen worden getitreerd om de meest geschikte verdunningen kleuring bepalen.
Bevolking frequenties in BCG- en PBS-geïnjecteerde monsters werden geplot en gebruikt in combinatie met de totale celtellingen om absolute aantallen gedefinieerd, gated subsets van DCs te berekenen. De betekenis van de verschillen in data groep middelen werd geanalyseerd door Student 'st-test of ANOVA in voorkomend geval, met een cut-off van p <0,05. Uitschieters werden uitgesloten van de analyse volgende proef Grubbs 's voor uitschieters.
Figuur 1. Schets: BCG Footpad InfectieModel en CFSE-gebaseerde assay migratie. BCG wordt geïnoculeerd in de voetzool van C57BL / 6 muizen. Op verschillende tijdstippen na infectie en 24 uur vóór opoffering wordt de fluorochroom CFSE geïnjecteerd in dezelfde voetzool die eerder BCG ontvangen. De drainage, knieholte lymfeklieren is geïsoleerd en CFSE-gelabelde cellen gekenmerkt door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. trekkende huid DCs een belangrijke populatie verplaatsen naar de DLN Na Footpad BCG infectie. C57BL / 6-muizen werden geïnfecteerd met 1 x 10 6 CFU van BCG in de voetzool. Vierentwintig uur vóór opoffering werden dieren geïnjecteerd met 0,5 mM CFSE in dezelfde voetzool. Knieholte LNS werden geoogst, gehomogeniseerdin single-cell schorsingen en onderworpen aan flowcytometrie. Voor metingen 1 dag na BCG, werd CFSE geïnjecteerd 2 uur na BCG. (A en B) toont plots Zebra overheersende expressie van CFSE op MHCII hoog en CD11c + / laag cellen in BCG-drainerende pLN 3 dagen na infectie. (C) Frequentie en het totale aantal van CFSE-gelabelde MHCII hoge CD11c + / laag cellen in PLN van BCG- en PBS-geïnjecteerde muizen werden geplot op verschillende tijdstippen. (D) De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor CD80 en CD86 werd bepaald op CFSE + en CFSE neg MHC-II hoge CD11c + / laag huid DCs in PLN 3 dagen na BCG infectie. (E) CFSE expressie in de huid DCs (MHC-II hoge CD11c + / laag), LN-resident DCs (MHC-II + CD11c hoog) en (F) plasmacytoide DCs (MHC-II laag CD11c laag PDCA-1 +)werd bepaald met stromingscytometrie 3 dagen na BCG. Voor elk experiment werden tenminste 5 muizen gebruikt voor BCG-geïnfecteerde groepen en 3 voor PBS-geïnjecteerde controles. Balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. Totaal aantal CFSE-gelabelde cellen in elke subset worden gegeven in Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 3. * Geeft statistisch significante verschillen tussen BCG-geïnfecteerde controles en PBS. Een van twee onafhankelijke experimenten getoond. Figuur aangepast van Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 3, met toestemming van de uitgever Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. EpCAM laag CD11b hoog DCs zijn de Main Skin DC subset Traffickgens de DLN Na BCG Footpad infectie. C57BL / 6 muizen werden geïnjecteerd met BCG en CFSE zoals in figuur 2. (A) Zebra plots tonen gating aanwendt (bovenste paneel) en frequentie van CFSE + cellen in elk gedefinieerde groep op verschillende tijdstippen na BCG infectie (onderste panelen). Frequenties in elke subset kan variëren naargelang het tijdstip na infectie. Na 3 dagen van BCG kan men verwachten dat ongeveer 0,2% MHC-II + CD11c hoog / laag cellen onder alle LN cellen vinden. Hiervan ongeveer 6% zijn CD103 + cellen. Voor de subgroepen binnen de MHC-II hoge CD103 negatief poort, kan men ongeveer 42% CD11b hoge EpCAM laag cellen, 27% CD11b laag EpCAM laag cellen en 7% LCs vinden. (B) Totaal aantal CFSE + cellen in elk gedefinieerde groep op verschillende tijdstippen na BCG infectie wordt getoond. Voor elke experiment werden ten minste 5 muizen gebruikt voor BCG-geïnfecteerde groepen en 3 voor PBS controle. Balken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. * Geeft statistisch significante verschillen ten opzichte van PBS-geïnjecteerde controles. Een van de drie onafhankelijke experimenten getoond. Figuur opnieuw afgedrukt vanaf Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 3, met toestemming van de uitgever Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
noDCs zijn gespecialiseerde antigen presenterende cellen die kunnen reageren op microbiële op lichaamsoppervlakken door het verwerven microbiële antigenen en migreren naar DLN via lymfevaten. Er DCs presenteren dit antigeen aan T-cellen op een wijze die primaire T-celreacties drijft. De DC migratie van weefsel DLN is derhalve zeer belangrijk om te begrijpen hoe een productieve T-celrespons geïnitieerd. Methoden om DC migratie meten dus zeer nuttig in ontvouwen bovenstaande.
Een muis model werd gebruikt om de huid DC migratie naar DLN na infectie met BCG, een levend vaccin dat klinisch wordt geïnjecteerd in de huid te bestuderen. In lijn, is BCG geïnjecteerd in de achterste voetzool om dit cutane route van vaccinatie na te bootsen. Een eenvoudige test ontwikkeld en derhalve verwerkt dit model om de migratie van de huid DC subpopulaties van BCG inoculatie bij voetzool huid wegvloeien pLN onderzoeken. Dit protocol relies injecteren op het fluorochroom CFSE in dezelfde voetzool die eerder BCG ontvangen en vervolgens het isoleren van het aftappen pLN 24 uur later op de aanwezigheid van CFSE-gelabelde cellen cytometrie geanalyseerd door flow. Hoewel niet in het protocol beschreven, kan LNS van deze opstelling ook worden bereid voor analyse door confocale microscopie, migratie processen te bestuderen zoals de ligging van migrerende cellen in de LN 3. Bovendien zijn vergelijkbare resultaten op BCG-getriggerd huid DC migratie is verkregen met behulp van zowel BCG Pasteur 1173P2 3 en BCG SSI 1331 14.
CFSE wordt vaak gebruikt om cellen in vitro labelen en dergelijke gelabelde cellen in vivo te volgen nadat cellen 15 transfers. In het huidige protocol echter, werd het gebruikt om huidcellen direct te labelen in situ. De moleculaire basis van CFSE labeling is vergelijkbaar met FITC, die eveneens een amine-reactieve fluorescerende kleurstof. CFSE heeft echter de voorkeur boven FITC om de vervoeging als het creates zeer stabiele bindingen carboxamide 16. Bovendien CFSE zeer permeabel membraan en passief diffundeert in cellen. Eenmaal binnen vormt intracellulaire amine (TL) conjugaten die worden vastgehouden in de gelabelde cel 15.
De CFSE-gebaseerde migratieanalyse ontwikkeld door de auteurs maakt de identificatie van cellen verhuizen van huid DLN binnen een 24-uurs periode in reactie op BCG. Het meet dus acute migratie gedurende een bepaalde periode en maakt het mogelijk om het vermogen van verschillende onderzoeken, geïnjecteerd stimuli migratie veroorzaken. Deze test verschilt van de klassieke techniek van FITC huidstudies, die een cumulatieve migratie gebeurtenis veroorzaakt door cutane, topicale contact sensibiliserend middel meet. Aldus kan de CFSE-gebaseerde assay migratie worden gebruikt om trekkende huid DCs of andere cellen die de thuisbasis van de pLN na de injectie van microben, microbiële of andere inflammatoire stimuli in de F identificerenootpad. Inderdaad, zowel neutrofielen en γ: δ T-cellen hebben aangetoond dat het verplaatsen van huid DLN als reactie op BCG 17,18. In feite werd de bepaling recent gebruikte in een co-infectie instelling om aan te tonen dat een darm gelokaliseerde nematodeninfectie BCG-getriggerd huid DC migratie kan dempen tot DLN 14.
DC migratie wordt vaak bepaald tussen 24 tot 72 uur bij FITC huidstudies aangezien FITC-gelabelde DCs moeilijk is om 4 tot 5 dagen na het schilderen 19. Verlies van de CFSE signaal op het label DC is niet een probleem in de test hier gepresenteerde sinds analyse van de migratie werd beperkt tot 24 uur; De reden hierachter is dat de auteurs wilden specifiek studeren "overnight" migratie evenementen. Anderen die geïnteresseerd zijn in deze test worden echter aangemoedigd om eerder of zelfs latere tijdstippen voor CFSE-based tracking onderzoeken. Aangezien CFSE geïntroduceerd door injectie kan worden toegediend op elk bepaalde tijd. Deze flexibiliteit mag het eenuthors naar DC migratie tussen dag 5 en 6 na BCG infectie (figuur 2C) 3 te beoordelen. Injecteren CFSE zou kunnen beperken de celtypen toegankelijk in situ de labelingsreactie. Bijvoorbeeld Langerhans cellen (LC), die DCs die op de bovenste laag van de huid bevinden zijn, de epidermis, migreren slecht in reactie op BCG in de CFSE-gebaseerde assay migratie (figuur 3) 3. Tijdens FITC huidstudies, DCs gelegen in de dermis, de laag onder de epidermis, kunnen gemakkelijk gelabeld en migreren naar de DLN sneller dan LCs 20,21. Dit suggereert dat cellen fluorochroom-gemerkt kan worden zonder het noodzakelijkerwijs te lokaliseren om de laag van de huid waar de labelingoplossing wordt toegepast.
Als model voor BCG-infectie, de muis oor biedt een bona fide intradermale route van inoculatie die meer in lijn met de klinische toediening van BCG als een tuberculose-vaccin. footpad injectie anderzijds, is waarschijnlijk een combinatie van de intradermale en subcutane routes. Dat gezegd hebbende, vereist vaardigheid en training correct en reproduceerbaar leveren BCG de dermis 22, dus in de klinische praktijk niet altijd worden gespeeld intradermale gegeven maar subcutaan of een combinatie van beide. Als een inenting site van de voetzool heeft wel twee zeer duidelijke voordelen ten opzichte van het oor die verdienste vermelden. Eerst wordt de immuunrespons geconcentreerd wegvloeien pLN na een voetzool injectie en dit vergemakkelijkt het onderzoek van de reacties. De auteurs van dit rapport vond de pLN de eerste en belangrijkste LN aftappen van de voetzool 3 zijn. Anderen hebben split drainage tussen de knieholte en subiliac LNS stelde na injectie van Evan's blue 23. Niettemin met betrekking tot het oor, is er meer dan één oor DLN bij muizen en deze kunnen niet regelmatig aanwezig of 24 gemakkelijk te vinden zijn. Laatstgenoemde introduceert duidelijk een liabiliteit in studies op zoek naar antwoorden in DLN onderzoeken. Ten tweede, kunnen grotere volumes worden geïnoculeerd in de voetzool (10-50 pl) vergeleken met het oor. Dit op zijn beurt zowel minimaliseert de aansprakelijkheid van de invoering van de belangrijkste veranderingen in lymfatische flow en van het hebben om te werken met zeer kleine injectie volumes, dat is op zich al een probleem als het gaat om het enten van grote hoeveelheden mycobacteriën. In het oor bij injectievolume kleine (1-10 pi) worden, zelfs 5 pl lymfestroom veranderen en mogelijk een grotere hoeveelheid van het geïnjecteerde materiaal dwingen rechtstreeks in de DLN op een ongecontroleerde wijze. Daarom is het belangrijk om rekening te houden injectievolume. Dit is vooral belangrijk in proeven omtrent de bijdrage van cellen in ferrying bacteriën aan de LN. In de BCG voetzool model, kunnen sommige BCG de DLN in afwezigheid van cellulaire transport bereikt. Dit is gebaseerd op de waarneming dat men nog BCG kan detecteren in de DLN muizen waarin celmigratie van de voetpad werd volledig teniet gedaan door de lokale injectie van pertussis toxine 3. Of dit een indicatie dat BCG direct lymfevaten toegang en bereiken de DLN in een echt celvrije wijze te bepalen aangezien niet kan worden uitgesloten dat mycobacteriën blijft in dit geval toegang krijgen tot lymfevaten met geweld van het geïnjecteerde volume.
Een praktische overweging voor inentingen in het oor of voetzool is dat dieren dienen adequaat te worden geïmmobiliseerd voor injecties correct en op een reproduceerbare wijze worden uitgevoerd. Isofluraan gas wordt in de huidige protocol als methode om dieren te beperken ter voorbereiding voetkusseninjecties. De relatief snelle inductie en herstel tijden voor isofluraan gemedieerde anesthesie maken het een populaire methode, maar vergelijkbaar met andere anesthetica, het beïnvloedt de fysiologie, die kunnen interfereren met experimentele resultaten 25. Sterker nog, zowel vluchtige en injecteerbare anesthetica verminderen lymfestroom door het afschaffenvrijwillige spierbewegingen, het verminderen van spierspanning, en het verminderen van lymfangion contractie 26. Bovendien is een 5-voudige verlaging van migratie naar DLN van DCs adoptief overgedragen in de voetzool gerapporteerd bij geanesthetiseerde dieren 27. Gezien het bovenstaande en aangezien de afhandelingsprocedures voor de anesthesie waarschijnlijk meer stress bij de dieren dan de injectie zelf, die zowel snel te beheren en geen recuperatiestap vereisen, de mogelijkheid om adequaat beperken de dieren zonder verdoving moet beschouwd. Een muis weerhouder aangepast voor voetkusseninjecties, waar het dier kan snel een geïmmobiliseerd positie in de voetzool binnen 30 tot 40 seconden gebracht en geënt zou ideaal zijn om de muis in de voetzool injecteren zonder dat andere aspecten van de fysiologie in de werkwijze en zou zeer nuttig zijn in onderzoeken naar cel migratie door lymphatics zijn.
Kortom, dit verslagwijst op een nieuw protocol voor het bijhouden van de huid DCs tijdens hun mobilisatie aan de DLN gebruik van een test dat migratie controleert gedurende een bepaalde 24-uur-venster. Deze CFSE assay gebaseerd migratie maakt detectie en analyse van migrerende cellen door flowcytometrie, zoals hier beschreven, en door confocale microscopie 3. Het biedt een flexibel platform voor het bestuderen van diverse stimuli geïnjecteerd en hun vermogen om DC migratie veroorzaken, en belangrijker, kan worden gebruikt om niet alleen DCs ook andere populaties verplaatsen van huid DLN in verschillende experimentele instellingen volgen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10 ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
References
- Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206 (2015).
- Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
- Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11 (2007).
- Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
- Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1 (2002).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3 (2001).
- Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
- Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
- Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
- Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9 (2009).
- Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
- Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
- Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
- Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).
