Abstract
Le cellule dendritiche (DC) sono importanti per l'avvio risposte immunitarie, in parte attraverso la loro capacità di acquisire e l'antigene navetta per il linfonodo drenante (DLN). La mobilitazione delle DC al DLN è complesso e deve ancora essere completamente chiarito durante l'infezione. Qui descritto è l'uso di un innovativo, semplice test che si basa sulla fluorocromo 5 e 6 carboxyfluorescein diacetato succinimidyl ester (CFSE) per monitorare la migrazione delle cellule dendritiche durante l'infezione da Mycobacterium bovis zampa Bacille Calmette-Guérin (BCG) in C57BL / 6 topi. Questo test consente la caratterizzazione di pelle DC sub-popolazioni che trasferiscono attivamente il drenaggio, LN poplitea in risposta al BCG. Questo protocollo ha origine da un modello in cui BCG DC pelle migratori sono stati identificati mediante citometria a flusso. Il saggio è amabile per lo studio e l'identificazione di DC o di altre cellule che ospita la LN popliteo dopo l'inoculazione di microbi, i loro metaboliti o altri infiammatoriastimoli nella zampa, e di conseguenza per studiare i fattori che regolano la migrazione di queste cellule.
Introduction
DC localizzati nelle superfici Body Sense microbi o dei loro prodotti, e così facendo mobilitare tramite vasi linfatici alla LN drenaggio (DLN) 1,2. Questo trasferimento è necessario per il trasporto di antigene microbica al DLN e la conseguente innesco delle risposte immunitarie al microbo invasore. Infatti, il blocco o il fallimento di DC di migrare dal tessuto infetto al DLN disattiva la risposta delle cellule T 3-5. Di conseguenza, saggi progettati per monitorare la migrazione a livello di singola cellula sono utili per aiutare attribuire la funzione migratoria ad un dato sottoinsieme DC.
C'è una grande quantità di dati sulla mobilizzazione delle cellule dendritiche pelle al DLN. La seconda rappresenta il gran parte delle conoscenze sulla migrazione DC infiammate o infette siti 2. Ciò non è sorprendente poiché la pelle ospita una grande popolazione di DC ed è una superficie altamente accessibile per sperimentazione nel topo di laboratorio. Diverse tecniche sono state così sviluppato per valutarela migrazione delle cellule dendritiche murini dalla pelle al DLN 2. FITC pittura pelle è di gran lunga l'approccio più comunemente usato. In questo test il fluorocromo fluoresceina-5-isotiocianato (FITC) viene preparato in una miscela di acetone e irritante contatto. Questo cocktail è applicato alla pelle depilata o rasata e l'accumulo di cellule FITC marcate è a sua volta analizzato nel DLN. La migrazione può anche essere studiata iniettando la pelle con nano o microparticelle fluorocromo-tag, che permette il monitoraggio dei fagociti che hanno interiorizzato le particelle fluorescenti nella pelle. I vasi linfatici possono anche essere cannulate per estrarre direttamente DC migrazione da linfa. Questo è però tecnicamente impegnativo, soprattutto nei topi. Il numero di cellule dendritiche ottenute per successiva analisi è anche un fattore limitante.
Nonostante molti studi precedenti sulle migrazioni DC pelle, rimane una scarsità di informazioni per quanto riguarda la pelle DC mobilitazione per DLN seguente Vaccinazione con bacillo di Calmette-Guérin (BCG), il live, ceppo attenuato di Mycobacterium bovis utilizzato per la vaccinazione contro M. la tubercolosi. BCG viene inoculato nella pelle, causando un'infezione limitata che innesca una T helper di tipo 1-cell risposta. Entrambe le sottopopolazioni DC che mobilitano al DLN dalla pelle BCG-infettati e dei fattori che regolano la loro migrazione durante questo processo non sono pienamente compresi. Alla luce di quanto sopra, un metodo semplice ma novella stato sviluppato dove il fluorocromo 5 e 6 carboxyfluorescein estere diacetato succinimidyl (CFSE) viene iniettato in situ per monitorare la migrazione delle DC nel DLN 3. Topi C57BL / 6 vengono iniettate nella zampa posteriore con un inoculo di BCG e il giorno prima del sacrificio, gli animali vengono iniettati nella stessa zampa con un'alta concentrazione di CFSE. Ventiquattro ore più tardi gli animali vengono sacrificati e il drenaggio popliteo LN (PLN) rimossi e preparati per citometria a flusso. Questo test consente l'IDEntification di cellule che migrano overnight dalla pelle zampa al DLN (Figura 1).
Inoltre, i topi del gene-mirati possono essere utilizzati per aiutare a identificare i fattori necessari per le cellule di mobilitarsi per la DLN. Usando questo test, di questo rapporto gli autori hanno scoperto che in precedenza EpCAM basso CD11b alta migratoria trasporto DC pelle BCG alla DLN in un processo regolato da recettore dell'interleuchina-1 e l'adattatore intracellulare molecola MyD88 3. Il protocollo per questo saggio la migrazione CFSE-based che ha origine dalla relazione di cui sopra da Bollampalli et al. 3 dove citometria di flusso è stato utilizzato per rilevare e analizzare DC pelle migratori, viene qui descritto. I vantaggi e svantaggi di questo test sono discussi.
Protocol
NOTA: C67BL / 6 topi sono stati usati per gli esperimenti riportati in questo manoscritto. Questi animali erano casa sotto specifiche condizioni esenti da organismi patogeni presso l'impianto animale MTC, Karolinska Institutet, Stoccolma, Svezia. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le direttive e gli orientamenti del Consiglio svedese per l'agricoltura, l'Agenzia per la protezione degli animali svedese e Karolinska Institutet. Gli esperimenti sono stati approvati dal Nord Animal Consiglio Etico di Stoccolma.
1. Preparazione degli stock e dei bagagli CFSE
- Preparare un 5 mM magazzino di 5 e 6 carboxyfluorescein diacetato succinimidyl ester (CFSE) in dimetilsolfossido. Vortice. Dispensare aliquote di 100 microlitri in sterili, 0,5 ml vite microtubi cap. Aliquote conservare a -80 ° C.
2. I topi
- Utilizzare maschi inbred o topi di sesso femminile tra 8 e 12 settimane di età. animali per sesso e della stessa età sono preferiti. Assicurarsi che i necessari permessi etici animali are al suo posto prima dell'inizio degli esperimenti.
3. immobilizzazione degli animali con isoflurano Gas anestesia
- Caricare l'unità di anestesia con isoflurano. Riempire la siringa di vetro da 10 ml a tenuta di gas con isoflurano. Evitare l'introduzione di bolle d'aria. Collegare la siringa e l'ingresso del liquido con il tubo in dotazione e spostare lo spintore in avanti fino a quando il liquido nel tubo di collegamento è visibilmente solo per entrare nel vaporizzatore.
NOTA: Non conservare isoflurano nella siringa quando non in uso. - Anestetizzare animali con isoflurano nella camera di induzione, con un flusso d'aria mantenuta a circa 400 - 500 ml / min e la concentrazione di isoflurano a 3,5%.
NOTA: L'unità non funziona senza il flusso d'aria. - Una volta che gli animali dormono, girare il rubinetto di arresto dell'unità di anestesia per instradare il gas isoflurano al pezzo maschera. Controllare che il pezzo maschera è intatto al fine di evitare perdite di gas. Il flusso d'aria può essere mantenuta a 400 ml / min, alternativamente diminuita a 200 ml / min. Ridurre la concentrazione di isoflurano al 2,6%.
NOTA: effetto anestetico può essere aumentato e / o diminuito regolando la portata.
4. BCG Iniezioni e recupero
- Visivamente confermare e effettuare test, come la punta pinch test reflex per accertare che i topi sono immobilizzati / addormentato sul pezzo maschera isoflurano prima di eseguire iniezioni.
- Seminare nella zampa posteriore, 1 x 10 6 unità formanti colonia di Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) in 30 ml di PBS usando una siringa con un 29 G x ½ pollice ago.
NOTA: La generazione di scorte micobatteri è brevemente descritto nella descrizione originale di questa procedura 3, e in sostanziale dettagliatamente altrove 6. BCG è anche facilmente disponibili da fonti commerciali. Gli autori raccomandano che BCG sia impulsi sonicato o passata attraverso una siringa per interrompere grumi prima della sua inoculation in topi. BCG è ripetuto qui come stimoli microbici dato il suo impiego nella descrizione originale del presente protocollo 3, ma gli autori certamente incoraggiano la sperimentazione di altri stimoli microbici. - Eseguire la stessa procedura descritta sopra per l'iniezione di PBS in topi di controllo.
- Monitorare gli animali dopo le iniezioni di confermare che il recupero dall'anestesia è successo e che gli animali possono sostenersi in iniettato, zampa posteriore.
5. CFSE Iniezioni
- Preparazione di CFSE per preparazioni iniettabili:
- Scongelare una fiala di 5 mm CFSE soluzione di riserva da -80 ° C. Diluire il CFSE 10 volte in PBS. Risospendere la soluzione accuratamente prima di riempire la siringa in preparazione per l'iniezione.
- CFSE iniezione e ripristino:
- Ripetere la procedura per anestetizzare gli animali nel capitolo 3 Iniettare 20 ml di 0,5 mm CFSE nella zampa posteriore che in precedenza ha ricevuto BCG o PBS.
- Ripetere la procedura per anestetizzare gli animali nel capitolo 3 Iniettare 20 ml di 0,5 mm CFSE nella zampa posteriore che in precedenza ha ricevuto BCG o PBS.
6. La rimozione chirurgica di poplitea Lymph Node (PLN)
NOTA: l'uso di strumenti chirurgici sterilizzati e la loro decontaminazione ripetuto nel 70% di etanolo sono incoraggiati nel corso di questo passo.
- Euthanize i topi. Spruzzare l'animale con il 70% di etanolo. Pin l'animale in posizione dorsale, su una tavola di dissezione.
NOTA: Gli autori possono consigliare l'eutanasia attraverso dislocazione cervicale. - fare attenzione un incisione verticale nella coscia posteriore. muscolare chiaro e il grasso con le forbici e pinzette per esporre e di conseguenza asportare le PLN Situato in profondità nel sacchetto grasso, nell'incavo del ginocchio.
- Trasferire il pln a 0,5 ml di PBS sterile, sul ghiaccio.
7. Generazione di cella singola sospensione da PLN
- Omogeneizzare il pln attraverso un 70 micron colino cella placEd in un 6 pozzetti contenenti 5 ml di PBS o cella a fluorescenza-attivato (FACS) tampone (PBS contenente 2% siero fetale di vitello (FCS), 5 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), e 1 mm di sodio azide). Omogeneizzare attraverso il filtro utilizzando l'estremità posteriore di una siringa da 3 ml.
NOTA: sodio azide è tossico e deve essere maneggiato con cautela. - Lavare il filtro con altri 5 ml di PBS o FACS tampone, raccogliere il materiale in una provetta da 15 ml e agglomerare le cellule a 277 xg (1.200 rpm, R = 172 millimetri) per 5 min, 4 ° C. In alternativa, omogeneizzare pLNs direttamente in provette da microcentrifuga utilizzando omogeneizzatori polipropilene.
- In base alle dimensioni del pellet, risospendere la sospensione pln in un volume appropriato di PBS o di tampone FACS, ad esempio, 200 - 1,000 microlitri. Utilizzare una camera di conteggio per quantificare il numero totale di cellule ottenute da ogni sospensione LN. Utilizzare trypan blu per escludere / cellule morenti morte.
8. cellulare colorazione e Citometria a Flusso
- Transfer 1 - 10 x 10 6 cellule a 5 ml provette di polistirene a fondo rotondo. Lavare con FACS tampone, e pellet per centrifugazione a 277 g (1.200 rpm, R = 172 millimetri) per 5 minuti, 4 ° C.
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 50 - 100 ml di cocktail di anticorpi (vedi cellule dendritiche [CC] marcatori utilizzati per la colorazione superficiale, Materiali Table) contenente 0,5 - 1 mg di anti-topo CD16 / CD32 (per bloccare Fc-mediata non specifico interazioni) in FACS buffer per 30 - 45 minuti, su ghiaccio. Proteggere i campioni dalla luce.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule con tampone di FACS e pellet per centrifugazione a 277 g (1.200 rpm, R = 172 millimetri) per 5 minuti, 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 50 - 100 microlitri di tampone FACS. Acquisire dati su un citofluorimetro 7-10.
NOTA: Per ottime recensioni su citometria a flusso rimandiamo il lettore alle seguenti pubblicazioni che trasmettono sia informazioni teoriche e pratiche su questo metodo.
Representative Results
Il test di migrazione CFSE-based (figura 1) è stato utilizzato insieme con citometria a flusso per rilevare e caratterizzare le cellule CFSE-marcate che appaiono nel infezione pln dopo BCG nella zampa. Una gran parte di etichettatura CFSE nel PLN si trova su MHC-II ad alta e CD11c + / cellule bassi (Figura 2A), in linea con i controller della pelle che sono migrati a pelle DLN 11. Sia la frequenza e il numero totale di CFSE marcato, MHC-II ad alta CD11c + / cellule bassi sono aumentati in pLNs da topi BCG-infetti rispetto ai controlli PBS-iniettati (Figura 2B-C), il che suggerisce che BCG migliora il trasferimento di questi celle a DLN. Dal momento che questa migrazione misure di analisi nel corso di un periodo di 24 ore, è stato possibile stabilire che le cellule dendritiche della pelle sono ancora entrando l'infezione DLN 5 giorni dopo (Figura 2C). Questo si estende la migrazione DC nel modello di corrente ben oltre la linea temporale per activati inizialesu di cellule antigene-specifiche T CD4 + nel pln 3. Inoltre, DC pelle migratori esprimono livelli elevati di molecole co-stimolatorie CD80 e CD86 (Figura 2D). Ciò è coerente con precedenti osservazioni provenienti da culture espianto di pelle e la pelle FITC pittura 11, sostenendo il concetto che DC migratori sono cellule attivate. DC È importante sottolineare che, sia LN-residenti (alti cellule MHC-II + CD11c) e DCS plasmacitoidi (MHC-II basso CD11c cellule bassi PDCA-1 +), che entrano LNs infiammate attraverso alti venule endoteliali e non i linfatici afferenti a 12, dove negativo per CFSE (Figura 2EF), suggerendo anzi che l'etichettatura CFSE si è verificato soprattutto nella zampa.
Dato che MHC-II ad alta CD11c + / cellule bassi non rappresentano uno ma più sottopopolazioni DC 13, i marcatori di superficie CD103 supplementari, EpCAM (CD326) e CD11b sono stati inclusi nel pannello di colorazione degli anticorpi utilizzati per la rilevazione mediante citometria a flusso (Materiali tabella) per caratterizzare ulteriormente la popolazione di cellule dendritiche migratori (Figura 3). In tal modo, una sotto-popolazione di cellule CD11b bassa elevata EpCAM è stato identificato come il principale pelle migratoria DC sottoinsieme in risposta alle infezioni BCG (Figura 3).
I dati di citometria a flusso mostrato qui è stato acquisito in un citofluorimetro dotato di 4 laser (488, 532, 640 e 405 nm). I dati sono stati analizzati con il software di analisi delle cellule. Altri citometri a flusso multi-colore rispetto a quello indicato nella tabella I materiali possono essere impiegati per l'individuazione dei marcatori indicati negli studi di cui sopra, o il rilevamento di altri marcatori, su altri tipi di cellule per quella materia. Per il protocollo qui descritto, un citometro in grado di rilevare 6 fluorocromi differenti è necessario. È importante sottolineare che i cloni per ogni anticorpo utilizzati sono specificati (Materials Table). La scelta di coniugato fluorocromo deve essere considerato come questo può dipendere dalle laser e canali di rilevamento sul citofluorimetro disponibili. Analogamente, gli anticorpi devono essere titolati per determinare le diluizioni più appropriati per la colorazione.
frequenze Popolazione nel BCG- e campioni di PBS-iniettate sono stati rappresentati graficamente e utilizzati insieme con conta di cellule totali per calcolare i numeri assoluti di definito, sottoinsiemi gated di DC. La significatività delle differenze di mezzi gruppo di dati è stata analizzata con Student 'st prova o ANOVA se del caso, con un cut-off di p <0.05. I valori anomali sono stati esclusi dall'analisi seguente test di Grubbs s 'per valori anomali.
Figura 1. Schema: BCG Footpad InfezioneModello e CFSE-Based Migration Assay. BCG viene inoculato nella zampa posteriore del C57BL / 6 topi. In diversi momenti dopo l'infezione, e 24 ore prima del sacrificio, il fluorocromo CFSE viene iniettato nella stessa zampa che in precedenza ricevuto BCG. Il drenaggio, linfonodo popliteo è isolato e le cellule caratterizzate da flussi CFSE-etichettato citometria. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. DC pelle migratori sono una popolazione maggiore trasferirsi al DLN Dopo BCG Footpad infezione. C57BL / 6 topi sono stati infettati con 1 x 10 6 CFU di BCG nella zampa. Ventiquattro ore prima del sacrificio, gli animali sono stati iniettati con 0,5 mM CFSE nella stessa zampa. LNs poplitea sono state raccolte, omogeneizzatiin cella singola sospensioni e sottoposti a citometria a flusso. Per misurazioni effettuate 1 giorno dopo BCG, CFSE è stato iniettato 2 ore dopo BCG. (A e B) trame Zebra che mostrano espressione predominante di CFSE su MHCII alte e CD11c + / bassi cellule in BCG-drenante PLN 3 giorni dopo l'infezione. (C) frequenza e il numero totale di CFSE marcato alta CD11c MHCII + / bassi cellule in PLN da BCG- e topi PBS-iniettati sono state rappresentate graficamente in diversi momenti. (D) di fluorescenza media intensità (MFI) per CD80 e CD86 è stato determinato sulla + / DC bassi della pelle in PLN 3 giorni dopo l'infezione BCG CFSE + e CFSE Neg MHC-II ad alta CD11c. (E) espressione CFSE entro DC pelle (MHC-II ad alta CD11c + / basso), LN residente DC (MHC-II + CD11c alto) e (F) DC plasmacitoidi (MHC-II basso CD11c basso PDCA-1 +)è stata determinata mediante citometria di flusso 3 giorni dopo BCG. Per ogni esperimento, almeno 5 topi sono stati usati per gruppi BCG-infetti e 3 per controlli PBS-iniettati. Barre indicano l'errore standard della media. Numero totale di cellule CFSE-etichettati all'interno di ciascun sottogruppo sono indicati nella Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 3. * Indica differenze statisticamente significative tra i controlli BCG-infetti e PBS. Uno dei due esperimenti indipendenti indicati. Figura adattato da Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 3, con il permesso dell'editore Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. EpCAM basso CD11b alti DC sono la pelle principale cc sottoinsieme Traffickzione alla DLN Dopo BCG Footpad infezione. C57BL / 6 topi sono stati iniettati con BCG e CFSE come in Figura 2. trame (A) Zebra mostrando gating strategia utilizzata (pannello superiore) e la frequenza di + cellule CFSE all'interno di ogni sottoinsieme definita diverso punti di tempo dopo l'infezione BCG (pannelli in basso). Frequenze all'interno di ogni sottoinsieme possono variare a seconda del punto di tempo dopo l'infezione. Dopo 3 giorni di BCG ci si può aspettare di trovare circa lo 0,2% MHC-II ad alta CD11c + / bassi cellule tra tutte le cellule LN. Di questi, circa il 6% sono CD103 + cellule. Per i sottoinsiemi trovati all'interno della alta CD103 porta negativo MHC-II, si possono trovare circa 42% ad alta EpCAM cellule bassi CD11b, 27% CD11b basso EpCAM bassi cellule e il 7% LC. (B) viene visualizzato il numero totale di CFSE + cellule all'interno di ciascuna, sottoinsieme definito in diversi momenti dopo l'infezione BCG. Per ogni experiment, almeno 5 topi sono stati usati per gruppi BCG-infette e 3 per i controlli PBS. Barre indicano l'errore standard della media. * Indica differenze statisticamente significative rispetto ai controlli PBS-iniettate. Uno dei tre esperimenti indipendenti visualizzati. Figura ri-stampato dal Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 3, con il permesso dell'editore Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
noDCs sono cellule specializzate che presentano l'antigene in grado di rispondere alla sfida microbica alle superfici del corpo con l'acquisizione di antigene microbica e la migrazione a DLN via linfatica. Ci, DC presentano questo antigene alle cellule T in modo che guida le risposte T-cellulari primarie. Il processo di migrazione DC da tessuto a DLN è quindi estremamente importante per comprendere come si avvia una risposta T-cellulare produttivo. Metodi per misurare la migrazione DC sono quindi molto utili nel dispiegamento sopra.
Un modello di topo è stato impiegato per studiare pelle migrazione CC per DLN dopo infezione con BCG, un vaccino vivo che viene iniettato clinicamente nella pelle. In linea, BCG viene iniettato nella zampa posteriore di imitare questo percorso cutanea della vaccinazione. Un semplice test è stato sviluppato e quindi incorporato in questo modello per studiare la migrazione di pelle DC sottopopolazioni dal sito di inoculazione BCG nella pelle zampa al pln drenaggio. Questo protocollo relies sulla iniettare il fluorocromo CFSE nella stessa zampa che precedentemente ricevuto BCG e quindi isolare il drenaggio PLN 24 ore dopo per analizzare la presenza di cellule CFSE etichettati mediante citometria di flusso. Anche se non è descritto nel protocollo, LNs da questa configurazione possono anche essere preparati per l'analisi al microscopio confocale, per studiare i processi di migrazione, come il posizionamento delle cellule migratorie nel LN 3. Inoltre, i risultati simili in materia di migrazione DC pelle BCG-triggered sono stati ottenuti utilizzando sia BCG Pasteur 1173P2 3 e BCG SSI 1331 14.
CFSE è comunemente usato per etichettare le cellule in vitro e per tenere traccia di tali cellule marcate in vivo dopo i trasferimenti di cella 15. Nel protocollo attuale, però, è stato utilizzato per etichettare direttamente le cellule della pelle in situ. La base molecolare di etichettatura CFSE è simile a FITC, che è anche un colorante fluorescente ammina reattiva. CFSE è comunque preferibile rispetto FITC per coniugazione come creAtes obbligazioni carbossamide molto stabili 16. Inoltre, CFSE è altamente membrana permeabile e diffonde passivamente nelle cellule. Una volta dentro, si forma ammina intracellulare (fluorescente) coniugati che vengono conservati nella cella con l'etichetta 15.
Il test di migrazione CFSE-based sviluppato dagli autori consente l'identificazione delle cellule trasferirsi dalla pelle a DLN entro un periodo di 24 ore in risposta alla BCG. Misura quindi la migrazione acuta nel corso di un periodo di tempo definito e permette di indagare la capacità di diverso, iniettato stimoli per innescare la migrazione. Questo test è diverso dalla tecnica classica di FITC pittura pelle, che misura un evento di migrazione cumulativa innescato da cutanea, applicazione topica di un agente contatto sensibilizzante. Così, il saggio di migrazione CFSE-based può essere impiegato per identificare DC pelle migratori o altre cellule che ospita il pln dopo l'iniezione di microbi, prodotti microbici o altri stimoli infiammatori nel footpad. Infatti, entrambi i neutrofili e γ: δ cellule T hanno dimostrato di trasferirsi dalla pelle al DLN in risposta al BCG 17,18. In realtà, il test è stato recentemente utilizzato in un ambiente co-infezione per dimostrare che una infezione nematode gut-localizzato potrebbe disattivare migrazione DC pelle BCG-triggered per DLN 14.
Migrazione DC è spesso valutato tra i 24 a 72 ore a FITC pittura pelle in quanto coniugati con fluoresceina DC sono difficili da individuare 4 o 5 giorni dopo la verniciatura 19. Perdita del segnale CFSE su etichetta DC non è un problema nel test qui presentata poiché l'analisi della migrazione è stato limitato a 24 ore; La ragione di questo è che gli autori hanno voluto studiare specificamente "di notte" eventi di migrazione. Altri interessati a questo test sono comunque invitati a verificare precedenti o anche più tardi punti di tempo per il monitoraggio CFSE-based. Inoltre, poiché CFSE è introdotto per iniezione può essere somministrato in qualsiasi tempo definito. Questa flessibilità ha permesso l'unauthors per valutare la migrazione continua tra il giorno 5 e 6 dopo l'infezione BCG (Figura 2C) 3. Iniettare CFSE potrebbe potenzialmente limitare i tipi di cellule accessibili in situ per la reazione di marcatura. Ad esempio cellule di Langerhans (LCS), che sono cellule dendritiche che risiedono nello strato superiore della pelle, l'epidermide, migrano male in risposta al BCG nel test di migrazione CFSE-based (Figura 3) 3. Tuttavia, durante FITC pittura pelle, DC posizionati nel derma, lo strato sotto l'epidermide, sono facilmente etichettati e migrare verso il DLN più veloce di LC 20,21. Questo suggerisce che le cellule possono diventare fluorocromo marcato senza necessariamente dover localizzare allo strato di pelle in cui viene applicata la soluzione di etichettatura.
Come modello per l'infezione BCG, l'orecchio del mouse fornisce una via intradermica in buona fede di inoculazione che è più in linea con l'amministrazione clinica di BCG come vaccino tubercolosi. foiniezione otpad invece, è probabile che una combinazione di intradermica e via sottocutanea. Detto questo, richiede abilità e formazione correttamente e riproducibile fornire BCG al derma 22, quindi in pratica clinica non sempre può essere dato veramente intradermica bensì sottocutanea o una combinazione di entrambi. Come un sito di inoculazione della zampa ha due vantaggi molto chiari sopra l'orecchio che il merito di nota. Innanzitutto, la risposta immunitaria viene concentrato a PLN scarico dopo un'iniezione zampa e questo facilita l'esame delle risposte. Gli autori di questo rapporto ha trovato il pln di essere il primo e principale LN scaricare la zampa 3. Altri hanno suggerito di drenaggio spaccatura tra i poplitea e subiliac LNs dopo l'iniezione di Evan di blu 23. Tuttavia, per quanto riguarda l'orecchio, vi è più di un orecchio DLN nei topi e questi possono non essere presenti regolarmente o facile da individuare 24. Quest'ultimo presenta chiaramente un liability in studi che cercano di indagare le risposte a DLN. In secondo luogo, i volumi più grandi possono essere inoculati nella zampa (10 - 50 ml), rispetto per l'orecchio. Questo a sua volta riduce al minimo sia la responsabilità di introdurre importanti modifiche nel flusso linfatico e di dover lavorare con molto piccoli volumi di iniezione, che è di per sé un problema quando si tratta di inoculando grandi quantità di micobatteri. In dell'orecchio dove volumi di iniezione devono essere piccoli (1-10 ml), anche 5 microlitri possono alterare il flusso linfatico e potenzialmente forzare una maggiore quantità di materiale iniettato direttamente nel DLN in modo incontrollato. È quindi importante tenere conto di volumi di iniezione. Ciò è particolarmente importante in esperimenti affrontano il contributo delle cellule in traghettare batteri alla LN. Nel modello zampa BCG, alcuni BCG può aver raggiunto il DLN in assenza di trasporto cellulare. Questo si basa sull'osservazione che si può ancora rilevare BCG nel DLN di topi in cui migrazione delle cellule dal piedepad è stato interamente ablated da iniezione locale di tossina della pertosse 3. Se questa è un'indicazione che BCG può accedere direttamente linfatici e raggiungere il DLN in maniera veramente acellulare resta da determinare poiché non si può escludere che i micobatteri in questo caso dato accesso linfatici forza del volume iniettato.
Una considerazione pratica per vaccinazioni nell'orecchio o zampa è che gli animali devono essere adeguatamente immobilizzato per iniezioni da effettuare correttamente e in modo riproducibile. gas isoflurano è descritto nel protocollo corrente come metodo per trattenere gli animali in preparazione per iniezioni zampa. I tempi di induzione e di recupero relativamente rapido per l'anestesia isoflurano mediata rendono un metodo popolare, ma simile ad altri agenti anestetici, colpisce la fisiologia, che può interferire con i risultati sperimentali 25. Infatti, anestetici sia volatili e iniettabili diminuiscono il flusso linfatico attraverso l'abolizionemovimenti muscolari volontari, riducendo il tono muscolare, e la diminuzione linfangione contrazione 26. Inoltre, una riduzione di 5 volte nella migrazione a DLN delle DC adoptively trasferito nella zampa è stato riportato in animali anestetizzati 27. Ciò premesso, e poiché le procedure di manipolazione prima dell'anestesia sono suscettibili di causare più stress per gli animali che l'iniezione stessa, che è rapida da gestire e non richiede una fase di recupero, la possibilità di trattenere adeguatamente l'animale senza anestesia dovrebbe essere considerato. Un dispositivo di immobilizzazione del mouse personalizzato per iniezioni zampa, dove l'animale può essere rapidamente portato ad una posizione immobilizzato e inoculata nella zampa in 30 a 40 sec sarebbe ideale per iniettare il mouse nella zampa posteriore senza alterare altri aspetti della sua fisiologia nel processo e sarebbe estremamente utile in studi che riguardano la migrazione delle cellule attraverso i vasi linfatici.
In conclusione, questo rapportomette in evidenza un nuovo protocollo per il monitoraggio DC pelle durante la loro mobilitazione per il DLN utilizzando un test che controlla migrazione durante una finestra di 24 ore definito. Questo test migrazione CFSE-based permette la rilevazione e l'analisi di cellule migranti mediante citometria di flusso, come descritto qui, nonché mediante microscopia confocale 3. Esso fornisce una piattaforma flessibile per studiare una varietà di stimoli iniettati e la loro capacità di attivare la migrazione DC, e soprattutto, può essere impiegato per monitorare non solo controller, ma anche altre popolazioni spostano dalla pelle al DLN durante diverse impostazioni sperimentali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10 ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
References
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