Abstract
As células dendríticas (DCs) são importantes para iniciar respostas imunes, em parte através da sua capacidade de adquirir e antígeno de transporte para o linfonodo regional (DLN). A mobilização de DCs para o DLN é complexo e continua a ser completamente esclarecida durante a infecção. Aqui descrita é a utilização de um ensaio inovador, simples, que se baseia na fluorocromo 5- e diacetato de éster de succinimidilo de 6-carboxifluoresceína (CFSE) para controlar a migração de DC durante a infecção da almofada da pata com Mycobacterium bovis bacilo de Calmette-Guérin (BCG), em ratinhos C57BL / 6 ratinhos. Este ensaio permite a caracterização da pele DC sub-populações que deslocalizam activamente para a drenagem, LN poplítea em resposta à BCG. Este protocolo tem origem a partir de um modelo em que as DCs BCG pele migratórias foram identificados por citometria de fluxo. O ensaio é amável ao estudo e identificação de DCs ou outras células que abriga o LN poplítea após a inoculação de micróbios, seus metabolitos ou outra inflamatóriaestímulos na almofada da pata, e, consequentemente, para estudar factores que regulam a migração destas células.
Introduction
DCs localizadas em superfícies do corpo sentir micróbios ou os seus produtos, e ao fazê-lo mobilizar através de vasos linfáticos para o LN de drenagem (DLN) 1,2. Esta relocalização é necessário para o transporte de antigénio microbiano para a DLN e a consequente estimulação das respostas imunitárias para o microorganismo invasor. De facto, o bloqueio ou falha de DCs a migrar a partir do tecido infectado para a DLN silencia a resposta de células T 3-5. Assim, ensaios destinados a controlar a migração no nível de uma única célula são úteis para ajudar a atribuir função migratório para um determinado subconjunto DC.
Existe um grande corpo de dados sobre a mobilização de DCs pele para o DLN. As últimas contas para grande parte do conhecimento sobre a migração DC a partir de sites inflamados ou infectados 2. Isto não é surpreendente uma vez que a pele abriga uma grande população de DCs e é uma superfície altamente acessível para a experimentação no rato de laboratório. Diversas técnicas têm sido desenvolvidos para avaliara migração de DC de murino a partir da pele para o DLN 2. FITC pintura da pele é, de longe, a abordagem mais utilizada. Neste ensaio a fluoresceína-5-isotiocianato de fluorocromo (FITC) é preparada de uma mistura de acetona e com um irritante de contacto. Este cocktail é aplicada sobre a pele depilada ou raspada e a acumulação de células FITC identificadas por sua vez é analisada no DLN. Migração também pode ser estudado através da injecção da pele com nano ou micropartículas marcado com fluorocromo, que permite a identificação de células fagocíticas que internalizaram as partículas fluorescentes na pele. vasos linfáticos também podem ser canulada para extrair diretamente DCs migrando de linfa. Esta é no entanto tecnicamente difícil, especialmente em ratinhos. O número de DCs obtidas para análise subsequente é também um factor limitativo.
Apesar de muitos estudos anteriores sobre a pele migração DC, continua a haver uma escassez de informações sobre a pele DC mobilização de DLN seguinte vaccinação com o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), o ao vivo, estirpe atenuada de Mycobacterium bovis usada para vacinar contra M. tuberculose. BCG é inoculada na pele, causando uma infecção limitada que desencadeia um tipo de célula auxiliar uma resposta T. Ambos os sub-populações DC que mobilizam ao DLN da pele BCG-infectados e os fatores que regulam a migração durante esse processo não são totalmente compreendidos. Em face do exposto, um método simples mas novo foi desenvolvido, onde o fluorocromo 5- e 6-carboxifluoresceína diacetato de éster de succinimidilo (CFSE) é injectado in situ para localizar a migração de DC no DLN 3. Ratinhos C57BL / 6 foram injectados na almofada da pata traseira com um inoculo de BCG e no dia antes do sacrifício, os animais são injectados na almofada da pata mesmo com uma elevada concentração de CFSE. Vinte e quatro horas mais tarde os animais são sacrificados e a drenagem LN poplítea (PLN) removidos e preparados para citometria de fluxo. Este ensaio permite que o identification de células que migram durante a noite a partir da pele da almofada da pata ao DLN (Figura 1).
Além disso, os ratinhos alvo do gene pode ser utilizada para ajudar a identificar os factores necessários para as células de mobilizar para o DLN. Usando este ensaio, os autores deste relatório ter encontrado anteriormente que EpCAM baixo CD11b alta BCG transporte DCs pele migratório para o DLN em um processo regulado por interleucina-1 receptor eo adaptador intracelular molécula MyD88 3. O protocolo para este ensaio à base de migração CFSE que se origina a partir do relatório acima por Bollampalli et al. 3, em que a citometria de fluxo foi usada para detectar e analisar as DCs pele migratórias, é aqui descrito. As vantagens e desvantagens deste ensaio são discutidos.
Protocol
NOTA: C67BL / 6 murganhos foram usadas para as experiências apresentadas neste manuscrito. Estes animais eram casa em condições livres de patógenos específicos no biotério MTC, Instituto Karolinska, de Estocolmo, Suécia. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as directivas e orientações da Direcção Nacional de Agricultura, a Agência Sueca de Proteção Animal, e Karolinska Institutet. Os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Ética do Norte animal Estocolmo.
1. Preparação de Stocks CFSE e Armazenamento
- Preparar um estoque a 5 mM de éster diacetato succinimidil 5- e 6-carboxifluoresceína (CFSE) em sulfóxido de dimetilo. Vórtice. Dispensar 100 mL alíquotas em estéril, 0,5 ml parafuso microtubos cap. alíquotas armazenar a -80 ° C.
2. Ratos
- Use masculina pura ou camundongos fêmeas entre 8 e 12 semanas de idade. animais sexo e da mesma idade são os preferidos. Certifique-se as necessárias autorizações éticas animais are no lugar antes do início das experiências.
3. A imobilização de animais com isoflurano gás Anesthesia
- Coloque a unidade de anestesia com isoflurano. Encha a seringa de vidro de 10 ml à prova de gás com isoflurano. Evitar a introdução de bolhas de ar. Ligar a seringa e entrada de líquido fornecido com a tubagem e mover o empurrador para a frente até que o líquido no tubo de ligação é visivelmente prestes a entrar no vaporizador.
NOTA: Não armazenar isoflurano na seringa quando não estiver em uso. - Anestesiar os animais com isoflurano na câmara de indução, com uma corrente de ar mantida a aproximadamente 400-500 ml / min e a concentração de isoflurano a 3,5%.
NOTA: A unidade não funcionará sem circulação de ar. - Uma vez que os animais estão a dormir, desligue a torneira na unidade de anestesia para encaminhar o gás isoflurano para a peça de máscara. Verifique se a peça máscara está intacta para evitar vazamento de gás. O fluxo de ar pode ser mantido a 400 ml / min, alternativamente diminuiu para 200 ml / min. Reduzir a concentração de isoflurano para 2,6%.
NOTA: O efeito anestésico pode ser aumentada e / ou diminuída mediante o ajuste da taxa de fluxo.
4. BCG Injeções e Recuperação
- Confirmar visualmente e realizar testes, como o teste do beliscão reflex toe para determinar que os ratos são imobilizados / dormindo na peça máscara isoflurano antes de realizar injecções.
- Inocular na almofada da pata traseira, 1 x 10 6 unidades formadoras de colónias de Mycobacterium bovis bacilo de Calmette-Guérin (BCG), em 30 ul de PBS utilizando uma seringa equipada com uma agulha de 29 x ½ polegada L.
NOTA: A geração de stocks de micobactérias é brevemente descrito na descrição original deste procedimento 3, e em detalhe substancial em outros lugares 6. BCG é também prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais. Os autores recomendam que BCG ser ou passou sonicado pulsos através de uma seringa para perturbar aglomerados antes da sua inoculatiem em ratinhos. BCG é reiterado aqui como um estímulo microbianas dado o seu emprego na descrição original do presente Protocolo 3, mas os autores certamente incentivar o teste de outros estímulos microbianos. - Realizar o mesmo procedimento descrito acima para a injecção de PBS em ratinhos de controlo.
- Monitorar animais após injeções para confirmar que a recuperação da anestesia é bem sucedido e que os animais podem apoiar-se na injetado, pata traseira.
5. Injeções CFSE
- Preparação de CFSE para injectáveis:
- Descongelar um frasco de solução de reserva 5 mM CFSE de -80 ° C. Dilui-se a 10 vezes em PBS com CFSE. Ressuspender a solução exaustivamente, antes do enchimento da seringa, em preparação para a injecção.
- Injeção CFSE e Recuperação:
- Repita o procedimento para anestesiar animais na seção 3. Injectar 20 ul de CFSE 0,5 mM na pata traseira que anteriormente receberam BCG ou PBS.
- Repita o procedimento para anestesiar animais na seção 3. Injectar 20 ul de CFSE 0,5 mM na pata traseira que anteriormente receberam BCG ou PBS.
6. A remoção cirúrgica do Linfonodo Popliteal (PLN)
NOTA: O uso de instrumentos cirúrgicos esterilizados e sua descontaminação repetida em etanol 70% são incentivados ao longo desta etapa.
- Eutanásia dos ratinhos. Pulveriza-se a animais com 70% de etanol. Pin o animal em decúbito dorsal, em uma placa de dissecação.
NOTA: Os autores podem recomendar a eutanásia por deslocamento cervical. - Cuidadosamente fazer uma incisão vertical na coxa traseira. Limpar músculo e gordura usando tesouras e pinças para expor e, consequentemente, extirpar os PLN Localizado no fundo da bolsa de gordura, na cavidade do joelho.
- Transferir o PLN para 0,5 ml de PBS estéril, em gelo.
7. Geração da suspensão de célula única de PLN
- Homogeneizar o PLN através de um filtro de células plac 70 mícronsEd num poço de placa 6, contendo 5 ml de PBS ou de células activadas por fluorescência (FACS) de tampão (PBS contendo 2% de soro fetal de vitelo (FCS), 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), e azida de sódio 1 mM). Homogeneizar através do filtro utilizando a extremidade traseira de uma seringa de 3 ml.
NOTA: A azida de sódio é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. - Lavar o filtro com mais 5 ml de tampão PBS ou FACS, recolher o material num tubo de 15 ml e sedimentar as células a 277 xg (1200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 ° C. Alternativamente, homogeneizar NLP diretamente em tubos de microcentrífuga utilizando homogeneizadores de polipropileno.
- Com base no tamanho de grânulo, ressuspender o PLN suspensão num volume apropriado de PBS ou tampão de FACS, por exemplo, a 200 - 1000 ul. Usar uma câmara de contagem para quantificar o número total de células obtido a partir de cada suspensão de LN. Use azul de tripano excluir / células que morrem mortas.
8. celular Coloração e Citometria de Fluxo
- Transfer 1-10 X 10 6 células para tubos de 5 ml de fundo redondo de poliestireno. Lava-se com tampão FACS, e sedimento por centrifugação a 277 xg (1200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 - 100 mL de cocktail de anticorpos (veja células dendríticas [DC] marcadores utilizados para a coloração de superfície, Tabela Materiais) contendo 0,5 - 1 ug de anti-ratinho de CD16 / CD32 (para bloquear mediada por Fc inespecífica interações) em tampão de FACS para 30 - 45 min, em gelo. Proteger as amostras da luz.
- Após a incubação, lavar as células com tampão de SCAF e sedimento por centrifugação a 277 xg (1200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 ° C.
- Ressuspender as células em 50 - 100 ul de tampão de FACS. Aquisição de dados num citómetro de fluxo de 7-10.
NOTA: Para obter excelentes comentários no citometria de fluxo nos referimos o leitor para as seguintes publicações que transmitem tanto informações teóricas e práticas sobre este método.
Representative Results
O ensaio de migração baseados em CFSE (Figura 1) foi utilizado em conjunto com a citometria de fluxo para detectar e caracterizar as células CFSE marcados que aparecem na infecção PLN após a BCG na almofada da pata. Uma grande parte de rotulagem CFSE no PLN, é encontrado no MHC-II alta e CD11c + / células baixos (Figura 2A), consistente com os PD da pele que tenham migrado para DLN pele 11. Tanto a frequência eo número total de CFSE marcado, alta CD11c MHC-II + / células baixas são aumentadas em NLP de camundongos BCG-infectados em comparação com controles injectados com PBS (figura 2B-C), sugerindo que a BCG aumenta a deslocalização destes células à DLN. Uma vez que este ensaio mede a migração durante um período de 24 h, foi possível estabelecer que o DCS pele ainda estão a entrar no DLN 5 dias após a infecção (Figura 2C). Isso amplia a migração DC no modelo atual bem além do cronograma para activati inicialna de células específicas para o antigénio T CD4 + no PLN 3. Além disso, as DCs pele migratórias expressam níveis elevados de moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 (Figura 2D). Isto é consistente com observações anteriores de culturas de explantes de pele e a pele FITC pintar 11, suportando o conceito de que as DCs migratórias activadas são células. DCs importante, tanto LN-residentes (células MHC-II + CD11c de altura) e DCS plasmocitóides (MHC-II baixo PDCA-1 + células baixo CD11c), que entram linfonodos inflamados através vénulas endoteliais elevadas e não linfáticos aferentes 12, onde negativo para CFSE (Figura 2EF), sugerindo fato de que a rotulagem CFSE ocorreu principalmente na pata.
Dado que MHC-II alta CD11c + / células baixos não representa um, mas vários DC subpopulações 13, os marcadores de superfície adicionais CD103, EpCAM (CD326) e CD11b foram incluídos no painel de coloração do anticorpo usado para a detecção de citometria de fluxo (Tabela Materiais) para caracterizar ainda mais a população de DCs migratórias (Figura 3). Ao fazê-lo, uma sub-população de células de alta EpCAM baixas CD11b foi identificado como o principal pele migratório subconjunto DC em resposta à infecção com BCG (figura 3).
Os dados da citometria de fluxo mostrado aqui foi adquirido num citómetro de fluxo equipado com lasers de 4 (488, 532, 640 e 405 nm). Os dados foram analisados com o software de análise de células. Outros citómetros de fluxo multi-cor do que o especificado na Tabela Os materiais podem ser utilizados para a detecção de sucesso dos marcadores mencionadas nos estudos acima, ou a detecção de outros marcadores, em outros tipos de células para esse assunto. Para o protocolo aqui descrito, um citómetro capazes de detectar diferentes fluorocromos 6 é necessary. Mais importante, os clones para cada um dos anticorpos utilizados são especificados (Quadro Materiais). A escolha do conjugado fluorocromo precisa ser considerado como isto pode depender dos lasers e canais de detecção sobre o citómetro de fluxo disponível. Do mesmo modo, os anticorpos devem ser titulados para determinar as diluições mais adequados para a coloração.
frequências populacionais em BCG e amostras injectados com PBS foram representados graficamente e usado em conjunto com a contagem de células totais para calcular números absolutos de definidos subconjuntos, fechado de DCs. O significado das diferenças de meios grupo de dados foram analisados pelo teste t de Student ou ANOVA quando apropriado, com um corte de p <0,05. Outliers foram excluídos da análise seguinte teste de Grubbs para valores aberrantes.
Figura 1. Esboço: BCG pata InfectionModelo e CFSE-Based Ensaio de migração. BCG é inoculados na almofada da pata traseira de ratinhos C57BL / 6. Em diferentes pontos de tempo após a infecção e 24 horas antes do sacrifício, a CFSE fluorocromo é injectada na pata mesmo que anteriormente recebido BCG. A drenagem, linfonodo poplíteo é isolado e células caracterizadas pelo fluxo CFSE marcado com citometria. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. DCs pele migratórios são uma população major Deslocalização para o DLN Após BCG pata Infecção. Camundongos C57BL / 6 foram infectados com 1 x 10 6 UFC de BCG na pata. Vinte e quatro horas antes do sacrifício, os animais foram injectados com CFSE 0,5 mM na mesma pata. Linfonodos poplíteos foram colhidas, homogeneizadoem suspensões de célula única e submetido a citometria de fluxo. Para medições feitas um dia depois de BCG, CFSE foi injetado 2 horas após a BCG. (A e B) mostram tramas zebra expressão predominante de CFSE em + / células de baixa elevadas e CD11c MHCII em BCG-PLN de drenagem 3 dias após a infecção. (C) frequência eo número total de CFSE marcado com alta CD11c MHCII + / células de baixa em PLN de BCG e ratos injectados com PBS foram representadas graficamente em diferentes pontos de tempo. (D) Média intensidade de fluorescência (MFI) para o CD80 e CD86 foi determinada com CFSE + e CFSE neg alta CD11c MHC-II DC + / baixo da pele em PLN 3 dias após a infecção BCG. (Alta CD11c MHC-II + / baixa) (E) expressão CFSE dentro DCs pele, LN residente DCs (MHC-II + CD11c alto) e (F) DCs plasmocitóides (MHC-II baixo CD11c baixo PDCA-1 +)foi determinada por citometria de fluxo de 3 dias após a BCG. Para cada experiência, pelo menos 5 ratos foram usados para grupos BCG-infectadas e 3 para os controlos injectados com PBS. As barras indicam o erro padrão da média. Número total de células CFSE-marcados no interior de cada subconjunto são dadas em Bollampalli et ai, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 3. * Indica diferença estatística significativa entre controlos BCG-infectados e PBS. Uma das duas experiências independentes mostrados. Figura adaptada de Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 3, com a autorização do editor Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. EpCAM baixo CD11b altas DCs são a pele principal DC subconjunto Traffickção ao DLN Após BCG almofada da pata Infecção. ratinhos C57BL / 6 foram injectados com BCG e CFSE como na Figura 2. lotes (A) Zebra mostrando gating estratégia empregada (painel superior) e de frequência de células CFSE + dentro de cada, definido subconjunto a diferentes Os pontos de tempo após a infecção com BCG (painéis inferiores). As frequências dentro de cada subconjunto pode variar, dependendo do ponto de tempo após a infecção. Após 3 dias de BCG pode-se esperar encontrar + / células baixos de aproximadamente 0,2% de alta CD11c MHC-II em todas as células de LN. Destes, cerca de 6% são células CD103 +. Para os subconjuntos encontrados dentro do porta negativo alta CD103 MHC-II, pode-se encontrar cerca de 42% CD11b alta EpCAM células de baixa, 27% CD11b baixo EpCAM células de baixa e 7% LCs. (B) Os números totais de CFSE + células dentro de cada um, subconjunto definido em diferentes pontos de tempo após a infecção com BCG é mostrado. Para cada experiment, pelo menos 5 ratos foram usados para grupos BCG-infectadas e 3 para controlos de PBS. As barras indicam o erro padrão da média. * Indica diferenças estatisticamente significativas em relação aos controles injectados com PBS. Uma de três experiências independentes mostrados. Figura re-impressas a partir Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 3, com a autorização do editor Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
noDCs são células apresentadoras de antígeno especializados que podem responder a desafio microbiano em superfícies do corpo através da aquisição de antígeno microbiano e migrar para o DLN via vasos linfáticos. Há, DCs apresentar este antigénio para células T de um modo que conduz a respostas de células T primárias. O processo de migração de DC a partir de tecido de DLN é, portanto, muito importante para a compreensão de como uma resposta das células T de produção é iniciada. Métodos para medir a migração DC são, consequentemente, muito útil no desdobramento do acima.
Um modelo de ratinho foi utilizado para estudar a migração pele DC de DLN após a infecção com BCG, uma vacina viva que é injectado na pele clinicamente. Em consonância, a BCG é injetada na pata traseira para imitar esta via cutânea de vacinação. Um ensaio simples foi desenvolvido e, consequentemente incorporadas a este modelo para investigar a migração de pele DC sub-populações de local da inoculação do BCG na pele pata ao PLN drenagem. Este protocolo reliES em injectar o CFSE fluorocromo na mesma pata que previamente receberam BCG e, em seguida, isolar o PLN de drenagem 24 horas mais tarde para analisar a presença de células marcadas com CFSE-por citometria de fluxo. Embora não seja descrito no protocolo, LNs desta configuração também podem ser preparados para a análise por microscopia confocal, para o estudo de processos de migração, tais como o posicionamento das células migratórias na LN 3. Além disso, resultados semelhantes na pele BCG-desencadeou a migração DC foram obtidos usando tanto BCG Pasteur 1173P2 3 e BCG SSI 1331 14.
CFSE é comumente usado para marcar as células in vitro e para acompanhar tais células marcadas in vivo após a transferência de células 15. No protocolo atual, porém, ele foi usado para rotular diretamente as células da pele in situ. A base molecular de rotulagem CFSE é semelhante a FITC, o qual também é um corante fluorescente reactivo com amina. CFSE no entanto é preferido em relação FITC para conjugação, pois creates títulos carboxamida muito estáveis 16. Além disso, é altamente CFSE membrana permeável e difunde passivamente nas células. Uma vez lá dentro, ele forma amina intracelular (fluorescente) conjugados que são retidos na célula rotulada 15.
O ensaio de migração à base de CFSE desenvolvido pelos autores permite a identificação de células transferidos de pele de DLN dentro de um período de 24 horas, em resposta ao BCG. Ele mede assim a migração aguda durante um período de tempo definido e permite determinar a capacidade de diferente, injetado estímulos para provocar a migração. Este ensaio é diferente da técnica clássica de FITC pintura da pele, o qual mede um evento de migração cumulativa desencadeada por aplicação cutânea, tópica de um agente sensibilizador de contacto. Assim, o ensaio de migração baseados em CFSE pode ser empregue para identificar as DCs migratórias pele ou outras células que abriga o PLN após a injecção de micróbios, produtos microbianos ou outros estímulos inflamatórios na footpad. Na verdade, ambos os neutrófilos e γ: ô células T têm sido mostrados para mudar a partir de pele de DLN em resposta a BCG 17,18. Na verdade, o ensaio foi recentemente utilizado num contexto co-infecção para demonstrar que uma infecção localizada-nemátodo intestinal pode silenciar pele migração DC BCG-desencadeada de DLN 14.
Migração de DC é frequentemente avaliado entre 24 a 72 horas na pele uma vez que FITC pintura marcado com FITC DCs são difíceis de detectar 4 a 5 dias após a pintura 19. A perda do sinal de CFSE em DCs marcado não é um problema no ensaio aqui apresentadas uma vez que a análise de migração foi restringido a 24 h; a razão por trás disso é que os autores queriam estudar especificamente "overnight" eventos de migração. Outros interessados neste ensaio são no entanto encorajados a investigar anteriores ou posteriores, mesmo para os pontos de tempo de seguimento com base em CFSE. Além disso, uma vez que é introduzido CFSE por injecção pode ser administrada em qualquer altura definida. Esta flexibilidade permitida a umuthors para avaliar a migração DC entre o dia 5 e 6 após a infecção com BCG (Figura 2C) 3. Injectar CFSE poderia potencialmente limitar os tipos de células acessíveis in situ para a reacção de marcação. Por exemplo, as células de Langerhans (LCS), que são as DCs que residem na camada superior da pele, a epiderme, migram deficientemente em resposta à BCG no ensaio de migração baseados em CFSE (Figura 3) 3. No entanto, durante a exposição da pele com FITC, as DCs posicionado na derme, a camada inferior da epiderme, são prontamente marcado e migrar para o DLN mais rápido do que CLs 20,21. Isto sugere que as células podem tornar-se com fluorocromo marcado sem necessariamente necessidade de localizar na camada de pele, onde a solução de marcação é aplicado.
Como um modelo para a infecção por BCG, a orelha de rato fornece uma via intradérmica de boa fé de inoculação que está mais de acordo com a administração clínica de BCG como uma vacina contra a tuberculose. footpad injecção, por outro lado, é provavelmente uma combinação de via intradérmica e subcutânea. Dito isto, requer habilidade e treinamento para entregar corretamente e reprodutível BCG para a derme 22, de modo que na prática clínica pode não ser sempre verdade intradérmica mas sim subcutânea ou uma combinação de ambos. Como um local de inoculação da pata tem duas vantagens muito claras sobre a orelha que merecem menção. Primeiro, a resposta imunitária é concentrada ao PLN de drenagem na sequência de uma injecção na pata e isto facilita a análise das respostas. Os autores deste relatório constatou o PLN para ser o primeiro e principal LN drenagem da pata 3. Outros sugeriram drenagem divisão entre os poplítea e subiliac linfonodos após a injeção de Evan azul de 23. No entanto, no que diz respeito ao ouvido, não é mais do que uma orelha DLN em ratinhos e estes não podem ser regularmente presente ou fácil de localizar 24. Este último apresenta claramente um PASSility em estudos que buscam investigar respostas em DLN. Em segundo lugar, os volumes maiores podem ser inoculados na almofada da pata (10 - 50 pi) comparado com o ouvido. Este, por sua vez, tanto minimiza a responsabilidade de introduzir grandes alterações no fluxo linfático e de ter que trabalhar com volumes muito pequenos de injeção, o que é em si um problema quando se trata de inoculação de grandes quantidades de micobactérias. Na orelha, onde o volume de injecção tem que ser pequena (1-10 ul), 5 ul mesmo pode alterar o fluxo linfático e potencialmente forçar uma quantidade maior do material injectado directamente no DLN de uma maneira descontrolada. Por conseguinte, é importante para ter em conta o volume de injecção. Isto é especialmente importante em experiências abordando a contribuição de células em bactérias transportando ao LN. No modelo da pata traseira com BCG, BCG alguns podem ter atingido o DLN na ausência de transporte celular. Isto baseia-se na observação de que pode-se ainda detectar BCG na DLN de ratinhos, onde a migração de células a partir do pépad foi totalmente ablação por injeção local de toxina pertussis 3. Se esta é uma indicação de que a BCG pode aceder directamente linfáticos e chegar ao DLN de uma forma verdadeiramente livre de células continua a ser determinado, uma vez que não pode ser excluída a possibilidade de micobactérias neste caso onde o acesso a vasos linfáticos dada pela força do volume injectado.
A consideração prática para imunizações na orelha ou pata é que os animais têm de ser devidamente imobilizado por injeções de ser efectuada correctamente e de forma reprodutível. gás isoflurano é descrito no protocolo de corrente como um método de restringir os animais em preparação para injecções almofada da pata. Os tempos de indução e recuperação relativamente rápidas para anestesia isoflurano mediada por torná-lo um método popular, mas semelhante a outros agentes anestésicos, afeta a fisiologia, o que pode interferir com os resultados experimentais 25. Na verdade, os anestésicos tanto voláteis e injetáveis diminuir o fluxo de linfa, abolindomovimentos voluntários dos músculos, reduzindo o tônus muscular e diminuindo a contração lymphangion 26. Além disso, uma redução de 5 vezes na migração de DLN de DCs adoptivamente transferidos na almofada da pata foi avaliado em animais anestesiados 27. Dado o acima, e uma vez que os procedimentos de manuseamento antes da anestesia são susceptíveis de causar mais stress para os animais do que a própria injecção, o que é tanto rápida para administrar e não exige uma etapa de recuperação, a possibilidade de conter adequadamente o animal sem anestésicos devem ser considerado. Um limitador do mouse personalizado para injeções coxins plantares, onde o animal pode ser rapidamente trazidos para uma posição imobilizada e inoculados na pata dentro de 30 a 40 segundos seria o ideal para injetar o mouse na pata traseira sem alterar outros aspectos de sua fisiologia no processo e seria extremamente útil em estudos que abordam a migração de células através de vasos linfáticos.
Em conclusão, este relatóriodestaca um protocolo novo para rastrear DCs pele durante a sua mobilização para a DLN utilizando um ensaio que monitora a migração durante uma janela de 24 horas definido. Este ensaio à base de migração CFSE permite a detecção e análise das células migratórias por citometria de fluxo, tal como descrito aqui, bem como por microscopia confocal 3. Ele proporciona uma plataforma flexível para o estudo de uma grande variedade de estímulos injectados e a sua capacidade para provocar a migração DC, e mais importante, pode ser empregue para controlar não só as DCs mas também outras populações que se deslocam a partir de pele de DLN durante diferentes configurações experimentais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10 ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
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