की जीनोटाइपिंग Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

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Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

Staphylococcus (एस ऑरियस) सबसे महत्वपूर्ण रोगज़नक़ मवेशी ¹ में intramammary संक्रमण (आईएमआई) के लिए दुनिया भर में जिम्मेदार के रूप में जाना जाता है। 12 यूरोपीय देशों है कि गायों में Fournier एट अल। ² स्विस गायों में प्रदर्शन किया और अध्ययन के द्वारा अध्ययन Cosandey एट अल। ³ और बॉस एट अल। ⁴ से एस ऑरियस गोजातीय से अलग आईएमआई एक आनुवंशिक रूप से विषम समूह है। 16S-23S rRNA intergenic स्पेसर क्षेत्र (RS-पीसीआर) की पीसीआर प्रवर्धन द्वारा, 17 जीनोटाइप की कुल शुरू में 101 epidemiologically स्वतंत्र वियोजन ² में पाया गया। जीनोटाइप बी और सी जीनोटाइप (जीटीसी), सबसे आम (80%) थे, जबकि अन्य 15 जीनोटाइप (GTS) शायद ही कभी हुआ है, प्रत्येक 1 से 4 सभी वियोजन की% करने के लिए कर रही है। यूरोपीय स्तर ³ में, जीटीबी, जीटीसी, GTF, GTI, और जीटीआर सबसे महत्वपूर्ण सभी का विश्लेषण उपभेदों (एन = 456) के 76% शामिल जीनोटाइप थे। जीटीबी मध्य यूरोप w में स्थित थाhereas अन्य जीनोटाइप व्यापक रूप से प्रचारित किया गया। उपभेदों के शेष 24% 41 जीनोटाइप, उनमें से कई, तथापि, केवल एक बार मनाया गया शामिल थे।

Fournier एट अल। ^2, Cosandey एट अल। ^3, और Graber एट अल। ⁵ से पढ़ाई के आगे प्रदर्शन किया है कि जीनोटाइप अत्यधिक उनके डाह जीन पैटर्न के साथ, स्विस पर यूरोपीय स्तर पर के रूप में जुड़े थे और साथ ही साथ। अध्ययनों से आगे एस के बीच आईएमआई प्रसार में भारी अंतर का पता चला ऑरियस जीटीबी, जीटीसी और अन्य जीनोटाइप ^2,5: जीटीबी पर विचार, एक झुंड में गायों के 87% अप करने के लिए इस जीनोटाइप से संक्रमित थे। जीटीसी की और अन्य जीनोटाइप के मामले में, हालांकि, आईएमआई केवल एक झुंड के 1 से 2 गायों में मिला था।

आईएमआई एस की वजह से ऑरियस, आम तौर पर इसी स्तन ग्रंथियों की सूजन और दूध में भड़काऊ कोशिकाओं की वृद्धि में परिणाम है। एक परिणाम के रूप में, दैहिक सेल सहदूध में unts (एससीसी), अधिकांश देशों में दूध की गुणवत्ता के प्रमुख सूचक है, एक कम कीमत के दूध या यहां तक ​​कि वितरण बंद करने के लिए अग्रणी बढ़ जाती है।

Fournier एट अल। ² रुपये पीसीआर के अलावा, अन्य तरीकों टाइपिंग एस के गोजातीय उपभेदों subtyping के लिए वर्णित किया गया है ऑरियस ^8-11। दो आम लोगों स्पा टाइपिंग ¹² और मल्टी लोकस अनुक्रम टंकण (MLST) ¹³ में शामिल हैं। पूर्व एक, डीएनए प्रोटीन ए के लिए staphylococcal स्पा जीन कोडिंग के चर स्पेसर क्षेत्र अनुक्रमण के आधार पर है, जबकि बाद एक 7 गृह व्यवस्था जीन का अनुक्रमण की आवश्यकता है। इसका मतलब यह है कि एक ¹² और सात PCRs ^13, क्रमशः, प्रदर्शन किया जाएगा amplicon शुद्धि, अनुक्रमण प्रतिक्रिया और विश्लेषण विशिष्ट उपकरण का उपयोग करके किया की जरूरत है। RS-पीसीआर की तुलना में, इन तरीकों प्रयोगशाला एक कम नमूना throughput और उच्च लागत में जिसके परिणामस्वरूप में काफी अतिरिक्त प्रयास की आवश्यकता है।throughput PFGE के लिए विशेष रूप से कम है। एस के गोजातीय उपभेदों के लिए इन तरीकों के संकल्प को ध्यान में रखते ऑरियस, रुपये पीसीआर में कम से कम स्पा MLST ⁴ या PFGE ¹⁵ से अधिक ⁴ और बेहतर टाइपिंग के रूप में अच्छा है।

इन सभी बाइनरी टाइपिंग ¹³ सहित तरीकों की वजह से एस गोजातीय आईएमआई के रोगजनन में और अधिक जानकारी प्राप्त करने में अपने प्रभाव का प्रदर्शन ऑरियस, लेकिन उल्लेख प्रतिबंध की वजह से वे बड़े चिकित्सीय जांच के लिए कम उपयुक्त हैं। इसके अलावा, रुपये पीसीआर द्वारा जीनोटाइपिंग Fournier एट अल द्वारा वर्णित है। ^के रूप में ² महामारी विज्ञान और एस के रोगजनक क्षमता का विश्वसनीय भविष्यवाणी की अनुमति देता है ऑरियस, गोजातीय आईएमआई में शामिल नैदानिक पशु चिकित्सा में दो प्रमुख मूल्यों।

Protocol

1. स्ताफ्य्लोकोच्चुस आइसोलेट्स

1. एस के 10 μl बिखरा ऑरियस शेयर संस्कृति या एक कॉलोनी कोलंबिया अगर 5% भेड़ रक्त (बीए) युक्त प्लेटों पर एक चयनात्मक मध्यम पर हो।
2. 24 घंटा के लिए 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर aerobically सेते हैं।

2. डीएनए निष्कर्षण

1. दूरभाष: 10 मिमी Tris एचसीएल और 10 मिमी EDTA ना _2, पीएच 8.5 से युक्त बफर तैयार करें। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर aliquots और आटोक्लेव तैयार करें।
2. एक बाँझ प्लास्टिक पाश या एक बाँझ लकड़ी के दांत लेने और 100 μl दूरभाष resuspend का उपयोग कर बीए 1 से कॉलोनी लीजिए। पेंच टोपी के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें।
3. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। बाद में, नमूने गीला बर्फ पर तुरंत जगह है।
4. में पीसीआर (पीसीआर के लिए = टेम्पलेट डीएनए) के लिए उपयुक्त एच ₂ ओ 100: नमूने पतला 1। गैर-पतला और पतला नमूने 1 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।

3. रुपये पीसीआर

2 हे, 12.5 Taq मास्टर मिक्स μl, 2 μl G1 प्राइमर 10 माइक्रोन, 2 μl एल 1 प्राइमर 10 माइक्रोन, और टेम्पलेट डीएनए कि शुद्ध के बारे में 30 एनजी से मेल खाती के 7 μl डीएनए ^2।
1. एक मानक पीसीआर साइक्लर में निम्नलिखित साइकिल कार्यक्रम चलाने के लिए: 15 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस, 27 होंगें 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस चक्र, 7 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक 2 मिनट रैंप और annealing द्वारा पीछा। एक और 2 मिनट रैंप के बाद, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार। 4 डिग्री सेल्सियस तक नीचे ठंडा करने के बाद 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार से पीसीआर बर्खास्त।
   नोट: पीसीआर उत्पादों 5 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
2. के प्रत्येक रन के लिए RS-पीसीआर एक सकारात्मक नियंत्रण, यानी, एक ज्ञात जीनोटाइप (सामान्य रूप से जीटीबी) के साथ एक नमूना है, और एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं (एच ₂ ओ)।

4. वैद्युतकणसंचलन

1. एक साथ डीएनए (मेड किट) के लिए एक वाणिज्यिक छोटी वैद्युतकणसंचलन किट का प्रयोगएक पीसी और स्थापित सॉफ्टवेयर से जुड़ा एक bioanalyzer के साथ। अध्ययन निर्माता की इसी मैनुअल ध्यान से।
2. चिप भड़काना स्टेशन की स्थापना की और निर्माता की पुस्तिका के अनुसार सिरिंज क्लिप को समायोजित।
3. निर्माता की पुस्तिका के अनुसार जेल डाई मिश्रण तैयार करें।
4. जेल डाई मिश्रण (निर्माता के मैनुअल के अनुसार) लोड हो रहा है।
   1. उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए आरटी के लिए जेल डाई मिश्रण संतुलित करना।
   2. चिप भड़काना स्टेशन पर नए डीएनए चिप डाल। पिपेट 9 अच्छी तरह से चिह्नित जी में जेल-डाई की μl
   3. सुनिश्चित करें कि सवार 1 मिलीलीटर पर तैनात है और फिर चिप भड़काना स्टेशन को बंद करें। प्रेस सवार जब तक यह सिरिंज क्लिप द्वारा आयोजित किया जाता है। वास्तव में प्रतीक्षा के लिए 30 सेकंड तो सिरिंज क्लिप जारी।
   4. 5 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें। धीरे धीरे 1 मिलीलीटर की स्थिति में सवार वापस खींच।
   5. ओपन चिप भड़काना स्टेशन और दोनों कुओं में पिपेट 9 जेल डाई की μl 'जी' में चिह्नित।
5. लोड हो रहा है Marker
   1. पिपेट 5 में सभी 12 नमूना कुओं में और अच्छी तरह से सीढ़ी में मार्कर के μl। इन 13 खाली कुओं में से किसी को मत छोड़ो।
6. सीढ़ी और नमूने लोड हो रहा।
   1. पिपेट के लिए सीढ़ी पर हस्ताक्षर के साथ अच्छी तरह से चिह्नित डीएनए सीढ़ी के 1 μl।
   2. पिपेट 1 नमूना के μl (प्रयुक्त कुओं) या विआयनीकृत पानी (अप्रयुक्त कुओं) के 1 μl।
   3. चिप 2400 rpm पर 1 मिनट के लिए अनुकूलक और भंवर में क्षैतिज रखो।
   4. 5 मिनट के भीतर bioanalyzer में चिप चलाएँ।
7. विश्लेषण रनिंग
   1. bioanalyzer और जुड़े कंप्यूटर को प्रारंभ करें। सॉफ्टवेयर खोलें।
   2. bioanalyzer के ढक्कन खोलें और चिप धारक में चिप जगह (चिप केवल एक ही रास्ता फिट बैठता है)। ढक्कन सावधानी से बंद कर दें।
   3. सॉफ्टवेयर के साधन संदर्भ में "वैद्युतकणसंचलन"> "dsDNA"> "डीएनए 7500" का चयन करें। सॉफ्टवेयर के वर्तमान फ़ाइल उपसर्ग स्वीकार करें या इसे संशोधित।
   4. प्रारंभ बटन सॉफ्टवेयर में मौजूद क्लिक करें। सॉफ्टवेयर में नमूना के नाम दर्ज करें। जब चिप रन समाप्त हो गया है (लगभग 30 मिनट के बाद) भागो संदेश के अंत bioanalyzer सॉफ्टवेयर में प्रकट होता है।
   5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार चिप निकालें और bioanalyzer के इलेक्ट्रोड साफ।

5. वैद्युतकणसंचलन प्रोफाइल से जीनोटाइप inferring

1. महल सॉफ्टवेयर लोड (सॉफ्टवेयर लेखकों से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है)।
2. "फ़ाइल"> "आयात संदर्भ डाटा": महल सॉफ्टवेयर में आयात संदर्भ डेटा
3. वैद्युतकणसंचलन bioanalyzer सॉफ्टवेयर का डाटा संदर्भ में चलाने खोलें। एक नमूने के एक वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल का चयन करें।
4. प्रासंगिक चोटियों के लिए जाँच करें।
   1. "उपकरण"> "मतलब प्रतिदीप्ति": प्रासंगिक चोटियों के लिए जाँच करने के लिए महल सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। "प्रतिदीप्ति" बॉक्स में डालेंप्रतिदीप्ति मूल्यों प्रतिदीप्ति इकाइयों (फू) के रूप में वे bioanalyzer सॉफ्टवेयर से बाहर पढ़ा जा सकता है के रूप में संकेत दिया। आरोही क्रम में उच्चतम प्रतिदीप्ति के साथ 4 (3) चोटियों डालें और अल्पविराम से अलग कर दिया। उदाहरण: 126130132137।
      नोट: सभी इन चोटियों फू की bioanalyzer सॉफ्टवेयर द्वारा संकेत कर रहे हैं, वे साजिश से उन्हें बाहर पढ़ने से अनुमान लगाया जा करने की जरूरत है।
5. "गणना" बटन दबाएँ। यदि मनाया प्रतिदीप्ति बॉक्स "न्यूनतम ऊंचाई चोटी" में दिए गए मूल्य से अधिक एक चोटी प्रासंगिक है।
6. जीनोटाइप अनुमान।
   1. महल पाठ बॉक्स "इनपुट चोटियों (बीपी)" आरोही क्रम में सभी प्रासंगिक चोटियों के बी.पी. में आकार और अल्पविराम के द्वारा अलग में डालें। उदाहरण: 440.462.519.579.637।
      नोट: यदि इन शिखर आकार के सभी नहीं bioanalyzer सॉफ्टवेयर द्वारा संकेत कर रहे हैं, वे साजिश से उन्हें बाहर पढ़ने से अनुमान लगाया जा करने की जरूरत है।
7. "गणना" बटन दबाएँ।
8. सूची मेंबॉक्स, कम से कम चुकता महालनोबिस दूरी "d2m" के लिए देखो। इसी पी मूल्य सही करने के लिए यह है ≥0.05 तो संभावना ≥5% है कि शून्य परिकल्पना एच ₀ अस्वीकार कर दिया है (एच _0: मनाया और संदर्भ प्रोफ़ाइल समान हैं) जिसका अर्थ है कि मनाया प्रोफ़ाइल के लिए समान होना स्वीकार कर लिया है संकेत जीनोटाइप के संदर्भ प्रोफ़ाइल।
9. अगर d2m कम है लेकिन इसी पी मूल्य के क्षेत्र में खाली है, एक संभावना <5% के साथ एच ₀ अस्वीकार।
   नोट: इसका मतलब यह है कि प्रोफाइल असमान हैं, हालांकि d2m कम है। इस तरह के एक परिणाम गैर औसत वैद्युतकणसंचलन की स्थिति से हो सकता है।
   1. इन विचलन के लिए सही करने के लिए, पाठ बॉक्स "मनाया चोटी (बीपी)" मूल्य 395 में डालने और "गणना" बटन दबाएँ। न्यूनतम d2m और एक इसी पी मूल्य ≥0.05 के लिए फिर से जाँच करें। सफल नहीं हैं, मानों 405, 415, और 425 की कोशिश करो।
      नोट: कभी कभी छोटे कदम भी कर रहे हैंसंकेत दिया। यदि अभी भी सफल नहीं मनाया प्रोफ़ाइल संदर्भ डेटा में मौजूद नहीं है, यह एक नया जीनोटाइप या संस्करण हो सकता है।
10. विभिन्न प्रोफाइल
    1. दोहराएँ अलग से 5.6 प्रत्येक वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल के लिए 5.9 करने के लिए कदम।

Representative Results

एक जीनोटाइप और इसके वेरिएंट की परिभाषा

सभी की पहचान जीनोटाइप से एक से अधिक बैंड में भिन्न एक electrophoretic प्रोफ़ाइल एक नया जीनोटाइप के रूप में माना जाता है। न्यू जीनोटाइप नामित कर रहे हैं और बढ़ाया Fournier एट अल के अनुसार। ⁵ जीनोटाइप जीटीए जीटीजेड के लिए, जीनोटाइप GTAA GTAZ द्वारा पीछा करने के लिए अग्रणी है, और GTBA GTBZ करने के लिए, और वर्तमान में GTCC को GTCA। सिर्फ एक बैंड में बदलाव के लिए एक genotypic प्रकार के रूप में माना जाता है। यह जीनोटाइप (जैसे, GTRI, GTRII) के नाम के बाद superscripted रोमन अंकों के साथ संकेत दिया है। कुल में, वहाँ वर्तमान में 141 जीनोटाइप और संदर्भ डेटा बेस में वेरिएंट हैं।

ऊपर उल्लिखित शर्तों, रुपये पीसीआर Fournier एट अल द्वारा। ^{5 के} तहत एस के तनाव जीनोटाइप के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है ऑरियस। एक की निश्चित पहचाननाम से जाना जाता जीनोटाइप या संस्करण यदि तकनीकी समस्याओं बाहर रखा जा सकता हमेशा संभव है। एक ठेठ परिणाम चित्रा 1 में प्रस्तुत 12 रुपये पीसीआर उत्पादों की वैद्युतकणसंचलन का प्रदर्शन और bioanalyzer सॉफ्टवेयर द्वारा छद्म जेल मोड में प्रस्तुत किया है। प्रत्येक लेन अंत में दो या दो से अधिक पीसीआर बैंड में से एक पैटर्न और सामने एक मार्कर बैंड और एक मार्कर बैंड की विशेषता है। एक लेन में डबल क्लिक करके एक अलग विंडो में इसी वास्तव में मापा जाता electrophoretic प्रोफ़ाइल खोलता है। Bioanalyzer सॉफ्टवेयर अन्य संभावनाओं के बीच, की अनुमति देता है, मनाया चोटियों फ्लोरोसेंट इकाइयों फू के रूप में आकार (चित्रा 2) के रूप में या (चित्रा 3) जिससे एक चोटी छद्म जेल मोड में वास्तव में करने के लिए एक बैंड मेल खाती है बी.पी. में पढ़ा जा रहा है। फू में पीक पढ़ने, (चित्रा 4) महल सॉफ्टवेयर में एक प्रोफ़ाइल के प्रासंगिक चोटियों का मूल्यांकन जीनोटाइप inferring के लिए बीपी में पढ़ने के लिए आवश्यक है। अप्रासंगिक चोटियों छोटे मटर के रूप में महल सॉफ्टवेयर में परिभाषित कर रहे हैंकेएस जिसका मनाया प्रतिदीप्ति फू 4 (3) उच्चतम प्रतिदीप्ति साथ चोटियों के ज्यामितीय मतलब का 40% नीचे है। वे आम तौर पर मनाया जाता है जब वहाँ RS-पीसीआर में डीएनए की एक अतिरिक्त (> 30 एनजी शुद्ध डीएनए / परख) ^2।

एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 1 में नमूना 211 वर्तमान के जीनोटाइप अनुमान लगाया जाता है। महल सॉफ्टवेयर अप्रासंगिक चोटियों के लिए परीक्षण करने के लिए उपकरण का उपयोग करने के साथ चित्रा 2 में electrophoretic प्रोफ़ाइल (bioanalyzer सॉफ्टवेयर) और विश्लेषण के दृश्य विश्लेषण, 395 बीपी, 432 बी पी, 453 बीपी, 505 बीपी, 567 बीपी के चोटी के आकार के साथ 6 प्रासंगिक चोटियों का पता चला और 622 बी पी (चित्रा 3)। इन मूल्यों में भरा और पाठ बॉक्स "इनपुट चोटियों (बीपी)" महल सॉफ्टवेयर की चित्रा (4) में अल्पविराम से अलग हो रहे हैं। रन-विशिष्ट विचलन के लिए सही करने के लिए, मूल्य 415 टेक्स्ट बॉक्स "मनाया चोटी (बीपी)" (चित्रा 4) में डाला गया था। "सी दबाया होने के बादalculate "बटन, एक सूची प्रस्तुत किया है और संकेत दिया पूछे genotypic प्रोफ़ाइल के बीच चुकता महालनोबिस दूरी d2m के साथ मिलकर जीनोटाइप द्वारा आदेश दिया। सूची न्यूनतम d2m के लिए तलाश स्क्रॉल करें। वर्तमान मामले में, कम से कम d2m साथ (चित्रा 4) 4.499 के बराबर है पी ≥0.05 के एक मूल्य है, जिसका अर्थ है कि पूछे प्रोफ़ाइल काफी जीटीबी में से एक से अलग नहीं है।

जीनोटाइप के वेरिएंट महल सॉफ्टवेयर में _XV को _I के रूप में संकेत कर रहे हैं। जीनोटाइप बी के मामले में, वहाँ तीन वेरिएंट GBT ^मैं, GBT ^{द्वितीय,} और ^{तृतीय} GBT सॉफ्टवेयर (चित्रा 4) में B_I, B_II, और B_III के रूप में संकेत कर रहे हैं।

मेड किट का एक चिप एक समय में 12 रुपये पीसीआर का विश्लेषण उत्पादों की अनुमति देता है। तो कम उत्पाद उपलब्ध हैं, शेष कुओं विआयनीकृत पानी के साथ लोड किया जा करने की जरूरत है। परिणाम केवल यदि नियंत्रण में व्याख्या की जा सकती है मैंRS-पीसीआर में ncluded उपयुक्त हैं।

एस की आकृति 1. छद्म जेल 12 रुपये पीसीआर उत्पादों और उनकी अनुमानित जीनोटाइप का प्रतिनिधित्व। बारह विभिन्न प्रकारों ऑरियस एक bioanalyzer और शामिल सॉफ्टवेयर के साथ एक साथ मेड किट का उपयोग कर आरएस पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया। बाईं ओर लेन मार्कर या बी.पी. में प्रणाली के आकार जांच के लिए "सीढ़ी" दिखाता है। ग्राफिक्स, नमूना के नाम और इसी जीनोटाइप दोषी पाया जाता है कि महल सॉफ्टवेयर द्वारा प्राप्त किया गया के शीर्ष पर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा एसए के 2. Electrophoretic प्रोफ़ाइलचित्रा 1. चोटियों मापा प्रतिदीप्ति फू में संकेत दिया है के शीर्ष पर mple 161 वर्तमान। दिखने में अलग पहचाना चोटियों कि bioanalyzer सॉफ्टवेयर की जरूरत द्वारा नहीं पाया गया साजिश के रूप में 113 फू (नीले रंग में) के एक अनुमान के अनुसार प्रतिदीप्ति मूल्य के साथ चोटी के प्रदर्शन से उन्हें बाहर पढ़ने से अनुमान लगाया जा सकता है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा।

चित्रा 3. नमूना 211 चित्रा 1. चोटियों उनके आकार बी.पी. में संकेत दिया है के शीर्ष पर में मौजूद Electrophoretic प्रोफ़ाइल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4. महल सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट। टेक्स्ट बॉक्स "इनपुट चोटियों (बीपी)" में यह आंकड़ा 3 से नमूना 211 के शिखर आकार में भर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

² जब वहाँ RS-पीसीआर (> 30 एनजी शुद्ध डीएनए / परख) में डीएनए की एक अतिरिक्त है पूरी प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम है। सामान्य तौर पर, एक प्रोफ़ाइल का संकल्प इष्टतम यदि अपनी चोटियों के सभी आधारभूत से शुरू और अंत है। दो चोटियों भी एक साथ बंद कर रहे हैं, संकल्प अधूरा है। इन शर्तों के तहत, bioanalyzer सॉफ्टवेयर अनुचित शिखर पहचान करने के लिए नेतृत्व इतना है कि मैनुअल पहचान की आवश्यकता होती है सकते हैं।

बीपी या फू के रूप में व्यक्त सभी दिख अलग कर दिया और प्रासंगिक चोटियों आगे के विश्लेषण के लिए शामिल किए गए हैं। के लिए बहुत ज्यादा टेम्पलेट डीएनए RS-पीसीआर व्यापक चोटियों में यह परिणाम है और इसलिए चोटियों के अतिव्यापी और बिगड़ा संकल्प चोटी की। इसके अलावा, प्रवास आकार है कि झूठा बढ़ रहे हैं इतना है कि जीनोटाइप अब कोई निष्कर्ष निकाला जा सकता चोटी की धीमी अग्रणी है। अंत में, अप्रासंगिक चोटियों की संख्या में बड़ा है। अधिक से अधिक 3 चोटियों के साथ प्रोफाइल के लिए, अधिकतम प्रतिदीप्ति के साथ चोटी सामान्य रूप से 150 फू अधिक नहीं होनी चाहिए।

आरएस पीसीआर द्वारा जीनोटाइपिंग वर्णित के रूप में तथ्य यह है कि मशीनों में निवेश आवश्यक है और नि: शुल्क महल सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है द्वारा सीमित है। वास्तव में, एक मानक पीसीआर मशीन और bioanalyzer की जरूरत है। पूर्व आजकल जबकि बाद में अधिक महंगा है बल्कि सस्ते है। agarose आधारित वैद्युतकणसंचलन का संकल्प भले ही उच्च संकल्प agarose प्रयोग किया जाता है पर्याप्त नहीं है। इन शर्तों के तहत यह जीटीबी, जीटीसी, और अन्य सभी जीनोटाइप के बीच भेद करने के लिए अभी संभव नहीं है। मेड किट या agarose वैद्युतकणसंचलन का उपयोग वैद्युतकणसंचलन के लिए लागत, हालांकि, समान हैं। bioanalyzer आगे के साथ मेड किट एक साथ, एक तरह से मानक agarose वैद्युतकणसंचलन कि बाद विधि आसान है बेहतर साबित सीधे आगे है, और प्राप्त आंकड़ों कि काफी भंडारण और आगे के विश्लेषण को सरल इलेक्ट्रॉनिक रूप में मौजूद है। मुख्यतः सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध bioanalyzers विश्लेषण के इस प्रकार के लिए उपयुक्त हैं कि electrophoret प्रदान कीआईसी संकल्प पर्याप्त है और बैंड के प्राप्त आकार सही और निष्पक्ष है।

RS-पीसीआर का संकल्प एस के गोजातीय उपभेदों के लिए ऑरियस अधिक है। यह स्पा टाइपिंग के रूप में अच्छा है, और MLST और PFGE ^4,14 से बेहतर है। इसके अलावा, सभी अन्य तरीकों टाइपिंग सामान्यतः subtyping एस के लिए इस्तेमाल की तुलना ऑरियस (स्पा टाइपिंग, MLST, PFGE), अपने नमूना throughput उच्च है: डीएनए निष्कर्षण आसान और तेज है, 96 नमूने एक रेसकोर्स रोड रन (सामान्य रूप से हे / एन) और वैद्युतकणसंचलन में कार्रवाई की जा सकती है और जीनोटाइप inferring सीधे आगे है। 96 नमूनों का पूरा विश्लेषण पीसीआर के लिए एक रात और वैद्युतकणसंचलन और मूल्यांकन के लिए एक दिन की आवश्यकता है। Fournier एट अल। ² से की RS-पीसीआर अन्य लाभ कम लागत, खासकर जब MLST कि सात जीन दोनों दिशाओं में ¹⁵ अनुक्रम किया जा करने की आवश्यकता की तुलना में कर रहे हैं। इसके अलावा, रुपये पीसीआर केवल विधि की भविष्यवाणी contagiosity और के तनाव की pathogenicity हैएस ऑरियस गोजातीय में शामिल ^2,5, नैदानिक पशु चिकित्सा में महत्वपूर्ण predictors स्तन की सूजन। अंत में, आरएस पीसीआर अकेले गोजातीय एस के महामारी विज्ञान की जांच करने के लिए पर्याप्त है ऑरियस ^3,4,5,14। के रूप में केवल कुछ ही प्रमुख जीनोटाइप ^2,3 मनाया जाता है डेटा की व्याख्या भी एक अंतरराष्ट्रीय संदर्भ में सीधे आगे है। गोजातीय और मानव में तनाव, आरएस पीसीआर और स्पा टाइपिंग के बीच महामारी विज्ञान तुलना के लिए एक साथ बेहतर कर रहे हैं के रूप में बाद विधि व्यापक रूप से मानव उपभेदों subtyping इतना है कि डेटा का एक बहुत उपलब्ध है के लिए प्रयोग किया जाता है। MLST, तथापि, उपभेदों ¹⁵ की clonality का आकलन करने के लिए उपयुक्त है और वंशावली के लिए ⁴ विश्लेषण करती है।

पीसीआर साइक्लर के संबंध में समस्या निवारण, मेड किट, और bioanalyzer के लिए, इसी मैनुअल परामर्श किया जाना है। RS-पीसीआर विधि के मामले में, समस्या निवारण के लिए बड़े पैमाने सरल है अगर उचित सकारात्मक और नकारात्मक पीसीआर नियंत्रण इंक हैंप्रत्येक रन में luded। सकारात्मक नियंत्रण नकारात्मक है, तो पीसीआर मिश्रण पर्याप्त रूप से नहीं बना था और / या नियंत्रण डीएनए अपमानित किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण (एच ₂ ओ) एक या एक से अधिक बैंड उत्पन्न, पीसीआर मिश्रण कुछ डीएनए के साथ दूषित किया गया था। दोनों ही मामलों में, प्रोफाइल व्याख्या नहीं होना चाहिए और RS-पीसीआर दोहराया जाना है। अगर व्याख्या एक electrophoretic समस्या की वजह से असंभव है, वैद्युतकणसंचलन एक नए चिप का उपयोग दोहराया जाना चाहिए। Electrophoretic समस्याओं सामान्य रूप से अपर्याप्त प्रवास और एक के संरेखण या दोनों मार्कर अनुचित लोडिंग और चिप की छेड़खानी से उत्पन्न बैंड की विशेषता है। प्राप्त वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल महल सॉफ्टवेयर से व्याख्या नहीं की जा सकती हैं, तो प्रोफ़ाइल bioanalyzer सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न फ़ाइल और मूल्यांकन के लिए लेखक के लिए भेजा है। आम तौर पर, बहुत ज्यादा टेम्पलेट डीएनए के लिए RS-पीसीआर इस्तेमाल किया गया था या प्रोफ़ाइल एक नया जीनोटाइप या genotypic संस्करण का प्रतिनिधित्व करता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'