genotipagem de Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

DOI

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Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) é conhecido como o mais importante agente patogénico responsável a nível mundial para a infecção intramamária (IMI) em bovinos ^1. O estudo realizado por Fournier et al. ² demonstraram em vacas suíças e os estudos por Cosandey et al. ³ e Boss et al. ^4, em vacas de 12 países europeus que S. aureus isolados de bovinos IMI é um grupo geneticamente heterogénea. Por amplificação por PCR de rRNA 16S-23S região espaçadora de intergénica (RS-PCR), um total de 17 genótipos foram inicialmente detectados em 101 isolados independentes epidemiologicamente ^2. Genótipo B eo genótipo C (GTC) eram mais comuns (80%), enquanto os outros 15 genótipos (GTs) ocorreram raramente, cada um fazendo 1 a 4% de todos os isolados. A nível europeu ^3, GTB, GTC, GTF, GTI e GTR foram os genótipos mais importantes que compreendem 76% de todas as cepas analisadas (n = 456). GTB estava situada na Europa Central whereas os outros genótipos foram amplamente divulgados. Os restantes 24% das cepas incluiu 41 genótipos, muitos deles, no entanto, foram observados apenas uma vez.

Os estudos por Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ^3, e Graber et ai. ⁵ ainda demonstrado que os genótipos foram altamente associado com o seu padrão de gene de virulência, bem como no Swiss como a nível europeu. Os estudos revelaram ainda grandes diferenças na prevalência do IMI entre S. aureus GTB, GTC e os outros genótipos de ^2,5: Considerando GTB, até 87% das vacas em um rebanho foram infectados por esse genótipo. No caso de GTC e de outros genótipos, no entanto, o IMI foi encontrado apenas em 1 a 2 vacas de uma manada.

IMI causada por S. aureus, normalmente resulta em inflamação das glândulas mamárias correspondentes e um aumento de células inflamatórias no leite. Como consequência, a co células somáticasunts no leite (SCC), o principal indicador da qualidade do leite na maioria dos países, é aumentada levando a um preço de leite diminuída ou até mesmo parar de entrega.

Além do RS-PCR de Fournier et ai. ^2, outros métodos de tipagem foram descritas para subtipar estirpes de S. bovina aureus ^8-11. Dois dos mais comuns incluem spa digitação ¹² e multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. O primeiro é baseado em sequenciação de ADN da região variável de espaçador do gene que codifica para a proteína Termas de estafilococos A, enquanto que o segundo exige uma sequenciação de 7 genes housekeeping. Isto significa que um e sete ¹² PCRs ^13, respectivamente, têm de ser realizada, seguido por purificação amplicão, reacção de sequenciação e análise utilizando equipamento específico. Em comparação com RS-PCR, estes métodos requerem um considerável esforço adicional no laboratório resultando num rendimento de amostras de baixo e custos elevados. othroughput é particularmente baixa para PFGE. Considerando a resolução destes métodos para as estirpes da espécie bovina de S. aureus, RS-PCR é pelo menos tão boa como spa digitando ⁴ e melhor do que MLST ⁴ ou ¹⁵ PFGE.

Todos estes métodos, incluindo digitação binário ¹³ demonstraram a sua eficácia na obtenção de mais conhecimento sobre a patogênese da bovina IMI causada por S. aureus, mas por causa das restrições mencionadas são menos apropriada para grandes investigações clínicas. Além disso, a genotipagem pela RS-PCR como descrito por Fournier et al. ² permite a previsão fiável do epidemiológica e o potencial patogênico de S. aureus envolvido no IMI bovina, dois valores-chave na medicina veterinária clínica.

Protocol

1. Staphylococcus aureus

1. Espalhe 10 ul de S. aureus cultura de reserva ou uma colónia crescida em meio selectivo em placas de agar de Columbia contendo 5% de sangue de carneiro (BA).
2. Incubar aerobicamente a 37 ° C durante 18 h a 24 h.

2. Extração de DNA

1. Preparar tampão TEL contendo Tris-HCl 10 mM e 10 mM de Na ₂ EDTA, pH 8,5. Preparar alíquotas e autoclave a 121 ° C durante 15 min.
2. Recolha 1 colónia da BA usando uma ansa estéril de plástico ou um palito de madeira estéril e ressuspender em 100 mL TEL. Use tubos de 1,5 ml com tampas de rosca.
3. Incubar a 95 ° C durante 10 min. Em seguida, coloque as amostras imediatamente em gelo molhado.
4. Dilui-se as amostras 1: 100 em _H2O adequado para PCR (= ADN molde para PCR). As amostras não diluídas e diluídas podem ser mantidos à temperatura de -20 ° C durante 1 mês.

3. RS-PCR

H2O, 12,5 uL de Taq Master Mix, 2 ul de iniciador G1 10? M, 2 ul de L1 iniciador 10 uM, e 7 ul de molde de ADN que corresponde a cerca de 30 ng de puro DNA ^2.
1. Executar o seguinte programa de ciclos num ciclizador PCR padrão: 15 min 95 ° C, seguido por 27 ciclos que compreendem 94 ° C durante 1 min, seguido de uma rampa de 2 minutos e hibridação a 55 ° C durante 7 min. Após mais 2 min rampa, estender a 72 ° C durante 2 min. Terminar PCR por uma extensão final a 72 ° C durante 10 minutos, seguido por arrefecimento a 4 ° C.
   NOTA: Os produtos de PCR podem ser armazenadas a -20 ° C durante 5 dias.
2. Para cada passagem de RS-PCR incluem um controlo positivo, ou seja, uma amostra com um genótipo conhecido (normalmente GTB), e um controlo negativo _(H2O).

4. Eletroforese

1. Use um kit de eletroforese miniaturizado comercial para DNA (kit MED) em conjuntocom um Bioanalyzer conectado a um PC eo software instalado. Estudar os manuais correspondentes do fabricante com cuidado.
2. Configurar a estação de priming de chips e ajustar o clipe de seringa de acordo com o manual do fabricante.
3. Preparar a mistura de gel de corante-de acordo com o manual do fabricante.
4. Carregando o mix gel-dye (de acordo com o manual do fabricante).
   1. Equilibrar a mistura de gel de corante-à TA durante 30 min antes da utilização.
   2. Coloque novo chip de ADN na estação de chip de priming. Pipeta 9 jul de gel-dye na G. bem marcado
   3. Certifique-se de que o êmbolo está posicionado em 1 ml e depois fechar a estação de chip de priming. Pressione o êmbolo até que seja preso pelo clipe seringa. Espere exatamente durante 30 segundos, em seguida, solte o clipe seringa.
   4. Espere por 5 seg. Puxe lentamente o êmbolo para 1 ml posição.
   5. Abrir chip de estação de priming e pipeta 9 jul de gel-dye em ambos os poços marcados 'G'.
5. Carregando o Marker
   1. Pipetar 5 ul de marcador em todos os 12 poços de amostra e na escada bem. Não deixe qualquer um destes 13 poços vazios.
6. Carregando a escada e as amostras.
   1. Pipeta de 1 ml de escada de DNA para o bem-marcados com o sinal escada.
   2. Pipetar 1 mL da amostra (poços utilizados) ou 1 ul de água desionizada (poços) não utilizados.
   3. Colocar o chip horizontalmente no adaptador e vortex durante 1 min a 2400 rpm.
   4. Executar o chip no Bioanalyzer dentro de 5 min.
7. Execução da análise
   1. Comece o Bioanalyzer eo computador conectado. Abra o software.
   2. Abra a tampa do Bioanalyzer e colocar o chip no suporte do chip (o chip se encaixa apenas um caminho). Feche a tampa com cuidado.
   3. No contexto Instrumento do software selecione "Eletroforese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Aceitar o prefixo do arquivo atual do software ou modificá-lo.
   4. Clique no botão Iniciar presente no software. Digite os nomes de amostra no software. Quando o chip de execução é concluída (após cerca de 30 min) o Fim do Run mensagem aparece no software Bioanalyzer.
   5. Remover o chip e limpar os eléctrodos do Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante.

5. inferir o genótipo do perfil Eletroforese

1. Carregue o software Mahal (software está disponível gratuitamente a partir dos autores).
2. dados de referência importação para o software Mahal: "Arquivo"> ​​"Importar Dados de Referência"
3. Abra o eletroforese executado no contexto de dados do software Bioanalyzer. Selecione um perfil de electroforese de uma amostra.
4. Verifique se os picos relevantes.
   1. Use o software Mahal para verificar se os picos relevantes: "Ferramentas"> "Média de Fluorescência". Insira na caixa "fluorescência"os valores de fluorescência indicado como unidades de fluorescência (UF), tal como eles podem ser lidos a partir do software Bioanalyzer. Insira as (3) picos 4 com a maior fluorescência em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 126.130.132.137.
      NOTA: Se nem todos estes picos FU são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama.
5. Pressione o botão "Calcular". Um pico é relevante se a fluorescência observado exceder o valor dado na caixa "Minimal altura de pico".
6. Inferir o genótipo.
   1. Inserir na caixa de texto Mahal "Picos de entrada (pb)" os tamanhos em bp de todos os picos relevantes em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 440.462.519.579.637.
      NOTA: Se nem todos esses tamanhos de pico são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama.
7. Pressione o botão "Calcular".
8. Na listacaixa de, procure o mínimo quadrado distância de Mahalanobis "D2M". Se o valor P correspondente direito a ela é ≥0.05 então a probabilidade é ≥5% que a hipótese nula H ₀ é rejeitada (H _0: o observado e os contornos de referência são idênticos) o que significa que o perfil observado é aceito para ser idêntico ao o perfil de referência do genótipo indicada.
9. Se D2M é mínima, mas o campo do valor de P correspondente está vazia, rejeitar H ₀ com uma probabilidade de <5%.
   Nota: Isto significa que os perfis são desiguais embora D2M é mínima. Tal resultado pode resultar de condições não-médias electroforese.
   1. Para corrigir estes desvios, insira na caixa de texto "Observado Peak (pb)" o valor 395 e pressione o botão "Calcular". Verifique novamente por D2M mínimo e um ≥0.05 valor P correspondente. Se não funcionar, tente os valores 405, 415 e 425.
      Nota: Às vezes pequenos passos são aindaindicado. Se ainda não tiver êxito, o perfil observado não está presente nos dados de referência, que pode ser um novo genótipo ou variante.
10. vários perfis
    1. Repita os passos de 5,6-5,9 para cada perfil de electroforese em separado.

Representative Results

Definição de um genótipo e suas variantes

Um perfil electroforético que difira em mais do que uma banda de todos os genótipos identificados é considerado como um novo genótipo. Novos genótipos são nomeados e ampliado de acordo com a Fournier et al. ⁵ levando aos genótipos GTA a GTZ, seguido pelos genótipos GTAA para GTAZ e GTBA para GTBZ e GTCA para GTCC no presente. Variação em apenas uma faixa é considerado como uma variante genotípico. É indicado com algarismos romanos sobrescritos após o nome do genótipo (por exemplo, GTRI, GTRII). No total, existem atualmente 141 genótipos e variantes na base de dados de referência.

Sob as condições descritas acima, RS-PCR por Fournier et al. ⁵ é altamente reprodutível para genotipar estirpes de S. aureus. a identificação definitiva de umagenótipo ou variante conhecida é sempre possível se os problemas técnicos podem ser excluídos. Um resultado típico é apresentada na Figura 1 demonstra a electroforese de 12 produtos de RS-PCR e apresentados no modo pseudo-gel por o software Bioanalyzer. Cada pista é caracterizado por um padrão de dois ou mais bandas de PCR e uma banda marcadora na frente e uma faixa do marcador no final. Clicando duas vezes em uma pista abre o perfil eletroforético correspondente, realmente medido em uma janela separada. O software Bioanalyzer permite, entre outras possibilidades, os picos observados como sendo lido tamanho como unidades fluorescentes FU (Figura 2) ou na pb (Figura 3) através do qual um pico corresponde exactamente a uma banda no modo pseudo-gel. Leitura de pico em FU é necessário para avaliar os picos relevantes de um perfil no software Mahal (Figura 4), a leitura no pb para inferir o genótipo. picos irrelevantes são definidos no software Mahal tão pequena ervilhaKS cuja fluorescência observada FU é inferior a 40% da média geométrica dos (3) 4 picos com maior fluorescência. Eles são normalmente observado quando há um excesso de ADN em RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensaio puro) ^2.

Como um exemplo, o genótipo da amostra 211 presente na Figura 1 é inferida. A análise visual do perfil eletroforético na Figura 2 (software Bioanalyzer) e análise com o software Mahal usando a ferramenta para testar os picos irrelevantes revelou 6 picos relevantes com tamanhos de pico de 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, e 622 pb (Figura 3). Estes valores são preenchidos e separados por vírgulas na caixa de texto "picos de entrada (pb)" do software Mahal (Figura 4). Para corrigir desvios específicos de funcionamento, o valor 415 foi inserido na caixa de texto "Observado Peak (pb)" (Figura 4). Depois de ter pressionado o "Calculate "botão, uma lista é apresentada ordenados por genótipo em conjunto com o D2M distância de Mahalanobis ao quadrado entre o perfil genotípico consultado e indicado. Role a lista procurando D2M mínima. No presente caso, mínimo D2M é igual a 4.499 (Figura 4) com um valor de P ≥0.05, o que significa que o perfil consultado não diferem significativamente do de um GTB.

Variantes de genótipos são indicados como _I para _XV no software Mahal. No caso de genótipo B, existem os três variantes GBT ^I, GBT ^{II, III} e GBT indicados como B_I, B_II, e B_III no software (Figura 4).

Um chip do kit MED permite que os produtos de análise de 12 RS-PCR de cada vez. Se menos produtos estão disponíveis, os restantes poços têm de ser carregado com água desionizada. Os resultados só podem ser interpretados se os controlos included na RS-PCR são adequados.

Figura 1. Pseudo-gel representando 12 produtos RS-PCR e seus genótipos inferidos. Doze diferentes cepas de S. aureus foram analisados por RS-PCR utilizando o kit de MED em conjunto com um Bioanalyzer e o software incluído. A pista do lado esquerdo mostra o marcador ou "escada" para a calibração tamanho do sistema em pb. No topo dos gráficos, os nomes de amostra e os genótipos correspondentes são indiciados que foram obtidos pelo software Mahal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Perfil eletroforético de sample 161 presente na Figura 1. No topo dos picos da fluorescência medida é indicado em FU. Picos visualmente distinguíveis que não foram detectados pela necessidade software Bioanalyzer a ser estimado por lê-los para fora da trama como realizado para o pico com um valor de fluorescência estimado de 113 FU (em azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Perfil eletroforética da amostra de 211 presentes na Figura 1. No topo dos picos seu tamanho é indicado em pb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Captura de tela do software Mahal. Na caixa de texto "Picos de entrada (pb)" os tamanhos de pico de amostra 211 da Figura 3 são preenchidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O passo mais importante de todo o processo é quando há um excesso de ADN de RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensaio puro) ^2. Em geral, a resolução de um perfil é ideal se todos os seus picos de começar e terminar na linha de base. Se dois picos são muito próximos, a resolução é incompleto. Sob estas condições, o software Bioanalyzer inadequado pode levar ao pico de identificação de modo a que é requerida uma identificação manual.

Todos os picos visivelmente separadas e relevantes expressos em pb ou FU são incluídos para análises posteriores. Demasiado DNA modelo para RS-PCR resulta em picos largos e, portanto, para o pico resolução sobreposição e deficientes dos picos. Além disso, a migração mais lenta é a principal pico de tamanhos que são falsamente aumentadas de modo a que o genótipo já não pode ser inferida. Finalmente, o número de picos irrelevantes é maior. Para perfis com mais de 3 picos, o pico com o máximo de fluorescência normalmente não deve exceder 150 FU.

A genotipagem por RS-PCR como descrito é limitado pelo facto de que o investimento em máquinas é necessário e o software livre Mahal é necessária. Na verdade, são necessários uma máquina de PCR padrão e o Bioanalyzer. O primeiro é bastante barato hoje em dia, enquanto a segunda é mais caro. A resolução de electroforese em agarose-base não é suficiente, mesmo se for alta resolução de agarose é usado. Nestas condições, é apenas possível distinguir entre GTB, GTC, e todos os outros genótipos. Os custos para a electroforese utilizando o kit de MED ou electroforese em agarose, no entanto, são similares. O kit MED em conjunto com o Bioanalyzer ainda supera electroforese de agarose padrão de uma maneira que o último método é útil, para a frente, e os dados obtidos está presente na forma electrónica que simplifica o armazenamento e análise adicional consideravelmente. Principalmente todos bioanalyzers comercialmente disponíveis são adequados para este tipo de análise desde que o electrophoretresolução ic é adequado e o tamanho obtido das bandas é preciso e imparcial.

A resolução da RS-PCR para as estirpes da espécie bovina de S. aureus é alta. É tão bom como tipagem spa, e melhor do que MLST e PFGE ^4,14. Além disso, em comparação com todos os outros métodos de tipagem comumente utilizados para subtipagem S. aureus (tipagem spa, MLST, PFGE), o seu rendimento da amostra é elevada: extração de DNA é fácil e rápido, 96 amostras podem ser processadas em uma corrida RCR (normalmente O / N) e eletroforese e do genótipo inferência é sempre em frente. A análise completa de 96 amostras requer uma noite para PCR e um dia para eletroforese e avaliação. Outras vantagens de RS-PCR por Fournier et al. ² são os custos baixos, em particular quando comparado com MLST que exige sete genes a serem sequenciados em ambas as direcções ^15. Além disso, RS-PCR é o único método prevendo contagiosidade e patogenicidade de estirpes deS. aureus envolvidos em mastite bovina ^2,5, preditores chave na medicina veterinária clínica. Finalmente, RS-PCR por si só é suficiente para investigar a epidemiologia de S. bovina aureus ^3,4,5,14. A interpretação dos dados é sempre em frente, mesmo em um contexto internacional como apenas alguns genótipos principais são observados ^2,3. Para comparações epidemiológicas entre bovinos e cepas humanas, RS-PCR e tipagem spa juntos são preferíveis como o último método é amplamente utilizado para subtipagem cepas humanas de modo que uma grande quantidade de dados está disponível. MLST, contudo, é adequado para avaliar a clonalidade das estirpes ¹⁵ e para análises filogenéticas ^4.

Para solução de problemas em relação à cycler PCR, kit MED, ea Bioanalyzer, os manuais correspondentes devem ser consultados. No caso do método de RS-PCR, solução de problemas é maciçamente simplificado se os controles de PCR positivas e negativas adequadas são included em cada corrida. Se o controle positivo é negativo, a mistura de PCR não foi adequadamente composto e / ou o ADN de controlo foi degradada. Se o controlo negativo _(H2O) gerada uma ou mais bandas, a mistura de PCR foi contaminado com um pouco de DNA. Em ambos os casos, os perfis não deve ser interpretado e RS-PCR tem de ser repetido. Se a interpretação é impossível por causa de um problema de electroforese, electroforese deve ser repetido utilizando um novo chip. problemas electroforéticos são normalmente caracterizados pela migração inadequada e o alinhamento de uma ou ambas as bandas dos marcadores resultantes de carregamento e manipulação do chip inadequado. Se o perfil de electroforese obtida não pode ser interpretado pelo software Mahal, o ficheiro do perfil gerado pelo software Bioanalyzer é enviado para o autor para posterior avaliação. Normalmente, o ADN molde foi muito usado para RS-PCR ou o perfil representa um novo genótipo variante ou genotípico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'