Introduction
Staphylococcus (S. aureus) se conoce como el patógeno más importante en todo el mundo responsable de la infección intramamaria (IMI) en el ganado 1. El estudio realizado por Fournier et al., 2 demostrado en las vacas suizas y los estudios realizados por Cosandey et al. 3 y de Boss et al. 4 en vacas de 12 países europeos que S. aureus aislado de bovino IMI es un grupo genéticamente heterogéneo. Mediante amplificación por PCR de la región espaciadora intergénica 16S-23S rRNA (RS-PCR), un total de 17 genotipos se detectaron inicialmente en 101 aislamientos epidemiológicamente independientes 2. El genotipo B y C de genotipo (GTC) fueron más comunes (80%), mientras que los otros 15 genotipos (SMT) se produjeron en raras ocasiones, cada uno haciendo del 1 al 4% de todos los aislamientos. A nivel europeo 3, GTB, GTC, GTF, GTI, y GTR fueron los genotipos más importantes que comprenden el 76% de todas las cepas analizadas (n = 456). GTB se encuentra en el centro de Europa wientras los otros genotipos se difundieron ampliamente. El 24% restante de las cepas incluyó 41 genotipos, muchos de ellos, sin embargo, se observaron sólo una vez.
Los estudios realizados por Fournier et al., 2, Cosandey y col. 3, y Graber et al. 5 demostraron además que los genotipos fueron altamente asociados con su patrón de genes de virulencia, así como en el suizo como a nivel europeo. Los estudios revelaron diferencias más grandes en la prevalencia entre IMI S. aureus GTB, GTC y los otros genotipos 2,5: Teniendo en cuenta GTB, hasta el 87% de las vacas de un rebaño se infectaron por este genotipo. En el caso de GTC y de los otros genotipos, sin embargo, IMI fue sólo se encuentra en 1 a 2 vacas de un rebaño.
IMI causada por S. aureus, normalmente resulta en la inflamación de las glándulas mamarias correspondientes y un aumento de células inflamatorias en la leche. Como consecuencia de ello, la co células somáticasunts en la leche (SCC), el indicador clave de la calidad de la leche en la mayoría de los países, se incrementa dando lugar a una disminución del precio de la leche o incluso detener la entrega.
Además de la RS-PCR de Fournier et al. 2, se han descrito otros métodos de tipificación para subtipificación cepas bovinas de S. aureus 8-11. Dos de los más comunes incluyen la tipificación spa de 12 y Multi Locus Secuencia Typing (MLST) 13. El primero de ellos está basado en el ADN secuenciación de la región espaciadora variable del gen que codifica para la proteína de spa estafilocócica A, mientras que el segundo se requiere la secuenciación de los genes de limpieza 7. Esto significa que un 12 y siete PCRs 13, respectivamente, necesitan ser realizados, seguido de purificación amplicón, reacción de secuenciación y el análisis utilizando equipo específico. En comparación con RS-PCR, estos métodos requieren un esfuerzo adicional considerable en el laboratorio que resulta en un flujo de muestras de bajo y altos costos. losel rendimiento es especialmente baja en el PFGE. Teniendo en cuenta la resolución de estos métodos para las cepas de la especie bovina de S. aureus, RS-PCR es por lo menos tan bueno como spa escribir 4 y mejor que MLST 4 o PFGE 15.
Todos estos métodos que incluyen la tipificación binaria 13 demostraron su eficacia en la obtención de una mayor comprensión de la patogénesis de la IMI bovina causada por S. aureus, pero debido a las restricciones mencionadas son menos apropiados para grandes investigaciones clínicas. Además, la genotipificación por RS-PCR como se describe por Fournier et al. 2 permite la predicción fiable de la epidemiológica y el potencial patógeno de S. aureus involucrado en el IMI bovina, dos valores clave en la medicina veterinaria clínica.
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Protocol
1. aislados de Staphylococcus aureus
- Spread 10 l de S. aureus cultivo madre o una colonia crecida en un medio selectivo en placas de agar Columbia que contenían 5% de sangre de oveja (BA).
- Incubar aeróbicamente a 37 ° C durante 18 horas a 24 horas.
2. Extracción de ADN
- Preparar tampón TEL que contiene Tris-HCl 10 y 10 mM Na 2 EDTA, pH 8,5. Preparar alícuotas y autoclave a 121 ° C durante 15 min.
- Recoge 1 colonia de BA utilizando un asa estéril de plástico o un palillo de madera estéril y resuspender en 100 l TEL. Utilice tubos de 1,5 ml con tapones de rosca.
- Incubar a 95 ° C durante 10 min. Después, colocar las muestras inmediatamente en hielo húmedo.
- Diluir las muestras 1: 100 en H 2 O adecuado para PCR (= molde de ADN para la PCR). Las muestras no diluidas y diluidas pueden conservarse a -20 ° C durante 1 mes.
3. RS-PCR
- Ejecute el siguiente programa de ciclos en un ciclador de PCR estándar: 15 min 95 ° C, seguido de 27 ciclos que comprenden 94 ° C durante 1 min, seguido de una rampa de 2 min y recocido a 55 ° C durante 7 min. Después de otros 2 min rampa, se extienden a 72 ° C durante 2 min. Terminar PCR por una extensión final a 72 ° C durante 10 min seguido de enfriamiento a 4 ° C.
NOTA: Los productos de PCR se pueden almacenar a -20 ° C durante 5 días. - Para cada serie de RS-PCR incluye un control positivo, es decir, una muestra con un genotipo conocido (normalmente GTB), y un control negativo (H 2 O).
4. Electroforesis
- Utilice un kit de electroforesis miniaturizado comercial de ADN (kit MED) juntocon un Bioanalyzer conectado a un PC y el software instalado. Estudiar los manuales correspondientes del fabricante cuidadosamente.
- Configurar la estación de cebado de chips y ajustar el clip de jeringa de acuerdo con el manual del fabricante.
- Preparar la mezcla de gel colorante según el manual del fabricante.
- Carga de la mezcla de gel colorante (de acuerdo con el manual del fabricante).
- Equilibrar la mezcla de gel de colorante a RT durante 30 min antes de su uso.
- Ponga nuevo chip de ADN en el chip de la estación de cebado. Pipeta de 9 l de gel colorante en el G. bien marcado
- Asegúrese de que el émbolo se posiciona a 1 ml y luego cerrar la estación de cebado de chips. Presione el émbolo hasta que se lleva a cabo por el clip de jeringa. Espere exactamente durante 30 segundos y luego suelte el clip de jeringa.
- Espere a 5 seg. Tire lentamente el émbolo de 1 ml posición.
- viruta abierta estación de cebado y pipeta de 9 l de gel colorante en ambos pozos marcados "G".
- Carga del MArker
- Pipeta 5 l de marcador en los 12 pocillos de muestra y en la escalera bien. No deje ninguna de las 13 pozos vacíos.
- Cargando la escalera y las muestras.
- Pipeta de 1 l de escalera de ADN a la bien marcada con el signo escalera.
- Pipeta de 1 l de muestra (pozos utilizados) o 1 l de agua desionizada (pocillos no utilizados).
- Ponga el chip horizontalmente en el adaptador y de vórtice durante 1 min a 2400 rpm.
- Ejecutar el chip en el Bioanalyzer dentro de 5 minutos.
- Ejecución del análisis
- Iniciar el Bioanalyzer y el ordenador conectado. Abra el software.
- Abra la tapa de la Bioanalyzer y colocar el chip en el soporte de chip (chip encaja de una sola manera). Cierre la tapa con cuidado.
- En el contexto del instrumento del software seleccione "Electroforesis"> "ADN de doble cadena"> "ADN 7500". Aceptar el prefijo del archivo actual del software o modificarlo.
- Haga clic en el botón de inicio presente en el software. Introduzca los nombres de las muestras en el software. Una vez finalizada la ejecución de chip (después de aproximadamente 30 min) el Fin del mensaje de ejecución aparece en el software Bioanalyzer.
- Retirar el chip y la limpieza de los electrodos de la Bioanalyzer de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Inferir el genotipo de la Reseña Electroforesis
- Cargar el software Mahal (software está disponible gratuitamente a partir de los autores).
- datos de referencia de importación en el software Mahal: "Archivo"> "Importar datos de referencia"
- Abra la electroforesis ejecutarse en el contexto de datos del software Bioanalyzer. Seleccionar un perfil de electroforesis de una muestra.
- Compruebe si los picos relevantes.
- Utilice el software Mahal para comprobar si los picos relevantes: "Herramientas"> "media de fluorescencia". Insertar en el cuadro de la "fluorescencia"los valores de fluorescencia indican como unidades de fluorescencia (FU), ya que se pueden leer desde el software Bioanalyzer. Inserte los 4 (3) con picos de fluorescencia más elevada en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 126 130 132 137.
NOTA: Si no todos estos picos FU se indican mediante el software Bioanalyzer, tienen que ser estimado por la lectura de estas naciones de la trama.
- Utilice el software Mahal para comprobar si los picos relevantes: "Herramientas"> "media de fluorescencia". Insertar en el cuadro de la "fluorescencia"los valores de fluorescencia indican como unidades de fluorescencia (FU), ya que se pueden leer desde el software Bioanalyzer. Inserte los 4 (3) con picos de fluorescencia más elevada en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 126 130 132 137.
- Presione el botón "Calcular". Un pico es relevante si la fluorescencia observado es superior al valor indicado en el cuadro de "pico de altura mínima".
- Inferir el genotipo.
- Insertar en los Mahal cuadro de texto "Picos de entrada (pb)" a los tamaños en pares de bases de todos los picos pertinentes en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 440.462.519.579.637.
NOTA: Si no todos estos tamaños máximos se indican mediante el software Bioanalyzer, tienen que ser estimado por la lectura de estas naciones de la trama.
- Insertar en los Mahal cuadro de texto "Picos de entrada (pb)" a los tamaños en pares de bases de todos los picos pertinentes en orden ascendente y separados por comas. Ejemplo: 440.462.519.579.637.
- Presione el botón "Calcular".
- En la listacaja, buscar la mínima distancia de Mahalanobis al cuadrado "d2m". Si el valor de P correspondiente derecho a es ≥0.05 entonces la probabilidad es ≥5% de que la hipótesis nula H 0 se rechaza (H 0: el observado y el perfil de referencia son idénticos), que significa que el perfil observado se acepta ser idéntica a el perfil de referencia del genotipo indicada.
- Si d2m es mínimo, pero el campo del valor P correspondiente está vacía, rechazar H 0 con una probabilidad <5%.
NOTA: Esto significa que los perfiles son desiguales aunque d2m es mínima. Tal resultado puede ser el resultado de condiciones que no sean promedio de electroforesis.- Para corregir estas desviaciones, insertar en el cuadro de texto "Observado Pico (pb)" el valor 395 y pulse el botón "Calcular". Revisar una vez más d2m mínimo y un valor de p correspondiente ≥0.05. Si no tiene éxito, trate de los valores 405, 415, y 425.
NOTA: A veces pasos más pequeños son aúnindicado. Si todavía no tiene éxito, el perfil observado no está presente en los datos de referencia, puede ser un nuevo genotipo o variante.
- Para corregir estas desviaciones, insertar en el cuadro de texto "Observado Pico (pb)" el valor 395 y pulse el botón "Calcular". Revisar una vez más d2m mínimo y un valor de p correspondiente ≥0.05. Si no tiene éxito, trate de los valores 405, 415, y 425.
- Varios perfiles
- Repita los pasos 5.6 a 5.9 para cada perfil de electroforesis por separado.
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Representative Results
Definición de un genotipo y sus variantes
Un perfil electroforético que difieren en más de una banda de todos los genotipos identificados se considera como un nuevo genotipo. Nuevos genotipos se nombran y se extendieron acuerdo con Fournier et al. 5 que conduce a los genotipos de GTA a la GTZ, seguido de los genotipos GTAA a GTAZ, y GTBA a GTBZ, y al GTCA GTCC en la actualidad. Variación en sólo una banda es considerada como una variante genotípica. Se indica con números romanos superíndice después del nombre del genotipo (por ejemplo, GTRI, GTRII). En total, actualmente hay 141 genotipos y variantes en la base de datos de referencia.
En las condiciones descritas anteriormente, RS-PCR por Fournier et al. 5 es altamente reproducible para determinar el genotipo de las cepas de S. aureus. La identificación definitiva de ungenotipo o variante conocida es siempre posible si los problemas técnicos pueden ser excluidas. Un resultado típico se presenta en la Figura 1 demuestra la electroforesis de 12 productos RS-PCR y presentado en el modo pseudo gel por el software Bioanalyzer. Cada carril se caracteriza por un patrón de dos o más bandas de PCR y una banda de marcador en el frente y una banda de marcador al final. Al hacer doble clic en un carril abre el perfil electroforético correspondiente, medido realmente en una ventana separada. El software Bioanalyzer permite, entre otras posibilidades, los picos observados se leen como el tamaño como unidades fluorescentes FU (Figura 2) o en pares de bases (Figura 3) mediante el cual un pico corresponde exactamente a una banda en el modo pseudo-gel. Se requiere la lectura de pico en FU para la evaluación de los picos relevantes de un perfil en el software Mahal (Figura 4), la lectura de la presión arterial para inferir el genotipo. picos irrelevantes se definen en el software Mahal como pequeño guisanteks cuya observado fluorescencia FU está por debajo de 40% de la media geométrica de los 4 (3) picos con fluorescencia más elevada. Se observan normalmente cuando hay un exceso de ADN en RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensayo puro) 2.
Como un ejemplo, el genotipo de la muestra 211 presente en la figura 1 se infiere. El análisis visual del perfil electroforético de la Figura 2 (software Bioanalyzer) y el análisis con el software Mahal con la función para la prueba de los picos irrelevantes reveló 6 picos relevantes con tamaños de pico de 395 pb, 432 pb, 453 pb, 505 pb, 567 pb, y 622 pb (Figura 3). Estos valores se hayan completado y separados por comas en el cuadro de texto "Picos de entrada (BP)" del software Mahal (Figura 4). Para corregir las desviaciones de ejecución específica, el valor 415 se inserta en el cuadro de texto "Observado Pico (pb)" (Figura 4). Después de haber pulsado el "Cbotón alculate ", se presenta una lista ordenada por el genotipo junto con el d2m distancia de Mahalanobis al cuadrado entre el perfil genotípico consultada e indicado. desplazarse por la lista en busca de d2m mínimo. En el presente caso, un mínimo de d2m es igual a 4.499 (Figura 4) con un valor de P ≥0.05, lo que significa que el perfil consultado no difiere significativamente de la de GTB.
Las variantes de genotipos se indican como _I a _XV en el software Mahal. En el caso del genotipo B, existen las tres variantes GBT I, II GBT, y GBT III que se indican como b_i, B_II, y B_III en el software (Figura 4).
Un chip de la kit MED permite que los productos de análisis de 12 RS-PCR a la vez. Si menos productos están disponibles, los pozos restantes necesitan ser cargados con agua desionizada. Los resultados sólo pueden ser interpretados si los controles inclu en RS-PCR son apropiados.
Figura 1. Pseudo-gel que representa 12 productos RS-PCR y sus genotipos inferidos. Doce cepas diferentes de S. aureus fueron analizados por RS-PCR usando el kit de MED junto con un Bioanalyzer y el software incluido. El carril en el lado izquierdo muestra el marcador o "escalera" para la calibración tamaño del sistema en pb. En la parte superior de los gráficos, los nombres de las muestras y los genotipos correspondientes son acusados que fueron obtenidos por el software Mahal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Perfil electroforético de sample 161 presente en la Figura 1. En la parte superior de los picos de la fluorescencia medido se indica en FU. Picos visualmente distinguibles que no fueron detectados por la necesidad de software Bioanalyzer que deben estimarse mediante la lectura de estas naciones de la trama como la realizada para el pico con un valor de fluorescencia estimado de 113 FU (en azul). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Perfil electroforético de muestra de 211 presentes en la Figura 1. En la parte superior de los picos de su tamaño se indica en el punto de ebullición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Captura de pantalla del software Mahal. En el cuadro de texto "Picos de entrada (pb)" los tamaños máximos de la muestra 211 de la Figura 3 se rellenan. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paso más crítico de todo el procedimiento es cuando hay un exceso de ADN en RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensayo puro) 2. En general, la resolución de un perfil es óptimo si todos sus picos de inicio y fin en la línea de base. Si dos picos están demasiado juntos, la resolución es incompleta. En estas condiciones, el software Bioanalyzer puede conducir a la identificación de los picos apropiado de manera que se requiere la identificación manual.
Todos los picos visiblemente separadas y relevantes expresados como pb o FU se incluyen para otros análisis. El exceso de ADN molde para RS-PCR resulta en picos anchos y por lo tanto a pico resolución superposición y alteración de los picos. Además, la migración es más lenta líder a pico tamaños que se incrementan falsamente que el genotipo ya no se puede inferir. Por último, el número de picos irrelevantes es más grande. Para los perfiles con más de 3 picos, el pico de fluorescencia con la máxima no debería exceder las 150 FU.
Genotipado por RS-PCR como se ha descrito está limitado por el hecho de que la inversión en máquinas es necesario y se requiere el software gratuito Mahal. De hecho, se necesitan una máquina estándar de PCR y el Bioanalyzer. El primero es bastante barato hoy en día, mientras que el último es más caro. La resolución de electroforesis basado en agarosa no es suficiente incluso si se utiliza alta resolución de agarosa. En estas condiciones es sólo posible distinguir entre GTB, GTC, y todos los otros genotipos. Los costes para la electroforesis utilizando el kit de MED o electroforesis de agarosa, sin embargo, son similares. El kit MED junto con el Bioanalyzer más supera a electroforesis en agarosa estándar de una manera que el último método es práctico, sencillo, y los datos obtenidos está presente en forma electrónica que simplifica el almacenamiento y el posterior análisis considerablemente. Principalmente todos bioanalyzers disponibles comercialmente son adecuados para este tipo de análisis, siempre que el electrophoretResolución de CI es adecuado y el tamaño de las bandas obtenida es precisa e imparcial.
La resolución de RS-PCR para las cepas de la especie bovina de S. aureus es alta. Es tan buena como la tipificación spa, y mejor que MLST y PFGE 4,14. Además, en comparación con todos los otros métodos de caracterización usados comúnmente para la subtipificación S. aureus (tipificación spa, MLST, PFGE), su rendimiento de la muestra es alto: la extracción de ADN es fácil y rápido, 96 muestras se pueden procesar en una carrera RCR (normalmente S / N) y la electroforesis e inferir el genotipo es sencillo. El análisis completo de 96 muestras requiere una noche para PCR y un día para la electroforesis y la evaluación. Otras ventajas de RS-PCR por Fournier et al. 2 son los bajos costos, especialmente en comparación con MLST que requiere siete genes para ser secuenciados en ambas direcciones 15. Además, RS-PCR es la única predecir contagiosity método y la patogenicidad de cepas deS. aureus implicados en la mastitis bovina, 2,5 predictores clave en la medicina veterinaria clínica. Finalmente, RS-PCR por sí sola es suficiente para investigar la epidemiología de S. bovino aureus 3,4,5,14. Interpretación de los datos es sencillo, incluso en un contexto internacional tan sólo unos pocos genotipos principales se observan 2,3. Para las comparaciones epidemiológicas entre bovina y las cepas humanas, RS-PCR y la tipificación spa juntos son preferibles como el último método es ampliamente utilizado en la tipificación de las cepas humanas de modo que una gran cantidad de datos está disponible. MLST, sin embargo, es adecuado para la evaluación de la clonalidad de las cepas 15 y para los análisis filogenéticos 4.
Para la solución de problemas en relación con el termociclador de PCR, kit de MED y el Bioanalyzer, los manuales correspondientes deben ser consultados. En el caso del método de RS-PCR, la solución de problemas se simplifica enormemente si los controles de PCR positivos y negativos apropiados son included en cada serie. Si el control positivo es negativo, la mezcla de PCR no estaba compuesto adecuadamente y / o el ADN de control fue degradado. Si el control negativo (H 2 O) generado una o más bandas, la mezcla de PCR estaba contaminado con algo de ADN. En ambos casos, los perfiles no deben ser interpretadas y RS-PCR tiene que repetirse. Si la interpretación no es posible debido a un problema de electroforesis, electroforesis necesita ser repetido usando un nuevo chip. problemas electroforéticos se caracterizan normalmente por la migración inadecuada y la alineación de una o ambas bandas marcadoras resultante de la carga y la manipulación del chip apropiado. Si el perfil de electroforesis obtenido no puede ser interpretado por el software Mahal, el archivo de perfil generado por el software Bioanalyzer se envía al autor para su posterior evaluación. Normalmente, se usa demasiado de ADN plantilla para RS-PCR o el perfil representa un nuevo genotipo o variante genotípica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
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