Introduction
葡萄球菌 （ 金黄色葡萄球菌 ）被称为全球用于在牛1乳房内感染（IMI）负责的最重要的病原体。在12个欧洲国家的奶牛研究由Fournier 等人 2瑞士奶牛示范和研究通过Cosandey 等 3和老板等 4 S.金黄色葡萄球菌从牛隔离IMI是一种遗传异质组。由16S-23S rRNA基因间区（RS-PCR）的PCR扩增，共有17个基因型在101流行病学独立的分离2最初检测。基因型B和C型（GTC）是最常见的（80％），而其它15个基因型（GTS）发生很少，各使所有的菌株1至4％。在欧洲3级，GTB，GTC，GTF，GTI和GTR是由所有分析的株（N = 456）的76％，最重要的基因型。 GTB是位于欧洲中部W¯¯hereas其他基因型广泛传播。菌株的其余24％包含41种基因型，其中许多，但是，观察到只有一次。
通过Fournier 等人的 2，Cosandey 等 3和格雷伯等人 5的研究进一步表明，基因型与它们的毒力基因图案在瑞士高度相关的，以及如在欧洲一级。该研究进一步揭示之间S.在IMI患病率差异巨大的金黄色葡萄球菌 GTB，GTC和其他基因型2,5：考虑GTB，最多在牛群奶牛的87％是由这种基因型感染。在GTC和其他基因型的情况下，然而，IMI仅在1至2的奶牛畜群的发现。
IMI引起S.黄色葡萄球菌 ，通常会导致在相应的乳腺炎症和牛奶中的增加的炎性细胞。因此，体细胞共牛奶UNTS（SCC），牛奶的品质在大多数国家的关键指标，增加从而导致降低牛奶价格甚至停止发货。
除了Fournier 等人 2的RS-PCR其他分型方法已为亚型S的牛菌株描述金黄色葡萄球菌 8-11。两种最常见的包括水疗打字12多位点序列分型（MLST）13。前者是基于DNA测序葡萄球菌温泉基因编码蛋白质A的可变间隔区，而后者要求7管家基因的测序。这意味着一个12和七个PCR的13，分别需要执行，随后扩增子纯化，测序反应和分析使用特定的设备。相比的RS-PCR，这些方法需要在导致低的样品通量和成本高的实验室一个相当大的额外的努力。该吞吐量是特别低PFGE。考虑到这些方法对S的牛株分辨率金黄色葡萄球菌 ，RS-PCR是至少作为温泉打字4和优于MLST 4或电泳15一样好。
所有这些方法包括二进制打字13表现在获得进一步的深入了解造成S.牛IMI的发病机制及其有效性所提到的限制的金黄色葡萄球菌 ，但因为它们是用于大型临床研究较少为宜。另外，作为由Fournier 等人描述由RS-PCR基因分型。2允许流行病学和S的致病潜力的可靠的预测金黄色葡萄球菌参与牛IMI，在临床兽医学两个关键值。
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Protocol
1. 金黄色葡萄球菌菌株
- 价差10微升的S.金黄色葡萄球菌的库存培养或一个菌落生长在含5％绵羊血（BA）哥伦比亚琼脂板上的选择性培养基上。
- 在37℃需氧温育18小时至24小时。
2. DNA提取
- 制备含10mM的Tris-HCl和10mM 的 Na 2 EDTA，pH 8.5的TEL缓冲液中。在121℃制备等分试样并高压灭菌15分钟。
- 用100微升TEL无菌塑料环或无菌的木制牙签，重悬收集BA 1殖民地。应用1.5 mL管与螺旋盖。
- 孵育在95℃下进行10分钟。随后，立即将样品在湿冰。
- 稀释样品1：100在适合的PCR（=模板DNA用于PCR） 的 H 2 O操作。非稀释和稀释的样品可以保持在-20℃下1个月。
3. RS-PCR
- 在标准PCR循环仪运行下面循环的程序：15分钟95℃，随后27个循环，包括94℃1分钟，随后在2分钟坡道和退火在55℃7分钟。再过2分钟斜坡后，在72℃延伸2分钟。通过在72℃最后延伸10分钟，然后冷却至4℃终止的PCR。
注：PCR产物可被储存在-20℃下5天。 - 对于每次运行的RS-PCR包括一个阳性对照， 即，与已知的基因型（通常GTB）的样品，和一个阴性对照（H 2 O）。
4.电泳
- 使用脱氧核糖核酸（救护包）商用微型电泳试剂盒一起连接到PC和安装软件生物分析仪。仔细研究制造商的相应手册。
- 设置在芯片涂刷站并根据制造商的手册调节注射器剪辑。
- 根据制造商的手册制备凝胶染料混合。
- 载入凝胶染料混合物（根据制造商的手册）。
- 平衡凝胶染料混合至RT使用前30分钟。
- 提出了新的DNA芯片的芯片吸站。吸管9微升凝胶染料在井标记G.
- 确保柱塞被定位以1ml，然后关闭该芯片涂刷站。按柱塞，直到它被注射器夹子保持。正是等待30秒再松开注射器夹。
- 等待5秒。活塞慢慢回拉至1ml的位置。
- 打开芯片吸站和吸管9微升凝胶染料在井都标有'G'。
- 加载并购arker
- 吸取5微升标记在所有12个样品孔，并在梯井。不要让这些13口井空的。
- 加载梯和样品。
- 吸管1μl的DNA梯状到良好标有阶梯符号。
- 吸取1微升样品（用井）或1微升去离子水（未使用的水井）的。
- 横过来时，芯片的适配器和涡旋1分钟2400转。
- 5分钟内运行在生物分析仪芯片。
- 运行分析
- 启动生物分析仪和电脑相连。打开软件。
- 打开生物分析仪的盖和芯片放入芯片保持器（芯片只适合单程）。仔细盖上盖子。
- 在软件的仪器上下文菜单中选择“电泳”>“双链”>“DNA 7500”。接受软件的当前文件前缀或修改。
- 点击存在于软件的启动按钮。在软件中输入样本名。当芯片运行结束（后约30分钟） 运行邮件的末尾出现在生物分析仪软件。
- 根据制造商的指示删除该芯片和清洁生物分析仪的电极。
5.从电泳图谱推断基因型
- 加载泰姬陵软件（软件是免费提供从作者）。
- 进口参考数据到泰姬陵软件：“文件”>“导入参考数据”
- 打开在生物分析仪软件的数据上下文中运行电泳。选择一个样品的电泳轮廓。
- 检查相关的峰值。
- 使用泰姬陵软件来检查相关峰：“工具”>“平均荧光”。插入“荧光”框荧光值表示为荧光单位（FU），因为它们可以从生物分析仪软件被读出。将4（3）峰升序排列最高的荧光，以逗号分隔。例如：126130132137。
注意：如果不是所有的这些峰FU的由生物分析仪软件的指示，就需要通过从积读出来进行估计。
- 使用泰姬陵软件来检查相关峰：“工具”>“平均荧光”。插入“荧光”框荧光值表示为荧光单位（FU），因为它们可以从生物分析仪软件被读出。将4（3）峰升序排列最高的荧光，以逗号分隔。例如：126130132137。
- 按“计算”按钮。如果观察到的荧光超过盒子“最小峰高”给出的值峰值是相关的。
- 推断基因型。
- 插入文本框泰姬陵“输入峰（BP）”，在升序排列的所有相关峰基点大小和以逗号分隔。例如：440,462,519,579,637。
注意：如果不是所有这些峰的大小是由生物分析仪软件的指示，就需要通过从积读出来进行估计。
- 插入文本框泰姬陵“输入峰（BP）”，在升序排列的所有相关峰基点大小和以逗号分隔。例如：440,462,519,579,637。
- 按“计算”按钮。
- 在列表中，查找最小平方马氏距离“D2M”。如果相应的P值给它是≥0.05则概率为≥5％，该零假设H 0被拒绝（H 0：所观察到的与参考轮廓是相同的），这意味着所观察到的信息被接受，以完全相同指定基因型的基准轮廓。
- 如果D2M是最小的，但相应的P值的字段是空的，拒绝H 0的概率为<5％。
注意：这意味着该轮廓是不相等的，尽管D2M是最小的。这样的结果，可能会导致从非平均的电泳条件。- 为了纠正这些偏差，插入“观察峰（BP）”值395的文本框，然后按“计算”按钮。再次检查最小D2M和相应的P值≥0.05。如果不成功，尝试值405，415，和425。
注意：有时更小的步骤，甚至是表示。如果仍然没有成功，所观察到的信息中不存在的参考数据，它可能是一个新的基因型或变体。
- 为了纠正这些偏差，插入“观察峰（BP）”值395的文本框，然后按“计算”按钮。再次检查最小D2M和相应的P值≥0.05。如果不成功，尝试值405，415，和425。
- 各种型材
- 重复步骤对每个电泳图谱5.6至5.9分开。
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Representative Results
基因型及其变体的定义
电泳轮廓从所有确定的基因型在一个以上的频带不同的被认为是新的基因型。新基因型根据Fournier 等人的命名和扩展。5通往基因型GTA到GTZ，其次是基因型GTAA到GTAZ，并GTBA到GTBZ和GTCA到GTCC目前。只在一个频带变化被视为一个基因型变体。它的标志是基因型（如 GTRI，GTRII）的名称后，上标罗马数字。总共，目前有141基因型和变体在基准数据的基础上。
根据以上所述，RS-PCR由Fournier 等人 5的条件是高度重现基因型链球菌菌株金黄色葡萄球菌 。一个明确的鉴定已知基因型或变体始终是可能的，如果技术问题可被排除。典型的结果示于图1中展示的12的RS-PCR产物的电泳和在由生物分析仪软件伪凝胶模式呈现。每个泳道的特征在于在最后两个或更多个PCR条带的图案，并在前面的标记带和标记带。双击进入车道将打开一个单独的窗口对应的，实际测得的电泳轮廓。生物分析仪软件允许除其他的可能性，正在读取的观察到的峰的大小为荧光单位FU（ 图2）或在碱基（ 图3），由此一个峰在伪凝胶模式精确地对应于一个波段。在傅峰值读数需要评估在陵软件简档的相关峰（ 图4），在碱基阅读推断基因型。无关峰在泰姬陵软件小豌豆定义KS的观测荧光FU低于具有最高荧光的4（3）的峰的几何平均值的40％。当在RS-PCR过量的DNA（> 30纳克纯的DNA /测定）它们通常观察到2。
作为一个例子，存在于图1中样品211的基因型推断。 图2中的电泳轮廓（生物分析仪软件）和分析使用该工具来测试无关峰泰姬陵软件的可视化分析发现6 395基点，432基点，453基点，505基点，567基点的峰值大小相关的峰值，和622碱基（ 图3）。这些值被填充并在文本“输入峰（bp）的”的陵软件（ 图4）由逗号分隔。为了校正特定的运行的偏差，该值415被插入到“看峰（bp）的”（ 图4）的文本框。具有按“℃后alculate“按钮，则提出的名单由基因型与查询和指示基因型轮廓之间的平方马哈拉诺比斯距离D2M一起排序。滚动列表寻找最小D2M。在目前情况下，最小的D2M等于4.499（ 图4）与P≥0.05的值，这意味着查询轮廓不显著从GTB之一不同。
基因型变体表示为_I在陵软件_XV。在B型的情况下，存在三种变体GBT 我 ，GBT II和GBTⅢ示为B_I，B_II和B_III在软件（ 图4）。
救护包的芯片允许12 RS-PCR分析的产品的时候。如果较少的产品都可用，剩余孔需要被装入去离子水。结果可能只有控制来解释我在RS-PCR ncluded是适当的。
S. 图1.代表12 RS-PCR产品及其推断基因型伪凝胶。十二个不同的菌株金黄色葡萄球菌是由RS-PCR一起使用MED套件与生物分析仪及附带的软件进行分析。在左侧的车道显示了系统在碱基对大小校准标记或“阶梯”。在图形中，样品名称和相应的基因型起诉的泰姬陵软件获得的顶端。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. SA电泳简介mple 161存在于图1.在测量荧光在FU表示的峰的顶部。这不是由生物分析仪软件需要检测出视觉上区分峰由作为与113 FU（蓝色）的估计荧光值高峰期进行的阴谋读出来进行估算。 请点击此处查看这个大版本数字。
图3. 样品211出现在图1中它们的大小在BP表示峰顶部的电泳轮廓 。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 屏幕截图泰姬陵软件。在文本框中输入“输入峰（BP）”从图3的样品211的峰值大小填写。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
整个过程中最关键的步骤是当在RS-PCR（> 30纳克纯的DNA /测定）过量的DNA的2。在一般情况下，一个轮廓的分辨率为最佳，如果所有其峰在基线开始和结束。如果两个峰值靠得太近，分辨率是不完整的。在这些条件下，从而需要人工识别的生物分析仪软件可能导致不适当的峰鉴定。
所有表现为BP或FU的明显分离，相关峰作进一步的分析。太多模板DNA RS-PCR结果在宽峰，因此峰值峰重叠和受损的分辨率。此外，迁移较慢领先峰值大小被虚假增加，使得基因型不再可以推断。最后，不相关峰的数量较大。对于具有3个以上的山峰分布，最大荧光峰值通常不应超过150 FU。
由RS-PCR基因分型如所述由事实，即在机投资是必要的，并在需要自由陵软件限定。事实上，一个标准的PCR仪和生物分析仪是必要的。前者是相当便宜的现今，而后者是更昂贵的。基于琼脂糖电泳的分辨率是不够的，即使使用高分辨率琼脂糖。在这些条件下，这只是可能GTB，GTC和所有其它基因型之间进行区分。使用MED试剂盒或琼脂糖电泳电泳的费用，但是，是相似的。与生物分析仪进一步的救护包一起优于在某种程度上标准琼脂糖凝胶电泳，后者的方法是很方便，直线前进，并取得数据中存在于简化了存储和进一步分析大大电子形式。主要所有市售bioanalyzers适于这种类型的分析提供的electrophoretIC分辨率是足够的，得到的条带的大小是准确和客观公正。
RS-PCR对S的牛株分辨率金黄色葡萄球菌是很高的。它是作为水疗打字一样好，而比MLST和电泳4,14更好。此外，相对于所有常用的亚型S的其他分型方法金黄色葡萄球菌 （ 温泉打字，MLST，PFGE），其样品通量高：DNA提取是方便，快捷，96个样品可以在一个RCR运行（通常是O / N）和电泳处理和基因型推理是直线前进。 96个样品的完整分析需要PCR一晚有一天电泳和评估。通过Fournier 等人的 2个 RS-PCR的其他优点是成本低，特别是当相比MLST需要7个基因在两个方向15进行测序。此外，RS-PCR是菌株的唯一方法预测contagiosity和致病参与牛金黄色葡萄球菌乳腺炎2,5，临床兽医学关键预测指标。最后，RS-PCR本身就足以调查的牛链球菌流行病学金黄色葡萄球菌 3,4,5,14。对数据的解释是直线前进，甚至在国际范围内，因为只有少数主要基因型观察2,3。对牛和人的菌株，RS-PCR和温泉打字之间流行病学比较一起优选作为后一种方法被广泛地用于亚型的人毒株，使得大量的数据是可用的。 MLST，但是，是适于评估菌株15的克隆能力和系统发育分析4。
有关的PCR仪故障排除，救护包，以及生物分析仪，相应的手册都将进行协商。在RS-PCR法的情况下，故障处理大量简化，如果适当的阳性和阴性的PCR对照是增量luded每次运行。如果阳性对照是否定的，PCR混合物没有充分组成和/或对照DNA被降解。如果阴性对照（H 2 O）产生的一个或多个带，所述PCR混合物中混有一些的DNA。在这两种情况下，配置文件不得解释和RS-PCR具有重复。如果解释是因为电泳问题是不可能的，电泳需要使用新的芯片进行重复。电泳问题通常特征在于迁移和一个对准不充分或不适当的装载和芯片的操纵导致两个标记带。如果获得的电泳图谱不能由陵软件来解释，由生物分析仪软件产生的资料文件被发送给作者以进行进一步评估。通常情况下，使用过多的模板DNA RS-PCR或情景代表了一种新的基因型或基因型变体。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
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