Genotypisierung Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

DOI

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Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) als wichtigste Erreger weltweit verantwortlich für die intramammäre Infektion (IMI) bei Rindern ¹ bekannt. Die Studie wurde von Fournier et al. ² in Schweizer Kühe unter Beweis gestellt und die Studien von Cosandey et al. ³ und Boss et al. ⁴ bei Kühen von 12 europäischen Ländern , dass S. aureus isoliert aus Rinder IMI ist eine genetisch heterogene Gruppe. Durch PCR - Amplifikation des 16S-23S - rRNA intergenischen Spacer - Region (RS-PCR), insgesamt 17 Genotypen wurden zunächst in 101 epidemiologisch unabhängige Isolate ² detektiert. Genotype B und Genotyp C (AGB) wurden am häufigsten (80%), während die anderen 15 Genotypen (GTs) selten aufgetreten, jeder macht 1 bis 4% aller Isolate. Auf europäischer Ebene ^3, GTB, GTC, GTF, GTI und GTR waren die wichtigsten Genotypen 76% aller untersuchten Stämme, die (n = 456). GTB wurde in Mitteleuropa während die anderen Genotypen wurden weit verbreitet. Die restlichen 24% der Stämme enthalten 41 Genotypen, von denen viele, aber nur einmal beobachtet.

Die Studien von Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ³ und Graber et al. ⁵ weiter gezeigt , dass die Genotypen stark mit ihrer Virulenz - Gen - Muster verbunden waren, sowie an der Schweizer wie auf europäischer Ebene. Die Untersuchungen ergaben , weitere massive Unterschiede in IMI - Prävalenz unter S. aureus GTB, GTC und die anderen Genotypen ^2,5: Berücksichtigung GTB, bis zu 87% der Kühe in einer Herde wurden von diesem Genotyp infiziert. Im Falle von GTC und der anderen Genotypen, jedoch wurde IMI nur in 1 bis 2 Kühen einer Herde gefunden.

IMI verursacht durch S. aureus, führt normalerweise zu einer Entzündung der entsprechenden Brustdrüsen und einem Anstieg von Entzündungszellen in der Milch. Als Folge co die somatische Zellunts in Milch (SCC), dem Schlüsselindikator für die Milchqualität in den meisten Ländern, erhöht wird, um eine verringerte Milchpreis oder sogar Lieferstopp führt.

Neben dem RS-PCR von Fournier et al. ^2, haben andere Typisierungsmethoden für Subtypisierung Rinder Stämme von S. beschrieben aureus ^11.08. Zwei häufigsten sind Spa - Typisierung ¹² und Multi - Locus - Sequenz Typing (MLST) ^13. Der erstere wird basierend auf DNA - Sequenzierung der variablen Spacer - Bereich des Staphylokokken - Spa Gen , das für Protein A, während die letztere die Sequenzierung von 7 Housekeeping - Genen erfordert. Dies bedeutet , dass eine ¹² bis sieben PCRs ¹³ jeweils durchgeführt werden müssen, gefolgt von Amplicon Reinigung Sequenzierungsreaktion und Analyse unter Verwendung spezifischer Ausrüstung. Im Vergleich zu RS-PCR, erfordern diese Verfahren einen erheblichen Mehraufwand in der resultierenden Labor in einem geringen Probendurchsatz und hohe Kosten. DasDurchsatz besonders niedrig ist die PFGE. Unter Berücksichtigung der Auflösung dieser Methoden für Rinder Stämme von S. aureus, RS-PCR ist mindestens so gut wie spa Eingabe ⁴ und besser als MLST ⁴ oder PFGE ^15.

Alle diese Methoden auch binäre Typisierung ¹³ gezeigt , um ihre Wirksamkeit bei der Beschaffung weitere Einblicke in die Pathogenese von Rinder-IMI verursacht durch S. aureus, aber wegen der genannten Einschränkungen sind sie weniger geeignet für große klinische Untersuchungen. Zusätzlich Genotypisierung von RS-PCR wie von Fournier et al. ² ermöglicht die zuverlässige Vorhersage der epidemiologischen und das pathogene Potential von S. aureus in Rinder-IMI, zwei Schlüsselwerte in der klinischen Veterinärmedizin beteiligt.

Protocol

1. Staphylococcus aureus - Isolaten

1. Verbreiten Sie 10 ul S. aureus Stammkultur oder eine Kolonie auf einem selektiven Medium gezüchtet auf Columbia - Agar - Platten , die 5% Schafblut (BA).
2. Inkubieren aerob bei 37 ° C für 18 Stunden bis 24 Stunden.

2. DNA-Extraktion

1. Bereiten TEL - Puffer , enthaltend 10 mM Tris-HCl und 10 mM Na ₂ EDTA, pH 8,5. Bereiten Aliquots und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min.
2. Sammeln Sie 1 Kolonie von BA eine sterile Plastikschleife oder einen sterilen Holz Zahnstochers und resuspendieren in 100 & mgr; l TEL verwenden. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss.
3. für 10 min bei 95 ° C inkubieren. Danach legen Sie die Proben sofort auf nassem Eis.
4. Verdünnen Sie die Proben 1: 100 in H ₂ O geeignet für PCR (= Template - DNA für die PCR). Das unverwässerte und verwässerte Proben können für 1 Monat bei -20 ° C aufbewahrt werden.

3. RS-PCR

2 O, 12,5 & mgr; l Taq Master Mix, 2 & mgr; l G1 Primer 10 uM, 2 & mgr; l L1 Primer 10 uM, und 7 & mgr; l Matrizen - DNA, die zu etwa 30 ng reiner entspricht DNA ^2.
1. Führen Sie die folgende PCR-Programm in einem Standard-PCR-Cycler: 15 min 95 ° C, gefolgt von 27 Zyklen bestehend aus 94 ° C für 1 min, gefolgt von einer 2 min Rampe und Tempern bei 55 ° C für 7 min. Nach weiteren 2 min Rampe 2 min bei 72 ° C erstrecken. Beenden PCR von einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min, gefolgt von Abkühlen auf 4 ° C.
   HINWEIS: Die PCR-Produkte können für 5 Tage bei -20 ° C gelagert werden.
2. Für jeden Lauf von RS-PCR umfassen eine positive Kontrolle, dh eine Probe mit einem bekannten Genotyp (normalerweise GTB) und eine negative Kontrolle (H ₂ O).

4. Elektrophorese

1. Verwenden Sie eine kommerzielle miniaturisierten Elektrophorese-Kit für die DNA (MED-Kit) zusammenmit einem Bioanalyzer auf einem PC und der installierten Software verbunden. Studieren Sie die entsprechenden Handbücher des Herstellers sorgfältig durch.
2. Stellen Sie den Chip Priming Station und stellen Sie die Spritze Clip entsprechend der Anleitung des Herstellers.
3. Bereiten Sie die Gel-Farbstoffmischung nach der Anleitung des Herstellers.
4. Laden des Gel-Farbstoff-Mix (gemäß dem Handbuch des Herstellers).
   1. Äquilibrieren Sie das Gel-Farbstoff-Mix auf RT für 30 Minuten vor dem Gebrauch.
   2. Setzen Sie neue DNA-Chip auf dem Chip Priming Station. Pipette 9 ul Gel-Farbstoff in dem gut markierten G.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Kolben in 1 ml positioniert ist, und dann den Chip Priming Station schließen. Drücken Sie Kolben, bis sie von der Spritze Klammer gehalten. Warten Sie genau 30 Sekunden dann die Spritze Clip lösen.
   4. Warten Sie 5 Sekunden. Ziehen Sie langsam Kolben in 1 ml Position zurück.
   5. Offene Chip Priming Station und Pipette 9 ul Gel-Farbstoff in beiden Brunnen markiert 'G'.
5. Laden der MArker
   1. Pipette 5 ul Marker in allen 12 Probenvertiefungen und in der Leiter gut. Nicht jeder dieser 13 Brunnen leer lassen.
6. Laden der Leiter und die Proben.
   1. Pipette 1 ul DNA-Leiter mit dem gut markierten mit der Leiter zu unterzeichnen.
   2. Pipette 1 ul Probe (verwendet Vertiefungen) oder 1 & mgr; l VE-Wasser (nicht verwendeten Wells).
   3. Setzen Sie den Chip horizontal in den Adapter und Vortex für 1 min bei 2.400 Umdrehungen pro Minute.
   4. Führen Sie den Chip in der Bioanalyzer innerhalb von 5 min.
7. Durchführung der Analyse
   1. Starten Sie den Bioanalyzer und dem angeschlossenen Computer. Öffnen Sie die Software.
   2. Öffnen Sie den Deckel des Bioanalyzer und platzieren Sie den Chip in den Chiphalter (der Chip passt nur in eine Richtung). Schließen Sie den Deckel vorsichtig.
   3. Im Instrument Kontext der Software wählen Sie "Elektrophorese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Akzeptieren Sie die aktuelle Datei - Präfix der Software oder zu modifizieren.
   4. Klicken Sie auf die Start-Taste in der Software. Geben Sie die Beispielnamen in der Software. Wenn der Chip Lauf (nach ca. 30 min) das Ende der Run Meldung erscheint in der Bioanalyzer Software beendet ist.
   5. Entfernen Sie den Chip und reinigen Sie die Elektroden der Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

5. Herleitung des Genotyps von der Elektrophorese Profil

1. Laden Sie die Mahal Software (Software von den Autoren frei verfügbar ist).
2. Import von Referenzdaten in die Software Mahal: "Datei"> "Import-Referenzdaten"
3. Öffnen Sie die Elektrophorese in der Datenkontext des Bioanalyzer Software. Wählen Sie ein Elektrophorese Profil einer Probe.
4. Überprüfen Sie für die entsprechenden Peaks.
   1. Verwenden Sie die Mahal Software für die jeweiligen Spitzen zu überprüfen: "Extras"> "Mean Fluoreszenz". Legen Sie in die "Fluoreszenz" -Boxdie Fluoreszenzwerte als Fluoreszenzeinheiten (FU) bezeichnet, da sie aus dem Bioanalyzer Software ausgelesen werden kann. Legen Sie die 4 (3) Gipfeln mit dem höchsten Fluoreszenz in aufsteigender Reihenfolge und durch Komma getrennt. Beispiel: 126.130.132.137.
      HINWEIS: Wenn nicht alle diese Spitzen FU durch die Bioanalyzer Software angezeigt werden, müssen sie durch das Lesen sie aus dem Grundstück zu schätzen.
5. Drücken Sie die Schaltfläche "Berechnen". Ein Höhepunkt ist dann relevant, wenn die beobachtete Fluoreszenz den Wert im Feld "Minimal Peakhöhe" gegeben überschreitet.
6. Infer den Genotyp.
   1. Legen Sie in die Textbox Mahal "Input Peaks (bp)" die Größen in bp aller relevanten Peaks in aufsteigender Reihenfolge und durch Komma getrennt. Beispiel: 440.462.519.579.637.
      HINWEIS: Wenn nicht alle diese Spitzengrößen von der Bioanalyzer Software angezeigt werden, müssen sie durch das Lesen sie aus dem Grundstück zu schätzen.
7. Drücken Sie die Schaltfläche "Berechnen".
8. In der ListeFeld, suchen Sie nach der minimalen squared Mahalanobisdistanz "d2m". Wenn der entsprechende Wert P Recht, es ist ≥0.05 dann ist die Wahrscheinlichkeit ≥5% , dass die Null - Hypothese H ₀ wird abgelehnt (H _0: die beobachtete und das Bezugsprofil identisch sind) , was bedeutet , daß die beobachtete Profil zu sein wird angenommen , identisch mit das Bezugsprofil des angegebenen Genotyp.
9. Wenn d2m minimal ist , aber das Feld des entsprechenden P - Wert ist leer, ablehnen H ₀ mit einer Wahrscheinlichkeit <5%.
   ANMERKUNG: Dies bedeutet, dass die Profilierungen ungleich sind, obwohl d2m minimal ist. Ein solches Ergebnis aus nicht-Durchschnitt Elektrophorese-Bedingungen führen kann.
   1. Um diese Abweichungen zu korrigieren, fügen Sie in das Textfeld "Beobachtet Peak (bp)" den Wert 395 ein und drücken Sie die Schaltfläche "Berechnen". Überprüfen Sie noch einmal für minimale d2m und eine entsprechende P-Wert ≥0.05. Gelingt dies nicht, versuchen Sie die Werte 405, 415 und 425.
      HINWEIS: Manchmal kleinere Schritte sind auchangegeben. Wenn noch nicht erfolgreich, das beobachtete Profil nicht in der Referenzdaten ist, kann es einen neuen Genotyp oder eine Variante sein.
10. Verschiedene Profile
    1. Wiederholen Sie die Schritte 5,6-5,9 für jede Elektrophorese Profil getrennt.

Representative Results

Definition eines Genotyp und seine Varianten

Eine elektrophoretische Profil in mehr als ein Band aus allen identifizierten Genotypen unterschiedlichen wird als neuer Genotyp betrachtet. Neue Genotypen werden nach Fournier et al genannt und erweitert. ⁵ mit den Genotypen GTA GTZ führt, die von den Genotypen GTAA zu GTAZ gefolgt, und GTBA zu GTBZ und GTCA zu AVB derzeit. Variation in nur einem Band als genotypische Variante angesehen. Es ist hochgestellt , nach dem Namen des Genotyps (zB GTRI, GTRII) mit römischen Ziffern angegeben. Insgesamt gibt es derzeit 141 Genotypen und Varianten in der Referenzdatenbank.

Unter den oben angegebenen Bedingungen, RS-PCR von Fournier et al. ⁵ ist in hohem Maße reproduzierbar Stämme von S. Genotyp aureus. Definitive Identifizierung einesbekannten Genotyps oder Variante ist immer dann möglich, wenn technische Probleme ausgeschlossen werden können. Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 1 zeigt die Elektrophorese von 12 RS-PCR - Produkte und präsentiert in dem Pseudo - Gel - Modus durch die Bioanalyzer Software dargestellt. Jede Spur wird durch ein Muster von zwei oder mehreren PCR-Banden und einem Markierungsband vor und ein Markierungsband am Ende gekennzeichnet. Ein Doppelklick in eine Gasse öffnet die entsprechenden, tatsächlich gemessene elektrophoretische Profil in einem separaten Fenster. Die Bioanalyzer Software ermöglicht, unter anderen Möglichkeiten, die beobachteten Peaks als Größe wie Fluoreszenzeinheiten FU (Figur 2) oder in bp (3) gelesen wird , wodurch eine Spitze genau einem Band in der pseudo-Gel - Modus entspricht. Spitzenwert in FU wird zur Ableitung des Genotyps für die Auswertung der relevanten Peaks eines Profils in der Mahal Software (Abbildung 4), das Lesen in bp erforderlich. Irrelevant Spitzen sind in der Mahal Software als kleine Erbse definiertks deren beobachtete Fluoreszenz FU unter 40% des geometrischen Mittels der 4 (3) Peaks mit dem höchsten Fluoreszenz. Sie werden üblicherweise beobachtet wird, wenn es einen Überschuss von DNA in RS-PCR (> 30 ng reine DNA / assay) ^2.

Als Beispiel wird der Genotyp der Probe 211 , die in Abbildung 1 zu entnehmen. Visuelle Analyse des elektrophoretischen Profils in 2 (Bioanalyzer Software) und Analyse mit dem Mahal Software das Werkzeug für irrelevant Peaks zu testen unter Verwendung ergab 6 entsprechenden Peaks mit Spitzengrößen von 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, und 622 bp (Abbildung 3). Diese Werte werden ausgefüllt und durch Komma in der Textbox "Input Peaks (bp)" der Mahal Software (Abbildung 4) getrennt. Zur Korrektur Laufspezifischen Abweichungen wurde der Wert 415 in das Textfeld eingefügt " , beobachtete Peak (bp)" (Abbildung 4). Nach dem "C gedrückt habenalculate "Taste wird eine Liste geordnet präsentiert von Genotyp zusammen mit dem Quadrat Mahalanobisdistanz d2m zwischen dem abgefragt und angezeigt genotypische Profil. in der Liste blättern für minimal d2m suchen. Im vorliegenden Fall minimal d2m ist gleich 4,499 (Abbildung 4) mit ein Wert von P ≥0.05, dass der abgefragte Profil nicht wesentlich von der eines der GTB unterscheidet sich bedeutend.

Varianten von Genotypen als _I in der angegebenen Mahal Software _XV. Im Fall von Genotyp B gibt es die drei Varianten GBT ^I, GBT ^II und ^III als GBT B_I angegeben, B_II und B_III in der Software (Abbildung 4).

Ein Chip des MED-Kit ermöglicht die Analyse der Erzeugnisse von 12 RS-PCR zu einem Zeitpunkt. Wenn weniger Produkte verfügbar sind, müssen die übrigen Vertiefungen mit entsalztem Wasser geladen werden. Die Ergebnisse können nur dann, wenn die Kontrollen interpretiert werden included in RS-PCR geeignet sind.

Abbildung 1. Pseudo-Gel repräsentieren 12 RS-PCR - Produkte und deren abgeleiteten Genotypen. Zwölf verschiedene Stämme von S. aureus wurden durch RS-PCR unter Verwendung des MED - Kit zusammen mit einem Bioanalyzer und der mitgelieferten Software analysiert. Die Spur auf der linken Seite zeigt den Marker oder "Leiter" für die Größe Kalibrierung des Systems in bp. Auf der Oberseite der Grafik werden die Probennamen und die entsprechenden Genotypen angeklagt, die von der Software Mahal erhalten wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die elektrophoretische Profil sample 161 in Abbildung 1. Oben auf den Gipfeln der gemessene Fluoreszenz in FU angedeutet ist. Optisch unterscheiden Spitzen , die nicht von der Bioanalyzer Software Notwendigkeit erkannt wurden durch das Lesen sie vom Grundstück geschätzt werden wie für die Spitze mit einem geschätzten Fluoreszenzwert von 113 FU (in blau) durchgeführt. Bitte hier klicken , um eine größere Version davon zu sehen Zahl.

Abbildung 3. Die elektrophoretische Profil der Probe 211 in Abbildung 1. Oben auf dem Gipfel ihrer Größe in bp angegeben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Screenshot der Software Mahal. Im Textfeld "Input Peaks (bp)" die Spitzengrößen der Probe 211 aus 3 sind ausgefüllt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Der wichtigste Schritt des gesamten Verfahrens ist , wenn ein Überschuß an DNA in RS-PCR ist (> 30 ng reine DNA / assay) ^2. Im allgemeinen Auflösung eines Profils ist optimal, wenn alle ihre Spitzen an der Grundlinie beginnen und enden. Wenn zwei Spitzen zu nahe beieinander sind, die Auflösung ist unvollständig. Unter diesen Bedingungen kann die Bioanalyzer Software zu unangemessenen Spitzen Identifizierung führen, so dass die manuelle Identifikation erforderlich ist.

Alle sichtbar getrennt und relevanten Peaks als bp oder FU ausgedrückt werden für weitere Analysen einbezogen. Zu viel Templat-DNA für die RS-PCR-Ergebnisse in breiten Peaks und daher überlappend und beeinträchtigter Auflösung der Peaks zu Spitze. Zusätzlich ist die Migration langsamer Führungsgrößen zu Peak, die fälschlicherweise erhöht werden, so dass der Genotyp nicht mehr geschlossen werden kann. Schließlich ist die Anzahl irrelevanter Peaks größer. Für Profile mit mehr als 3 Spitzen, sollte die Spitze mit einer maximalen Fluoreszenz normalerweise nicht mehr als 150 FU.

Genotypisierung von RS-PCR, wie beschrieben wird durch die Tatsache, dass die Investitionen in Maschinen notwendig ist, und die freie Mahal-Software erforderlich ist. In der Tat sind eine Standard-PCR-Maschine und die Bioanalyzers benötigt. Ersteres ist eher billig heutzutage während letztere teurer ist. Die Auflösung der Agarose-basierte Elektrophorese reicht nicht aus, auch wenn hochauflösende Agarose verwendet wird. Unter diesen Bedingungen ist es nur möglich, zwischen GTB, GTC und alle anderen Genotypen zu unterscheiden. Die Kosten für die Elektrophorese der MED-Kit oder Agarose-Elektrophorese unter Verwendung sind jedoch ähnlich. Die MED-Kit zusammen mit dem Bioanalyzer trifft weitere Standard-Agarose-Elektrophorese in einer Weise, dass das letztgenannte Verfahren ist praktisch, gerade nach vorne und erhaltenen Daten ist in elektronischer Form, die erheblich die Lagerung und die weitere Analyse vereinfacht. Prinzipiell alle handelsüblichen bioanalyzers sind für diese Art von Analyse geeignet, vorausgesetzt, daß die electrophoretic Auflösung ist ausreichend und die erhaltene Größe der Bänder ist genau und unparteiisch.

Die Auflösung von RS-PCR für Rinder-Stämme von S. aureus ist hoch. Es ist so gut wie Spa - Typisierung, und besser als MLST und PFGE ^4,14. Zusätzlich, im Vergleich zu allen anderen Typisierungsmethoden üblicherweise für Subtypisierung S. verwendet aureus (Spa - Typisierung, MLST, PFGE), dessen Probendurchsatz ist hoch: DNA - Extraktion ist einfach und schnell, 96 Proben können in einem RCR Lauf ( in der Regel O / N) und Elektrophorese und Genotyp Inferenzabschnitts ist geradlinig weiterverarbeitet werden. Die vollständige Analyse von 96 Proben erfordert eine Nacht für die PCR und eines Tages für die Elektrophorese und Auswertung. Weitere Vorteile der RS-PCR von Fournier et al. ² sind die niedrigen Kosten, insbesondere wenn sie auf MLST verglichen , die sieben Gene erfordert in beiden Richtungen ¹⁵ sequenziert werden. Weiterhin RS-PCR ist die einzige Methode, die Vorhersage Kontagiosität und Pathogenität der Stämme vonS. aureus bei Rindern beteiligt Mastitis ^2,5, Schlüssel Prädiktoren in der klinischen Veterinärmedizin. Schließlich allein RS-PCR ist ausreichend , um die Epidemiologie von Rinder S. zu untersuchen aureus ^3,4,5,14. Die Interpretation der Daten ist gerade nach vorne , auch im internationalen Kontext als nur wenige große Genotypen ^2,3 beobachtet werden. Für epidemiologische Vergleiche zwischen Rinder- und menschlichen Stämme, RS-PCR und Spa - Typisierung zusammen sind vorzuziehen , da die letztere Methode häufig für Subtypisierung menschlichen Stämme verwendet wird , so dass eine Menge von Daten zur Verfügung steht. MLST ist jedoch geeignet , um die Klonalität der Stämme ¹⁵ Bewertung und für phylogenetische Analysen ^4.

Für die Fehlersuche in Bezug auf die PCR-Cycler, MED-Kit und dem Bioanalyzer sind die entsprechenden Handbücher zu konsultieren. Im Falle des RS-PCR-Verfahren vereinfacht wird Fehlerbehebung massiv gegebenenfalls positive und negative PCR-Kontrollen sind incin jedem Lauf luded. Wenn die positive Kontrolle negativ ist, wurde die PCR-Mischung nicht ausreichend zusammengesetzt und / oder die Kontroll-DNA war verschlechtert. Wenn die negative Kontrolle (H ₂ O) erzeugt , eine oder mehrere Banden wurde das PCR - Gemisch mit einigen DNA kontaminiert. In beiden Fällen müssen die Profile nicht interpretiert und RS-PCR hat wiederholt werden. Wenn Auslegung aufgrund eines elektrophoretischen Problems nicht möglich ist, muss die Elektrophorese wiederholt werden, um einen neuen Chip. Die elektrophoretische Probleme werden in der Regel durch eine unzureichende Migration und Ausrichtung eines oder beider Markierungsbänder, die aus ungeeigneter Laden und Manipulieren des Chips aus. Wenn das erhaltene Elektrophorese Profil kann nicht durch die Mahal Software interpretiert werden, die Profildatei von der Bioanalyzer Software erzeugt wird zur weiteren Auswertung an den Autor gesendet. Normalerweise zuviel Templat-DNA wurde für RS-PCR verwendet oder das Profil stellt einen neuen Genotyp oder genotypische Variante.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'