Summary
タンパク質相互作用は、細胞の機能の中心にあります。熱量分光技術は、一般に、それらを特徴付けるために使用されます。ここでは、Shwachman-ダイヤモンド症候群（SBDS）で変異タンパク質と伸長因子様1 GTPアーゼ（EFL1）間の相互作用を研究するためのツールとして蛍光異方性を説明します。
Abstract
タンパク質 - タンパク質相互作用は、生体の機能において重要な役割を果たす。相互作用が同定され、検証された後には、構造的および機構的レベルでそれを特徴付けることが必要です。いくつかの生化学的および生物物理学的方法は、そのような目的のために存在します。中でも、蛍光異方性は、フルオロフォアで標識されたタンパク質の蛍光強度は、タンパク質 - タンパク質相互作用の際に一定のままである場合に特に使用される強力な技術です。この技術では、フルオロフォアで標識されたタンパク質は、選択的に入射ビームとの相対的な向きに応じて蛍光体のサブセットを励起する適切な波長の垂直偏光で励起されます。得られた発光はまた、関係垂直方向と水平方向の面で次のように異方性（r）を定義して方向性があります：私はVVとI R =（I VV -I VH）を /（I VV + 2I VH）、
Introduction
細胞は常に互いに相互作用の生体高分子の多くが含まれています。この関連付けは、シグナル伝達、遺伝子発現、およびとりわけ、細胞遊走の調節におけるそれらの機能を担当する細胞経路に関与する複合体を生じさせます。細胞内で発生するすべてのタンパク質 - タンパク質相互作用は、インタラクトームと呼ばれるネットワークを含みます。 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるそのタンパク質の70％以上は、相互作用パートナー1を有することが示されています。セルとその機能のインタラクトームを理解することは、生物の複雑さと多様性に関連する情報を提供しています。いくつかの方法は、タンパク質 - タンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために記載されています。このような酵母ツーハイブリッド2、タンパク質断片相補アッセイ3、質量分析およびタンパク質microarraに結合されたアフィニティー精製4として置く方法による高異なりますYSは対話5,6を識別するために使用されます。識別されると、それを検証するために必要であり、これはケースバイケースで変動し得ます。典型的には、これらの実験は、タンパク質の一つの遺伝子の欠失または過剰発現により、例えば 、相互作用ペアの個々のメンバーのレベルの相互作用自体を破壊し、その後で他のメンバーの性質又は機能の変化を探し含みます細胞レベル。その後、生物物理学的技術7は、分子レベルでのタンパク質-タンパク質相互作用を特徴付けるために使用されます。熱量測定及び蛍光分光法を定量的及び機械的にそれらを記述するために使用されるこの目的のために、タンパク質複合体の構造は、X線結晶学、核磁気共鳴及び低温電子顕微鏡によって決定されます。
本研究では、蛍光異方性は、GTPアーゼEFL1とSBDとの間の相互作用を特徴づけるための手法として使用しましたSタンパク質。これらのタンパク質は、60Sリボソームサブユニット8の表面から真核生物の開始因子6のリリースを促進することによってリボソームの合成に参加しています。 SBDSタンパク質はShwachmanダイヤモンド症候群9として知られている疾患で変異し、EFL1がグアノシン二リン酸10,11との親和性を減少させるためのグアニンヌクレオチド交換因子として作用します。 SBDSにおける疾患変異はEFL1との相互作用を廃止し、したがって、その活性化を防ぎます。
蛍光異方性は、一般的に、タンパク質 - ペプチド又はタンパク質 - 核酸相互作用を研究するために、生物学的用途で使用されます。これは、フルオロフォアは、部分的に偏光放射の偏光の結果で励起という原理に基づいています。蛍光異方性は、式1で定義されています。
I VVと私VHがある場所サンプルが垂直偏光12で励起されたときに、水平垂直（VV）及び（VH）の蛍光強度は、放射を偏光。蛍光異方性は、フルオロフォアの回転拡散の速度に影響を与える要因に敏感であり、したがって、温度、溶液の粘度およびフルオロフォアのみかけの分子サイズに依存します。それは他のタンパク質とそのような変化と相互作用するとき、フルオロフォア増加を含むタンパク質の見かけの大きさは、その後、異方性の変化として評価することができます。具体的には、その蛍光寿命を解決に相対ゆっくりと回転するフルオロフォアは、大きなI VV値と小さなI VHの値を持つことになりますので、比較的大きな異方性を示すであろう。急速に蛍光寿命を基準に転落蛍光団のために、私VVと私VHは同様であろうとその異方性値が小さい12になります図1）。また、ノイズ測定に優れた異方性信号のために、目的の分子の回転相関時間と同様の蛍光寿命を有する蛍光団を有することが必要です。そうでなければ、正確に遊離タンパク質との複合体中のそれとの間の異方性の差を記録することは不可能です。例えば、100ダの低分子量化合物に結合し、フルオレセインやローダミンなどの4ナノ秒に近い寿命を持つ蛍光プローブの異方性が0.05です。 160キロダルトンの分子に結合すると、0.29にその異方性値が増加します。正確に測定することができる差。これとは対照的に、その増加分子の大きさで変化する65〜1000キロダルトンへの結合反応に関与し、同じ蛍光プローブは正確に測定するには小さすぎるです0.3から0.28の異方性の変化、になります。このシナリオでは、400ナノ秒の寿命を有するプローブは、12より適切であろう。
蛍光異方性と手続きを測定するために使用される装置の1概略図。蛍光異方性を測定し、タンパク質-タンパク質相互作用の実験を行うために用いられる装置の概略図。相互作用パートナーに結合すると増加し、高速表示、小さな異方性をタンブルフルオロフォア。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蛍光用途が研究分子のいずれかでフルオロフォアの存在を必要とします。フルオロフォアの三種類があるタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために：1）タンパク質中に存在するトリプトファン残基、2）、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのderivaように化学的に結合フルオロフォアおよび3）、蛍光融合パートナーティブ。ほとんどのタンパク質は、その構造上のトリプトファン残基を有し、従って、相互作用を測定する最も簡単な方法は、対応する蛍光スペクトルの変化を監視することにより、またはトリプトファン残基の蛍光強度の変化を監視することによってです。しかし、トリプトファン残基の分析を複雑に両方のタンパク質中に存在してもよいです。フルオロフォアによる相互作用、その蛍光特性を変化する一方、または結合部位の近くに位置する必要があり、それが相互作用自体を妨害する可能性があります。 GFPなどのかさばるフルオロフォアを使用する場合に特別な注意が必要です。これらの蛍光体のいずれもが結合研究のために使用できない場合には、その後、関連するタンパク質の一つに外因性蛍光団を導入することが必要です。多くの化学的に合成されたフルオロフォアが存在し、共有結合、アミン基（リジンまたはN末端の側鎖）およびシステイン中のチオール基のようなそれらの反応基を介してタンパク質に結合させることができます。 Fヨードアセトアミドおよびマレイミドは、チオール反応性基13でありながら、イソチオシアネートおよびスクシンイミジルエステルとluorophore誘導体は、アミド基と反応します。蛍光用途で使用される最も一般的な色素は、フルオレセインの誘導体およびローダミングリーン色素、クマリン、BODIPYフルオロフォアおよびアレクサフルオロ色素です。市販のフルオロフォアおよびその使用の詳細なリストは、参考文献14,15に記載されています。成功した標識のために、反応性基は、タンパク質の表面に露出する必要がありますが、原因のポリペプチドに典型的に存在する反応性官能基の数が多いため、部位特異的修飾を得ることは非常に困難です。本研究における目的のタンパク質は、SBDS、複数のサイトの標識をもたらすことができる5遊離システインと33のリジンが含まれています。不均一な標識は、結合に影響を与えることができ、異なるフルオロフォア分子が結合時に異なる蛍光強度信号を引き出すことができるようにデータ解析を複雑にします。 OVEするにはこの問題をrcome、我々はサイトの直接ラベルに、SBDSタンパク質を4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセインをフラッシュフルオロフォアを使用していました。これは、フラッシュタグは、Xは、システイン16,17以外の任意のアミノ酸である配列CCXXCCからなるとしても知らモチーフの4つの離間したシステインに対して高い親和性を有するarsenoxide色素です。このテトラシステインモチーフは、タンパク質の全体的な折り畳みの破壊を防止するために一緒に適切なリンカーとN末端または遺伝子工学によるタンパク質のC末端に付加されています。フラッシュ染料とフラッシュタグのペアは、もともと生細胞17に、サイト固有のラベルタンパク質に設計されていたが、それはここで例示されているとして、また、 インビトロで精製されたタンパク質を標識するために使用することができます。また、酵素の戦略はまた、タンパク質18の部位特異的官能化を可能にするために開発されてきました。
本稿では、我々は、蛍光異方性aの有用性を説明しますタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのSAツール。定量的情報は、実験データのフィットから得られることができるが、結合は、結合曲線の形状の単純な検査によって評価することができます。
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Protocol
1. SBDS-FLASHタグタンパク質の発現および精製
注：異方性実験のために、フラッシュタグのCysが-のCys-Proの-Glyを-のCys-CysををPCRによってコード配列人間SBDSのC末端に付加された配列に対応します。この構築物は、発現ベクターをpRSET-Aにサブクローニングし、N末端ヘキサヒスチジンタグ（Hisタグ）をコードするタンパク質を発現する大腸菌 C41細胞に形質転換した、配列およびC末端フラッシュタグ10を符号化ヒトSBDS。
- SBDSフラッシュタンパク質発現
- コンピテントE.トランスフォーム標準的な熱ショックプロトコル19を用いてプラスミドをpRSET-HisSBDS-Flashで大腸菌 C41細胞。プレートを100μg/ mlアンピシリンを補足した固体ルリア - ベルターニ（LB）培地中の細胞。 LB固体培地組成物10、G 1 Lボリューム用のNaCl、5gの酵母エキス、10gのトリプトン、および20gの寒天から成ります。
- 37℃で培養形質転換された細菌まで600nmの（600）での吸光度を、100μg/ mlのアンピシリンを添加したLB液体培地1リットル中に0.5から0.7に達します。
- 培養液に0.5 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを添加することにより、タンパク質発現を誘導し、さらに5時間のインキュベーションを続けます。
- 4℃で10分間、3800×gで遠心分離することによって細菌懸濁液を収集します。上清を取り除きます。この時点で、-20℃で細胞ペレットを保存するいずれか、またはタンパク質精製のためにすぐに使用しています。
- SBDSフラッシュタンパク質精製
注：すべてのクロマトグラフィー工程は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システムまたは蠕動ポンプを使用して実行されます。 Ni 2+ -アフィニティークロマトグラフィーは、5ミリリットルFast Flowカラムを使用しています。アニオン交換クロマトグラフィーは、5ミリリットル強いスルホプロピル陽イオン交換カラムを使用しています。 3 mlと流量/分のすべてのクロマトグラフィー工程に使用しました。- SBDS溶解Bの35ミリリットル中に細胞を再懸濁uffer 4分OFF 10秒オン、30秒のサイクルを用いて合計時間の超音波処理によって、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）および溶解を補充した（50 mMリン酸緩衝液pH 7.5、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール）、4時°C。
- 4℃で50分間、9000×gでサンプルを遠心。
- 上清を保持し、細胞破片を除去するために、ペレットを捨てます。
- SBDS溶解緩衝液の3カラム容量（CV）のNi 2+アフィニティーカラムを平衡化し、カラムに上清を明らかに全体をご紹介します。
- SBDS溶解緩衝液の3 CVで洗浄して未結合タンパク質を除去し、SBDS溶出バッファーの3 CV（50 mMリン酸緩衝液pH 7.5、300mMのNaCl、250mMのイミダゾール）で溶出します。
- 50 mMリン酸緩衝液pH 6.5で溶出したタンパク質を6倍に希釈し、0.22μmのセルロース膜を通して濾過することによって可能な凝集体を除去。
- 低塩S列の3 CVとスルホプロピル陽イオン交換カラムを平衡化バッファー（50 mMリン酸緩衝液pH 6.5、50mMのNaCl）と、前のステップからのタンパク質サンプルを紹介します。
- 洗浄結合していない低塩Sカラムバッファーの3 CVを有する材料及び50mMリン酸緩衝液pH 6.5、1 M NaClで一段階でタンパク質を溶出させます。
- 50mMリン酸緩衝液pH 6.5で溶出した蛋白質3.3倍に希釈します。 15分間、3800×gで遠心分離することによって限外濾過装置を有するタンパク質を濃縮します。フラッシュは、液体窒素中でタンパク質を凍結し、さらに使用するまで-80℃で保管します。
- SDS-PAGE分析およびクマシー染色20によってタンパク質の純度を確認してください。
2. EFL1タンパク質の発現および精製
注：EFL1は、ベクターpRS426でギャル1/10発散プロモーター21およびサッカロマイセス・セレビシエMAT A 3'UTRの制御下で発現させました。組換えタンパク質は、タバコエッチウイルスプロテアーゼに融合したヒトEFL1アイソフォーム1（エンコードTEV）認識部位およびC末端にヘキサヒスチジンタグ。
- EFL1タンパク質発現
- S.トランスフォーム標準的な酢酸リチウムプロトコル22を用いてプラスミドpRS426-EFL1TevHisとセレビシエ BCY123細胞。プレートウラシルを含まない培地て合成ドロップ内のすべての形質転換された細胞（SD-URA）が、2％（w / v）のグルコースを補充しました。 SD-URA培地の組成、8グラムの酵母窒素塩基アミノ酸なしで11グラムのカザミノ酸、55mgのアデニン硫酸塩、55mgのチロシン、60mgのロイシンと1 Lボリュームの60mgのトリプトファンから成ります。
- 600 0.5％（w / v）のグルコースを補充したSD-URA培地の1.8 1 Lに達するまで培養物を30℃で酵母を形質転換しました。
- 培養し、ガラクトース（w / v）の2.8％を添加することによってタンパク質の発現を誘導し、30℃でさらに18時間インキュベーションを続けます。
- 4℃で10分間、3800×gで遠心分離することによって酵母懸濁液を収集します。上清を取り除きます。この時点で、-20℃で細胞ペレットを保存するいずれか、またはタンパク質精製のためにすぐに使用しています。
- EFL1タンパク質精製
注：すべてのクロマトグラフィーステップはFPLCシステムまたは蠕動ポンプを使用して実行されます。 Ni 2+ -アフィニティークロマトグラフィー/分3ミリリットルの流量で5ミリリットルFast Flowカラムを使用しています。サイズ排除クロマトグラフィーを125 mLのカラムを1ml /分の流速でのSuperdex 200樹脂で予め充填を使用します。- 1mMのPMSFおよび1mMベンズアミジンを補充EFL1溶解緩衝液（50mMのトリス-HCl pHが8、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール、5mMのMgCl 2、10％グリセロール）50mlに細胞を再懸濁によって細胞を破壊4℃で、ON 2分および15分OFFのサイクルを使用して6分の合計時間を、ガラスビーズ（φ= 0.5 mm）を使用して、ビーズビーターの摩擦。
- 4℃で50分間、9000×gでサンプルを遠心。
- 上清を保持し、細胞破片を除去するために、ペレットを捨てます。 EFL1溶解緩衝液の3 CVでのNi 2+アフィニティーカラムを平衡化し、カラムにすべて明らかにした上清を紹介。
- EFL1溶解緩衝液の3 CVで洗浄することにより未結合タンパク質を除去し、3 EFL1溶出バッファーのCV（50 mMトリス-塩酸pHが8、300mMのNaCl、250mMイミダゾール、5mMのMgCl 2、10％グリセロール）で溶出します。
- 異方性緩衝液（50mMのTris-HCl pH7.5で、300mMのNaCl、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、5mMのβメルカプトエタノール）1.5 CVを有するサイズ排除カラムを平衡化します。
- 所望の体積に3800×gで遠心分離することによって限外濾過装置のNi 2+アフィニティーカラムから溶出された1ミリリットルEFL1タンパク質に集中します。サイズ排除カラム上のサンプルをご紹介します。
- 溶出したタンパク質を収集し、約30μMの最終濃度に限外濾過によって濃縮します。 Flashは、さらに使用するまで-80℃で液体窒素とストア内のタンパク質を凍結します。目を確認してくださいSDS-PAGE分析およびクマシー染色20によるタンパク質の電子純度。
FlAsH蛍光色素4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセインでSBDSフラッシュの3ラベリング
- 異方性バッファー5μlの容量で4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセイン色素の3ナノモルでSBDSフラッシュタンパク質の3ナノモルを混ぜます。
- 反応は4℃で8時間進行してみましょう。遊離色素を除去するために一晩異方性バッファーに対してサンプルを透析。
- 標識タンパク質の％を定量化するためにランベルト・ベールの法則を使用してください。 280 nmおよび適切な量の石英キュベットを使用して分光光度計で508 nmの吸光度を測定します。注：以下のモル吸光係数（M -1センチ-1）考えてみましょう：
- 式2を用いて標識SBDSフラッシュタンパク質の濃度を計算します。
- 前のステップから計算されたC SBDS-FLASHを代入して式（3）を用いて全SBDSタンパク質の濃度を計算します。
- 式4を用いて、標識されたタンパク質の割合を計算します。
4.蛍光異方性実験
注：異方性実験は、分極ツールボックスとデータ収集は、機器のソフトウェアに設けられた異方性のプログラムを用いて行った装備分光蛍光光度計で行いました。励起波長は、8ナノメートルのスペクトル帯域幅と494 nmに設定し、発光を530±25nmのバンドパスフィルタを用いて記録しました。測定は、5mmの経路長10を有する200μlのキュベット中、25℃で行いました。
- 蛍光キュベットでは、異方性バッファに30 nMのSBDS-FLASHの200μLを配置し、30μMEFL1の2μLを滴定します。完全に混合し、反応が異方性値を測定する前に、3分間放置しました。
- EFL140μlの総容量になるまで繰り返しステップ4.1が追加されました。
5.データ解析
- 非線形最小二乗回帰アルゴリズムを用いて、適切な結合モデルにデータをフィット。最も一般的な結合モデルの式は、表1に示されています。
- フィット23の残差を検査することにより、タンパク質間の相互作用を説明する最良のモデルを評価します。追加の実験で選択されたモデルをサポートしています。
表1.一般的なタンパク質間相互作用の結合モデルとそれらを記述する数式。0 / 54640table1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
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Representative Results
種の混合物の観察された異方性は式（5）で表されるので、任意の異方性の実験を行うためには、フルオロフォアの蛍光強度の大きな変化を排除することが重要です。
F iは 、各コンポーネントとrの端数蛍光を表し、ここで、iは、対応する異方性です。各成分の分別蛍光は、両方に依存する式6によって定義され、その濃度と相対蛍光。
X iは番目のモル分率を表し、E I種とØi 番目 の種i 番目の量子収率です。
蛍光強度は、滴定に沿って大幅に変化した場合従って、なく、異方性信号の蛍光シグナルの変化の関数としての複合体形成を測定する、または蛍光強度と異方性の両方を嵌合することにより観察された異方性の値を修正するか優れていますデータ。 SBDS-FLASHの蛍光は、蛍光異方性を示唆EFL1への結合の際に顕著な変化（ 図2）は、二つのタンパク質間の結合を測定するために十分であるしません。
EFL1の増加する濃度の滴定の際にSBDS-FLASHの図2.蛍光発光。フルオロフォアの蛍光発光の変化はnegligiblありますeおよび滴定に沿ってランダム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SBDSフラッシュにEFL1の滴定から得られた結合曲線蛍光異方性の例が図3に示されている。定性的には、グラフの形状が明確に添加する際異方性シグナルの増加によって証明されるように、2つのタンパク質が相互作用することを示しEFL1。また、異方性の値は、滴定の最後にすべてSBDS-FLASHタンパク質がEFL1との複合体中に存在していたことを示唆してプラトーに達しました。これは、定量的に、これらのタンパク質間の相互作用を説明すると推定される結合モデルに非線形最小二乗回帰を使用してデータを適合し、対応する解離平衡定数を得ること、が可能です。 1結合部位モデルへのフィッティングはappropriませんでしたately実験データ（ 図3A）を記述。これは、結合曲線でフィッティングトレースからもかなりのとランダムであるフィット（理論と実験データとの間の差）の残差の偏差からだけではなく明らかです。これは、単一結合部位モデルを図3に示す実験データで観察されるように双曲線ではなくS字曲線によって数学的に記述されていることとよく一致している。例えば、同一または2つの異なる結合を二つの一方、モデルサイトでは、実験データとフィットショーの残差2サイトの関連モデル（ 図3B-C）をサポートなし体系的偏差をよりよく説明します。他の実験情報が存在しない場合にEFL1とSBDS間の結合機構に対応する2つのモデルのどの確立することは困難です。それにもかかわらず、SBDSとEFL1は、両方の単量体タンパク質であるので、difficですULTは、2つの同一の結合部位のモデルを想定します。
EFL1とSBDS-FLASHの間の相互作用の等温線を結合図3.蛍光異方性の上部プロットのそれぞれにおいて、実線は異なる結合モデルへのデータのフィットに対応しています。（A）単一のサイト、（B）は、2つの同一のサイト及び（C）は、2つの非同一部位。下側のプロットは、対応するモデルに適合の残差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
タンパク質のほとんどの生化学的実験に関係なく使用される技術の、純粋なタンパク質だけでなく、それらの大量ではないだけを必要とします。それは、ここで提示する場合であったように、この理由のために、実験のこのタイプのために使用されるタンパク質は、異種発現によって得られます。蛍光分光法が研究され、分子内にフルオロフォアの存在を必要とします。芳香族残基は、それらがほとんどのタンパク質に一般的であり、両方とも、受容体タンパク質およびリガンド中に存在するので、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために、それらの信号を使用して分析を複雑に、タンパク質の固有の蛍光団を構成しています。さらに、トリプトファンの寿命は蛍光異方性実験のためには短すぎます。このため、研究したタンパク質のいずれかに外因性のフルオロフォアを添加することが一般的です。この目的のために、フルオロフォア、色素4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）fとの配位結合を介しSBDSのC末端に付加しました。遺伝子工学によるタンパク質に導入されたテトラモチーフにしたluorescein。蛍光団をむくタンパク質を選択すると、ランダムな問題ではありません。原因ここで研究タンパク質のサイズ（SBDS 29キロダルトンとEFL1 127キロダルトン）のために、我々は、遊離の標識-EFL1の間とすることを期待される変化に比べて、遊離の標識-SBDSとEFL1との複合体中のそれとの間の異方性が大きく変化を期待しましたSBDSに結合しました。このことを念頭にベアリング、フラッシュタグはSBDSにではなくEFL1に紹介されました。蛍光異方性実験を設定する際に考慮すべき重要な別のパラメータは、使用する溶液の吸収です。キュベット内の溶液の光学密度は、励起および発光波長で0.1以下である必要があり、全体の滴定に沿って一定のままであるべきです。それ以外の場合は、内部フィルター効果は測定に干渉することができるして補正する必要があります。ここで紹介する実験では、研究されたタンパク質はexcitatの波長で吸収しませんイオン又は4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセイン色素の放出。このように内部フィルター効果が問題となりません。
データ収集に関して、続いて適切にデータを適合するためには、結合曲線に沿って推移を通じて複数のデータ点を有する明確に定義された下部及び上部のベースラインが必要です。それ以外の場合は、データのフィッティングは不正確であり、結合様式に関する情報が失われることがあります。遊離リガンドの濃度は、解離定数以下と上記の二つの対数単位だけ異なることが必要であるまともな結合曲線を記述するために、しかし、実験的にこれを達成することは困難であり得ます。タンパク質間の親和性が非常に高い場合に高い濃度が原因で、リガンドの溶解性の問題には達成できないかもしれないが、下限では、機器の感度の問題は、特に発生することができます。 SBDS間の相互作用をテストするときにこれは明らかに例示したがS143L疾患変異体とEFL1。この変異体は、EFL1はわずか70μMまで濃縮することができるとタンパク質が滴定10時の5倍≈希釈されますので、適切な結合曲線を得ることができなかった程度にEFL1への結合を破壊しました。したがって、滴定スキームを最適化し、より少ない正確なフィット感を引き起こすその位置で発生しないリガンド濃度にジャンプすることを確認するために、親和性の概算を有することが必要です。例えば、 図3に示す結合曲線の最初のポイントを逃すと、それは単一結合部位モデルに向けた研究者を誤解双曲線のように見えるようになります。
収集されると、データは、推定される結合モデルに適合させました。蛍光データと比較して、異方性のデータは、さらに操作することなく使用することができ、希釈効果のために補正を必要としません。 表1に示す式は[L]≈と考え滴定のあらゆる点で[L] 0。タンパク質間の親和性が滴定リガンド枯渇の最初のポイントでは起こるような非常に高い場合に発生しないことがあります。このシナリオでは、他の場所23に記載のより複雑な二次方程式は、データを適合するために必要とされます。ここで説明する実験では、リガンドEFL1を無視することができるSBDSフラッシュの濃度及び滴定の各点でEFL1濃度の変化に比べて大過剰常にありました。結果のセクションで説明したように、2つの非同一の結合部位モデルは、最高の実験データ（ 図3C）に記載しました。グループで得られた付加的な生化学的情報は、これがEFL1とSBDSとの間の相互作用を記述するための適切なモデルであるという考えをサポートする（データは示さず）。相互作用のこのモードは、EFL1とSBDSとして、マルチドメインタンパク質において一般的であり、そしていくつかの例は、文献24-26に存在します。しかしながら、それは重要なLSOそのリガンドに対して異なる親和性を持つ別個の結合部位の相互作用モデルとして表示することができ、非特異的な相互作用を排除します。このため、スキャッチャードプロットは非常に便利です。他の技術に比べて、蛍光異方性シグナルは形成された複合体の量を報告し、したがって、データにスキャッチャードプロットを構築することが可能です。凹部スキャッチャードプロットは、正の協同性またはリガンドの不安定性（ 図4）を持つ2つの異なる結合部位モデルを暗示しながら凸スキャッチャード曲線は、負の協同性または非特異的な結合を持つ2つの異なる結合部位のモデルを示唆する。実験データの分析はEFL1とSBDS（ 図4D）のための2つの独立した結合部位のモデルを支持する凹形状とスキャッチャードプロットを示しました。さらに、正の協同性は1.8±0.02のヒル係数値が得られたヒルの分析を実行した後に確認された（データは示さず）。
異なるタンパク質-タンパク質結合モデル図4.スキャッチャードプロット。（A）単結合部位または相互作用しない複数の同一のサイト。 （B）負の協同または非特異的な結合を持つ複数の異なる結合部位。 （C）正の協同またはリガンドの不安定性を持つ複数の異なる結合部位。 （D）SBDS-FLASHにEFL1の滴定から得られた実験異方性データの分析から得られたスキャッチャードプロットは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蛍光異方性は、試験した条件で溶液中に残存するために研究分子を必要とするソリューションベースの、真の平衡技術です。ないに研究するために使用することができます全長タンパク質間の相互作用だけでなく、翻訳後修飾を有するタンパク質ドメイン、変異タンパク質あるいはペプチドの間の相互作用光年。また、蛍光異方性、蛍光感受性膜プローブを使用して脂質膜へのタンパク質の結合を測定するために使用することができます。このアプローチは、正常αシヌクレインは、 パッキン27シナプス小胞に有することの効果を研究するために使用されてきました。蛍光異方性の主な利点の一つは、それが真の解離定数は、機構的情報とともに取得することができるように研究分子の結合に関する定量的情報を提供することです。他の生物物理学的技術は、このような情報を得るために使用することができるが、蛍光異方性は、試料の少量を必要とし、ここに提示され、唯一の平衡でない行うことができるだけでなく、関連性を得るために、例えばストップフロー蛍光などの迅速な反応速度を、使用しますおよび解離速度定数（それぞれ、 オン kおよびk offは ）28。他の生物物理学的手法に対する蛍光異方性の利点と欠点との比較表を表2に提示されている。それらのどれもが、遊離及び結合画分の機械的分離のプロセスが含まれていないため、記載されている全ての方法は、真の平衡技術です。結果のセクションで述べたように標識されたタンパク質の蛍光強度が大きく相互作用によって変更された場合、このプロパティは、次に、結合の親和性を定量するために使用することができます。しかし、相互作用から生じる蛍光強度の変化は、分子間相互作用自体の外因性蛍光体の干渉の可能性を示唆しています。すなわち、対応する非標識タンパク質の解離定数（K d）値の可能な変化。このように、蛍光異方性はCH未満侵襲的技術と考えることができます蛍光強度は、相互作用の際に変化しない場合、前者が適用されるべきであるので、蛍光強度のアンジェ。多量のタンパク質が必要としているが、それはラベルフリーの方法であるので、この意味では、等温滴定熱量測定（ITC）は、分子間相互作用の真のK d値を提供することができます。熱の違いのみ複合体の量が29形成過程のエンタルピーに報告していないため、一方で、機構的情報が得られません。
比較では、このような酵母ツーハイブリッドまたはフラグメント相補性アッセイは、精製されたタンパク質を必要としませんが、彼らは唯一の結合様式に半定量的情報を提供するなどのインビボ法インチ酵母ツーハイブリッド技術で結合使ってミラーユニットの強さを表現することが可能であるという事実にもかかわらず、これが本当の平衡定数ではなく、研究者の制御のうち、多くの要因がそれを変更することができます。
タンパク質-タンパク質相互作用を研究するために使用される一般的に使用される生物物理学的手法の表2長所と短所。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | Ultra pure |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| dye 4’,5’-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein | ThermoFischer Scientific | LC6090 | This kit contains the dye to label a FlAsH tag |
| Ampiciline | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Formedium | GLU03 | |
| D(+)-Galactose | Formedium | GAL03 | |
| L-Leucine | Formedium | DOC0157 | |
| L-Tryptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Phenylmethylsulfonyl fluoride |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Sodium Chloride |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Magnesium Chloride |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Potassium phosphate dibasic |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Sodium phosphate monobasic |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Yeast extract | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acids | Formedium | CAS03 | |
| Tryptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Filtration units | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Membrane Filter | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22 µm, 47 mm, white, plain |
| Ni2+ affinity column | QIAGEN | 30760 | Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow |
| Strong Sulfopropyl cation exchanger column | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Size Exclusion column | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Fluorescence cell | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spectrophotometer | Agilent Technologies | G6860AA | Cary 60 UV-Vis |
| Shaker | ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15° to 60°C |
| Centrifuge | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Discontinued | FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction |
| Spectrofluorometer | Olis | No applicable | Olis DM 45 with Polarization Toolbox |
References
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