Summary
Vi rapporterer en protokoll med fluorescens-aktivert celle sortering å isolere plasmacytoid dendrittiske celler (PDC) med høy renhet fra benmargen av lupus utsatt mus for funksjonelle studier av PDC.
Protocol
MERK: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) lupus utsatt mus ble avlet og vedlikeholdes på en bestemt patogen fritt anlegg følger kravene i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Virginia Tech (Animal Welfare Assurance-nummer: A3208-01). Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Alle dyreforsøk ble utført under IACUC protokollen # 12-062.
1. cellekulturmedium og sortering Buffer
- Fremstille fullstendig cellekulturmedium (C10) under anvendelse av RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 1% 100 MEM ikke-essensielle aminosyrer, 10 mM HEPES, 55 mM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin-streptomycin.
- Forbered sortering buffer (HBSS-fullstendig) ved å bruke 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) supplementert med 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml bovint serumalbumin,0,05 mM MgCl2 og 0,2 E / ml DNase I.
2. Mouse Dissection
- Forbered to diameter retter 6 cm som inneholder 4 ml C10. Plasser oppvasken på is.
- Avlive musen ved CO 2 innånding.
- Høste milten og holde den i en skål med C10 på is.
- Pin musen ned med buken vendt opp på disseksjon plate. Steril legemet ved sprøyting av 70% etanol.
- Kutt i huden og skille huden fra muskelen veggen under langs ventrale midtlinjen fra symfyseprovokasjonstester til halsen.
- Skjær huden langs hind lem fra første snitt til ankelen.
- Pin huden tilbake på sidene og kutte muskel veggen langs sidene fra den første snittet sted å membran.
- Pin muskel veggen tilbake på høyre side av hodet.
- Lokal milten på høyre side av musen under tynntarmen og ved siden av magen. Plukk opp den ene enden av the milt og skille det fra magen.
- Kutt begge bakbena ut, inkludert femur og tibia, og fjerne alle musklene så mye som mulig.
- Skjær musklene langs hind lem fra bekken / hofteleddet til ankelen med en skarp saks, prøver å unngå blodårer.
- Skill bakben ut ved å kutte på bekken / hofte og ankel / fot leddet uten eksponering av benmarg innholdet.
- Rengjør øvrige musklene på beina ved å skrape med et barberblad gjentatte ganger og kutte musklene på fellespunkter.
- Hold beina i en 6 cm tallerken inneholder 4 ml C10 på is. Fortsett å dissekere neste musen.
3. splenocytt Isolation
- Homogen milten forsiktig med en sprøytestempelet mot en 70-mikrometer celle sil på toppen av fatet som inneholder 4 ml C10 inntil ingen røde stykker er synlige.
- Legg til ekstra 6 ml C10 i formen gjennom silen ennd deretter overføre den totale 10 ml cellesuspensjon til et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger konisk rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
- Etter sentrifugering Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 2 ml 1 x røde blodceller (RBC) lyseringsbuffer. Inkuber ved RT i 5 min.
- Etter inkubasjon sentrifuger konisk rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
- Etter sentrifugering Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 1 ml C10. Kast noen store klumper (døde celler) og holde røret på is for senere.
MERK: Hvis det er mange små klumper, kan du bruke en 70-mikrometer celle sil for å filtrere cellesuspensjonen en gang. - Telle celle nummer med trypanblått hjelp av en automatisert celleteller.
4. Bone Marrow Cell Isolation
- Overfør ben med 4 ml C10 inn i en morter og tilsett 6 ml C10 for å lage et volum på 10 ml C10 totalt.
- Knekke bein forsiktig i mørtelen ved hjelp av apEstle.
- Rør forsiktig med støter for å frigjøre benmargen til C10.
- Overfør 10 ml C10 inneholdende benmargen i et 50 ml konisk rør på is gjennom en 70-mikrometer celle sil. Tilsett 10 ml frisk C10 inn i mørtelen som fremdeles inneholder bein.
MERK: Pipetter løsningen inneholder benmarg opp og ned flere ganger før du går gjennom silen hvis røde klumper er synlige. - Gjenta trinn 04.02 til 04.04 to ganger. Etter den siste vaskingen, skal benene synes hvitt.
- Sentrifuger 50 ml konisk rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C. I mellomtiden fremstille 5 ml klar-til-bruk tetthetsgradient medium i et 15 ml konisk sentrifugerør ved RT.
- Etter sentrifugering Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 10 ml C10.
- Sakte lag på 10 ml cellesuspensjon på toppen av 5 ml densitetsgradient medium, opprettholde klar grenseflate mellom de to fasene. Sentrifuger deretter den 15 ml koniske rør ved 1363 g i 30 minutter vedRT (20 ° C) med akselerasjon sett som 9 og retardasjon satt som 0 (eller bremse OFF).
- Etter sentrifugering fjernes de øverste 8 ml oppløsning forsiktig og samle opp 2 ml buffy coat ved grenseflaten (et lag av mononukleære celler) inn i en ny 15 ml konisk rør.
- Tilsett 12 ml iskald C10 til 15 ml konisk rør inneholdende benmarg mononukleære celler, hetten og invertere flere ganger for å blande godt, og deretter sentrifuger røret ved 800 xg i 10 min, 4 ° C.
5. Cell Surface Farging for FACS
- Eksempel farging
- Fremstille anti-mus CD16 / 32 antistoffoppløsning (1 til 100 fortynning i HBSS fulle, 5 pg / ml sluttkonsentrasjon).
- Etter sentrifugering i trinn 4,10, Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 100 ul anti-mus CD16 / 32 antistoffoppløsning for å blokkere Fc-reseptor på de mononukleære celler. Inkuber på is i 10 min.
- Forbered fluorescens antistoff blanding (mauri-mus CD11c-PE 01:40 fortynning, anti-mus CD11b-APC-CY7 1:80 fortynning, anti-mus PDCA-en-FITC 1:40 fortynning og anti-mus B220-V500 1:40 fortynning i HBSS- full som anbefales av produsenten 100 ul endelig volum per prøve).
MERK: Det er viktig å titrere antistoffer før bruk. - Etter 10 minutters inkubering i trinn 5.1.2, tilsett 4 ml iskald HBSS fulle og sentrifuger ved 800 xg i 5 min, 4 ° C for å fjerne ubundet anti-mus CD16 / 32.
- Etter sentrifugering Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 100 ul fluorescens-konjugert antistoff blanding. Inkuber på is i 15 min i mørket.
- Etter 15 minutters inkubering, tilsett 4 ml iskald HBSS fulle og sentrifuger ved 800 xg i 5 min, 4 ° C for å fjerne ubundne fluorescens-konjugert antistoff.
- Forbered FACS lasteløsning (500 ng / ml DAPI i HBSS-full).
- Etter sentrifugering i punkt 5.1.6, Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 500 μ; L FACS lasting løsning. Overfør cellesuspensjonen til en 12 x 75 mm rundbunnet rør (FACS rør) og holde røret på is i mørke inntil sorterings løpet av 1 time.
- Farging om erstatning
- Etikett 6 FACS rør som PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI eller unstained. Delmengde splenocytes på 1 x 10 6 celler / tube inn i FACS rør, og vask med 4 ml HBSS fulle ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
MERK: Bruk DNA-bindende fluorescens fargestoff, DAPI, å skille levende celler fra døde celler. DAPI kan passere gjennom plasmamembranen av døde celler (men ikke av levende celler) og bind kromosom DNA. - Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 100 ul HBSS-full.
- I hvert tilsvarende FACS rør, legger en av de følgende antistoffer: anti-mus CD19-PE 1:40 fortynning, anti-mus CD11b-APC-CY7 1:80 fortynning, anti-mus pdca-1-FITC 1:40 fortynning eller anti-mus B220-V500 1:40 fortynning som anbefalt av manufacturer. La den 5. (DAPI) og 6. (uten flekker) FACS rør som de er. Bland godt ved å riste og inkuber alle FACS rør på isen i mørket i 15 min.
- Etter inkubering, tilsett 4 ml iskald HBSS-fullstendig inn i hvert rør og sentrifuger FACS rørene ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
- Etter sentrifugering Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 500 mL iskald HBSS-fullstendig med unntak av pellet i røret merket med DAPI, som blir resuspendert i 500 ul FACS lasting løsning. Holde alle 6 rørene på is i mørket før sortering.
- Etikett 6 FACS rør som PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI eller unstained. Delmengde splenocytes på 1 x 10 6 celler / tube inn i FACS rør, og vask med 4 ml HBSS fulle ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
6. Sortering på Cell Sortering
MERK: Drift av sortering prosedyre på cytometeret og programvaren er standardisert med en detaljert instruksjon gitt av selskapet. Kort fortalt bruker vi 100 micron dyse ved 20 psi, satt målcellen konsentrasjon mellom 5-10 millioner per ml, og justere effektiviteten til 70% eller høyere (dvs. konflikter holdes under 30%).
- Forbered samling FACS rør med 500 mL FBS / rør som inneholder 100 U / ml penicillin-streptomycin.
- Juster kompensasjon parametere i cellesorterer ved bruk av enkelt-flekk kompensasjon rør fra trinn 5.2.
- Spill 10.000 celler i unstained tube å sette negativ gate for hver fluorescerende intensitet.
- Spill 10.000 celler i andre single-flekken kompensasjon rør for å sette positive gate for hver fluorescerende intensitet.
MERK: Programvaren beregner automatisk kompensasjon parametere.
- Bruk én prøve fra trinn 5.1 for å sette porter sorterte cellepopulasjoner ved opptak 3000 celler. Ved hjelp av fluorescerende intensitet som parametre for X- og Y-aksen graf, gate målcellepopulasjon manuelt som en gruppe av punkter tilsynelatende atskilt fra andre punkter.
MERK: Dette gating sett er fleksibel og vilkårlig basert på kravene til forskere. Dersom forskerne forventer høyere renhet basert på en eller flere markører, flytte portenhøyere basert på den tilsvarende fluorescerende intensitet. - Laster en samling rør og begynner å sortere målcellepopulasjon.
- Hold samling rør på is etter sortering før alle prøverør er ferdig.
- Legg iskald C10 til innsamling rør opp til 4 ml, cap og invertere å blande.
- Sentrifuger oppsamlingsrøret ved 800 xg i 5 min, 4 ° C, og deretter aspirer supernatanten, og etterlater i området rundt 200 ul med cellepelleten urørt.
- Tilsett 1 ml iskald C10 til cellepelleten suspenderes og overføre alle cellesuspensjon inn i en 1,5 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger 1,5 ml rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C og aspirer supernatanten, og etterlot 100 ul med cellepelleten urørt.
- Oppbevar sortert celle populasjoner på is inntil bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi forsøkte å berike benmarg PDC med høy renhet, og uten påvirkning av andre celletyper, fra MRL / lpr lupus utsatt mus av både unge og gamle alder for å studere funksjonelle endringer av PDC om deres evne til å produsere IFNα. Den første rense strategien som ble anvendt var MCS, som, som figur 1 viser, førte til bare 7,75% renhet etter anrikning. I forhold til MCS, FACS anriket PDC med renhet så høy som 96,4%. For å sikre høy renhet, var en trinn-for-trinn gating strategi utført. Som vist i figur 2, ble mononukleære celler gated og adskilt fra avfall ved forover spredning (FSC) og sidespredning (SSC) parametere. Ved hjelp av FSC-bredde (FSC-W) vs. FSC-høyde (FSC-H) og SSC-W vs SSC-H, ble enkeltceller inngjerdet for å unngå falske positive signaler produsert av aggregater. Levende enkeltceller ble deretter gated som DAPI - befolkningen (DAPI + cellene er døde eller apoptotisk).Fra levende enkeltceller, CD11c + CD11b - ble befolkningen gated, hvorfra B220 + PDCA-1 + befolkningen ble ytterligere gated som PDC. Den sorterte PdC ikke bare av høy renhet, men også funksjonelt normal. De hadde evnen til å produsere IFNα in vitro ved CpG stimulering som vist i figur 3 (Re-print med tillatelse fra vår forrige publisering 17.
Figur 1. Renheten av PDC Ordnet gjennom enten MCS og FACS-metode Representative flowcytometri tall som viser hvor mange prosent av PDC (CD11c + CD11b - B220 + pdca-1 +). I sorterte celler ved MCS (øverst) og FACS (nederst), henholdsvis. Den CD11c + CD11b - befolkningen ble gated fra total levende celler (til venstre), og deretter PDC som B220 + PDCA-en + Celler ble inngjerdet i CD11c + CD11b -. Befolkningen (til høyre) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. gating Strategi for PDC berikelse ved FACS En trinn-for-trinn-gating strategien i følgende rekkefølge:. Mononukleære celler til enkeltceller FSC, til enkeltceller SSC, til DAPI - levende celler, til CD11c + CD11b - og til B220 + PDCA-1 + som levende PDC. PDC totalt enkeltceller er 2,95 ± 1,42%; sortert PDC tallet er 0,88 ± 0,28 x 10 5 per mus med en utvinningsgrad rundt 50%. (N = 12 MRL / lpr-mus, er data vist som gjennomsnitt ± SD 95% CI av middelverdien). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 3. IFNα Produksjon av FACS-sortert PDC Ordnet benmarg PDC ble behandlet med klasse A CpG (ODN1585, 5 mm) for 6 timer in vitro. I figuren, "y" står for yngre, 6 uker gamle mus; "O" står for eldre, 16 uker gamle mus. MRL står for MRL mus som friske kontroll mus; lpr står for MRL / lpr mus som lupus utsatt mus. Konsentrasjonen av IFNα i kultursupernatanten ble målt med ELISA. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, en-veis ANOVA. Data er vist som gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien (n = 3 mus per gruppe). Dette tallet er gjengitt fra vår publikasjon i Journal of Immunology med tillatelse. 17pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
- Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
- Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
- Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
- Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
- Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
- Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
- Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
- Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).
