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Bioengineering

用作酶反应器的水滴及其电磁驱动

doi: 10.3791/54643 Published: August 28, 2017

Summary

Lab-in-a 滴反应系统允许在微流控尺度上实现复杂反应的多用途。一个由 3 x 3 电磁线圈组成的自动驱动平台被开发并成功地用于合并两个10µL 反应器, 从而在产生的液体弹珠中启动酶反应。

Abstract

为了成功地实现微流体反应系统, 如 PCR 和电泳, 小液体体积的运动是必不可少的。在传统的实验室芯片平台中, 溶剂和样品通过具有复杂流量控制装置的微流控通道传递。在这里提出的液滴驱动平台是一个有前途的选择。有了它, 它是可能移动液体下落 (微) 在一个反应平台的平面表面 (lab-in-a-下落)。反应器在平台疏水表面的驱动是基于对液滴外层的磁力作用, 它是由一层薄薄的疏磁铁矿颗粒制成的。平台的疏水表面是需要的, 以避免任何接触之间的液体核心和表面, 使微的平滑移动。在平台上, 可以同时定位和移动一个或多个带有10µL 卷的反应器。该平台本身包括一个 3 x 3 矩阵的电气双线圈, 其中既容纳钕或铁芯。磁场梯度是自动控制的。通过磁场梯度的变化, 可以自动操纵反应器的磁性疏水壳, 以使微或打开壳体可逆地运动。基质和相应的酶的反应可以通过合并反应器或使它们与表面固定化催化剂接触来启动。

Introduction

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微型反应的技术应用主要是在预定义微通道芯片中进行的。这些系统在文献中得到广泛的建立和全面的描述 (特别是1,2,3)。在 2011年, 微流控技术的营业额在全球总计62亿欧元4。相比之下, 自由移动的微型反应堆舱室的使用以前只在有限的范围内进行过审查和出版。最常见的移动水下微滴的方法是润湿5。其他方法为下落在表面上是基于电场6, 磁力力量7或声学驱动8。由于其不利的表面体积比, 这些 droplet-based 微系统暴露在强烈的蒸发效应。因此, 下落运动通常建立作为液体 two-phase 系统, 其中上部阶段有一个高沸点保护水相从蒸发。然而, 这种方法有很大的风险, 污染的反应液滴不受控制的扩散。这是对上述系统的技术建立的一个重大障碍。

最近的工作涉及换药液固相转变。一种高效的方法是使用疏表面, 从而形成球形水滴。这个反应概念的引伸是使用微反应隔间与疏表面或壳, 例如可能包括聚四氟乙烯 (PTFE) 微粒9。他们的接触角度在表面上通常是在160范围内 (取决于表面粗糙度)。因此, 球形隔间提供了对表面运动的最小阻力, 同时提供了防止水蒸发的保护措施。

含微 PTFE 颗粒的水性水滴可以保持其球形形状, 直径可达2毫米左右。在更高的容量, 疏水壳通常不是完全地闭合的10。利用离子液体12, 对其它壳体材料的影响以及液体大理石在非极性溶剂中的应用范围进行了研究。为形成疏水性基于壳, 到目前为止微粒直径在大小的10毫微米-30 µm 被描述了11,14,16。新的研究表明, 疏水性纳米粒子作为壳体材料, 比微粒13的使用更为有效。第一个稳定性研究证实, 当粒子大小从 ca 减少时, 稳定性提高了.600 nm 到ca 100 nm。这可能是由于在水球体周围的密度更大的粒子分布15

水的反应隔间的保护由疏水壳和他们的指定作为液体大理石在2001年首先被描述了由 Aussillous et al.和 Mahadevan et al.17,18. 从那以后, 这些定义的反应隔间的应用很少被描述。例如, 基于液体弹珠19的气体传感器和基于光学定性基础的水污染检测方法已被开发成20。作者区分了高反应率和低消耗化学物质的微反应系统的优势。最近的出版物涉及生产 pH 敏感的液体弹珠16或表示 "两面" 粒子与两种不同的功能涂层。例如, Bormashenko et al.可以合成一个微, 其外壳由聚四氟乙烯和半导体炭黑21组成。此外, 通过渗透气液界面24, 反应器能高效、方便地吸收外氧作为单体的合成 polyperoxides。在另一种方法中, 二氧化硅-基于液弹的壳体提供反应基板表面来调节经典的银镜反应26。亲水-核-疏水壳液滴的研究和开发目前存在的问题是粒度调整、单分散液滴的可再生生产、表面润湿性和第二次的效果亲水壳在微反应舱室22, 以及更好地控制液滴轨迹,例如用于开发连续 microPCR 系统4

这些反应器的磁性驱动提供了相对地高运动范围的好处和一个好选择力量, 当工作在生物化学的系统时。在使用疏水磁铁矿粒子时, 它们既实现了磁力传递到反应器运动的功能, 也满足了疏水壳的作用。在 2006年, 莱曼et al.第一次被假定为液滴内磁性微粒的磁性运动。23和田et al.25, 谁使用手动移动永久磁铁作为执行器的一个单一的水滴的动员。另一种移动少量液体的方法是由赵et al.实现的, 后者使用疏水 Fe3O4粒子作为磁壳。磁性液体大理石的壳在下落的上部被打开了由垂直的反向磁场27。基于这一概念, 薛et al.能够开发出形成微的粒子, 其表面张力为20.1 达因 cm− 1 28。Lin et al.捏造了新的纤维素微/纳米分层球体与 superparamagnetism 和棉织, 提供了神的稳定性磁液滴运输和操作31。到目前为止, 这只是作为一个原理的研究, 而不是用于任何应用程序。液体弹珠的磁性和电控目前在第一种方法中进行。赵et al.在 2010年15和张et al. 2012 29中, 可以通过手动操作在核心壳液滴下的永磁体运动来进行液滴操作。Bormashenko et al.11通过接近钕磁铁, 实现了将铁磁性液体大理石的加速度提高到 25 cm s-1的速度。上述原则研究完全是由一个小型永磁体的手动运动进行的。作为下一步的发展步骤, 赵et al.最近能够通过改变永磁体的距离来估计磁性液体大理石运动所需的磁通密度30。对于与普通实验室芯片系统相媲美的反应控制, 提供自动控制离散液体 v 的方法似乎是不可避免的。olumes为了满足这一需要, 我们开发了一种新的基于变场梯度的控制系统, 以固定、移动和打开磁反应器。

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Protocol

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1. 磁性纳米粒子的水化

  1. 用于合成疏水性磁性微粒, 添加 0.85 g FeCl 3 六水合物 (3.14 摩尔) 和 0.30 g FeCl 2 四水合物 (1.51 摩尔) 至200毫升水/乙醇溶液 (4:1 伏/伏).
  2. 对此混合物, 增加0.20 毫升 1 h, 1 h, 2 h, 2 h Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5.23 摩尔) 与剧烈搅拌由磁性搅拌器 (500 rpm)。在惰性气体气氛中 (N 2 ) 进行合成, 使用带有软木塞的圆底烧瓶, 以防止磁铁矿微粒的二次氧化.
  3. 用氢氧化铵溶液 (1.5 米) 将溶液下落调整到 ph 值 8 (ph 值由 ph 计测定)。使用磁力搅拌器将溶液搅拌24小时.
  4. 通过将烧瓶放置在条形磁铁上 (钕长方体磁铁 40 x 20 x 10 mm, 粘附力25千克) 将颗粒从溶液中磁性分离出来。倒出的解决方案, 同时保持磁铁的底部的瓶子.
  5. 用水/乙醇溶液清洗粒子三次, 而使用的是1.4 中描述的条形磁铁)。在60和 #176 处将颗粒干燥; C 为 24 h (产生 ca 0.43 g).
  6. 用于分析粒子, 根据制造商和 #39 的说明使用扫描电子显微镜.

2。反应器的制作

  1. 使用玻璃杵将所有干燥的微粒磨碎, 然后将它们直接放入称重锅 (46 和 #215; 46 和 #215; 8 mm, 聚苯乙烯)
  2. 吸管10和 #181; l 反应溶液 (如5.1 所述的成分) 到所有的粒子上, 并在大约十年代轻微地移动称重盘 (粒子质量为10和 #181; 微: ca 3.2 x 10 -7 kg类 = "xref" > 33 )。在室温下储存剩余的微粒 (在反应溶液周围没有组装的微粒) 以供进一步应用.
  3. 用于测量微的接触角, 请建立一个5和 #181; 微 2.2), 将其放置在聚四氟乙烯薄膜上, 并根据制造商和 #39 使用光学接触角测量装置分析接触角;说明.

3. 3 d-打印线圈体

  1. 设计双线圈体, 其高度为 16 mm (一室), 直径为 10 mm, 内径为 ca. 4 mm, 并根据制造商和 #39 使用 CAD 软件;说明.
  2. 根据制造商和 #39 的指示, 使用聚乳酸灯丝等材料打印带3D 打印机的线圈体。用一台电脑控制的绕线机将车身用0.08 毫米铜线包裹起来, 实现4500绕组.

4。制造的驱动平台

  1. 在一个矩阵 ( 3 x 3 矩阵) 上安排双线圈, 在一个带有珀尔卡元件的电路板上, 拧紧双线圈, 然后通过带状电缆将它们连接到一个控件 ( 图 3 ).
  2. 根据所需的应用, 添加一个铁芯 (32 毫米高, 4 毫米直径) 或钕磁铁 (12.5 毫米高度, 4 毫米直径, 1035 kA m -1 ), 以获得更强的磁场.
  3. 完成平台放置一个板, 最好是石英玻璃, 最大高度为 1 mm 的线圈矩阵.
  4. 在平台表面放置一个微.
  5. 从反应溶液中提取上部粒子, 从而打开一个微, 使用4.1 中提到的控制来激活内部的钕磁铁。关闭微再次停用线圈.
  6. 合并两个初始的反应器 ca. 10 mm 使用钕磁体, 如4.2 所述)。通过激活 ca 的线圈, 在所需的线圈体中向上提起磁体. 二十五年代打开一个微 (在微和磁铁之间所需的距离约 12 mm), 并将另一个移动到平台上的相同位置.
  7. 在平台表面的微上冷却反应液, 并减少在线圈矩阵下方的贴珀元件上的线圈温度开关, 如4.1 所述).

5。通过合并反应器的酶反应

  1. 将辣根过氧化物酶溶解在浓度为0.1 和 #181; g mL -1 在磷酸钾缓冲 (0.1 M, pH 6.5)。稀释基体, 10-乙酰基 37-dihydroxyphenoxazine (10 毫米在砜 (亚砜)) 与磷酸钾缓冲 (0.1 M, pH 6.5) 的浓度200和 #181; m.
  2. 使用10和 #181; 每个解决方案中的 L 分别构建两个反应器, 如2.2 所述)。将两个反应器用磁力的平均值 (钕圆柱磁铁: 12.5 mm x 4 mm, 1035 kA m -1 ) 合并为4.6 和 #176; C.
  3. 通过定位荧光探针检测反应 (激发波长: 570 nm, 发射波长: 585 nm) ca 10 mm 直接在合并之前打开的微.

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Representative Results

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贝壳颗粒的直径约640纳米。在这个 fluorosilane 壳颗粒内的磁化纳米粒子的直径在22纳米和 37 nm 之间。一个5µL 微与水作为一个液体核心有一个接触角的周围160。

如上所述, 移动10µL 微所需的力是1.34 ±0.08 µN.图 1显示了铜线线圈的电磁力和4500毫安驱动的内铁芯。通过有限元模型 (FEM) 估计力分布, 以确定所需的线圈特性来移动微。如图 1所示, 所述线圈所进行的磁力足以将微移动到距线圈中心10毫米远的距离。

打开微的磁力等于0.85 ± 0.05 mN, 比移动液滴所需的力高得多。由于线圈内的铁芯引起的磁力 (图 1) 不够强, 无法打开微, 所以在线圈中使用了钕磁铁。通过在交流流动方向上的双线圈供电, 永磁体可以向平台移动或远离。从而, 微可以被打开或闭合磁性地。如果两个反应器与一个完全完整的外壳并排躺在一起, 他们不合并, 因为表面张力抑制他们的融合。因此必须至少打开一个。

图 2显示了蔑-氏的动力学结果, 这是由于合并了10µL 微含有过氧化物酶, 另有10µL 微含有相应的基质 (n = 3)。通过 Lineweaver-伯克线性化计算出的微内反应的 K 值为86.85 µM ±10.95 µM, vmax值位于 378.8 nmol l-1 s-1 115.6 nmol l-1 -1。由于 Km值与文献中所给的具有良好的对应关系, 81 ±3µM 32, 可以假定 small-scale 微内的酶反应与疏水性壳体材料不受亲和力.

Figure 1
图 1:电磁力模拟的线圈与58毫安和4500绕组铜线微的距离与线圈中心确定的有限元.线圈直径为10毫米, 铁芯直径为4毫米.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:蔑-氏两个10µL 反应器的过氧化物酶动力学测定.温度为25° c, 使用的缓冲器为磷酸钾 (0.1 米), pH 值为6.5。三重复被执行了。

Figure 3
图 3:驱动平台该驱动平台由 3 x 3 矩阵的双线圈组成。一个线圈有4500绕组, 高度16毫米 (一室), 直径10毫米和内径为ca. 4 mm。线圈的高度由使用的钕圆筒磁铁的高度预定义。直径是选择的, 因为以前的研究表明, 这是一个合理的距离, 移动微与此类磁铁。通过有限元法确定了绕组的个数和电流.请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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为了成功地利用微流控技术, 必须将反应量与生物科技合成和分析的要求相对应。在这里提出的驱动平台, 可以移动微流控液滴的磁力。通过将液滴与磁性疏壳封闭在反应平台的平面表面上, 可以在两个维度上自由地进行运动。因此, 在传统的微流控系统中, 采用具有复杂流量控制装置的预定义微流控通道系统来传递溶剂和样品。因此, 小型反应液滴的自动驱动是对已知的实验室芯片平台的显著简化。此外, 该平台可以可逆地打开一个微来添加和除去反应样品。与分配器系统相结合, 这可能会产生高度的自动化反应控制, 是在硅片中可设计的 microreactions 在虚拟 lab-in-a 中的第一步。此技术的主要限制是反应器只能使用少量的卷 (最多ca 30 µL) 生成。协议中的一个关键步骤是检测反应器内的酶反应, 因为荧光探针必须进行适当的调整。进一步的检测可能是紫外/可见光谱。

该平台的发展过程表明, 直径为10毫米的电磁线圈对于雾滴运动是足够的。另一方面, 充满空气或铁芯的双线圈无法感应到打开微壳所需的磁力。因此, 在线圈中选择了钕核心来完成这项任务。由此产生的磁场梯度再次可以通过电磁运动的磁铁垂直到反应平台变化。平台的间距大小只受控制。现有的控制和软件已经设计就绪, 可用于 10 x 10 矩阵。在所描述的应用中不需要 "珀尔" 元素, 但在微必须固定较长时间时可能是必要的, 它将允许在平台表面上方冷却反应混合物。

在未来, 驱动平台与液体大理石的组合可以作为灵活的 lab-in-a-下降-系统的实施的放映, 快速光学分析和复杂的酶级联反应与非常小的反应体积。此外, 该平台可用于 (生物) 化学分析, 如 PCR, 电泳或 ELISA。此外, 筛选新的, 工业相关的酶和适放大是有希望的可能性。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者想感谢 DFG 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printer FelixPrinters Pro1
10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) Life Technologies A12222
Ammonium hydroxide TU-KL 1072
CAD software Siemens Soled edge
Contact angle measuring device Dataphysics OCA 20
Cylinder magnet Webcraft GmbH S-04-13-N https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Dipotassium phosphate Bernd Kraft 7758-11
Drying oven Binder FD 115
Ethanol Sigma-Aldrich 68-17-5
FeCl2 tetrahydrate TU-KL 1625
FeCl3 hexahydrate TU-KL 1622
Fluorescence probe PerkinElmer LS 55
Horseradish peroxidase Carl Roth 9003-99-0
Hydrogen peroxide Th.Geyer GmbH & Co 7722-84-1
Monopotassium phosphate Bernd Kraft 7778-77-0
Peltier element Conrad  193569
Perfluoroctyltriethoxysilane Sigma-Aldrich 51851-37-7
Scanning Electron Microscope FEI Helios NanoLab 650 DualBeam
Separation bar magnet Webcraft GmbH Q-40-20-10-N
Winding machine IWT GmbH FW122

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References

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