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Bioengineering

Aquosas gotículas usadas como Microreactors enzimática e sua atuação eletromagnética

doi: 10.3791/54643 Published: August 28, 2017

Summary

Sistemas de laboratório-em-um-gota reação permitem a implementação versátil de reações complexas em uma escala de microfluidic. Uma plataforma de acionamento automatizado que consiste de uma matriz 3 x 3 das bobinas electromagnéticas foi desenvolvida e utilizado com sucesso para mesclar dois 10 µ l de microreactors e, assim, iniciar uma reação enzimática em mármores do líquido resultantes.

Abstract

Para o sucesso da implementação de sistemas de reação microfluídicos, tais como a PCR e eletroforese, o movimento de pequenos volumes de líquidos é essencial. No convencionais laboratório-em-um-microplaqueta-plataformas, solventes e amostras são passadas através de canais microfluídicos definidos com instalações de controle de fluxo complexo. A plataforma de atuação da gota aqui apresentada é uma alternativa promissora. Com isso, é possível mover uma gota de líquido (Microrreator) sobre uma superfície plana de uma plataforma de reação (laboratório-em-um-gota). A atuação do microreactors na superfície hidrofóbica da plataforma baseia-se na utilização de forças magnéticas, atuando na camada exterior das gotas de líquido, que é feita de uma fina camada de partículas de magnetita superhydrophobic. A superfície hidrofóbica da plataforma é necessária para evitar qualquer contacto entre o núcleo líquido e a superfície para permitir um movimento suave do Microrreator. Na plataforma, um ou mais microreactors com volumes de 10 µ l pode ser posicionados e mudou-se simultaneamente. A plataforma em si consiste de uma matriz 3 x 3 de bobinas elétricas de duplas que acomodar os núcleos de ferro ou de neodímio. Os gradientes de campo magnético são controlados automaticamente. Pela variação dos gradientes de campo magnético, casca de hidrofóbicos magnético do microreactors pode ser manipulada automaticamente para mover o Microrreator ou abra o shell de forma reversível. Reações de substratos e enzimas correspondentes podem ser iniciadas por fusão a microreactors ou trazê-los em contacto com a superfície catalizadores imobilizados.

Introduction

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Aplicações técnicas com micro reações são predominantemente realizadas em fichas microchannel predefinidos. Estes sistemas são amplamente estabelecidos e exaustivamente descritos na literatura (inter alia 1,2,3). Em 2011, o volume de negócios de microfluidic tecnologias mundiais totalizou 6,2 bilhões euro 4. Em contraste, o uso de compartimentos livremente móvel reator micro era anteriormente apenas examinado e publicado de forma limitada. O método mais comum para mover aquosas micro gotículas é electrowetting 5. Outros métodos para o movimento das gotas em superfícies baseiam-se em campos elétricos 6, força magnética 7 ou atuação acústica 8. Devido à sua superfície desfavorável à relação do volume, estes sistemas baseados em gotículas Microrreator são expostos aos efeitos da evaporação forte. Assim, o movimento de queda é geralmente estabelecido como um sistema de duas fases líquido, onde a fase superior tem um alto ponto de ebulição, protegendo a fase aquosa da evaporação. No entanto, essa abordagem envolve um alto risco de contaminação da gota de reação por difusão descontrolada. Este é um obstáculo significativo para o estabelecimento técnico dos sistemas mencionados.

Trabalho recente é concernido com as transições de fase de líquido-sólido não-aderente. Uma abordagem altamente eficaz é o uso de superfícies superhydrophobic, permitindo a formação de gotículas aquosas esféricas. Uma extensão deste conceito de reação é a utilização de compartimentos de reação micro com uma superfície superhydrophobic ou shell, que por exemplo pode consistir de partículas de politetrafluoretileno (PTFE) 9. Seus ângulos de contacto em superfícies geralmente estão na faixa de 160° (dependendo da aspereza de superfície). Os compartimentos esféricos assim, fornecem a mínima resistência ao movimento em uma superfície e simultaneamente fornecem proteção contra a evaporação da água.

Gotas aquosas revestidas com partículas PTFE micro tamanhos podem manter sua forma esférica, até um diâmetro de cerca de 2 mm. Em volumes mais elevados, o shell hidrofóbico normalmente não está completamente fechado mais 10. A influência de outros materiais de concha e a expansão do campo de aplicação do mármore líquido para solventes apolares foi implementadas pelo Gao e McCarthy usando líquidos iônicos 12. Até agora para a formação de conchas com base em partículas hidrofóbicas, diâmetros de partículas em tamanhos de 10 nm-30 µm têm sido descritos 11,14,16. Novos estudos demonstraram que nanopartículas hidrofóbicas como material de shell são de uso ainda melhor do que a de micropartículas 13. Estudos de estabilidade de primeira confirmaram um aumento na estabilidade quando o tamanho de partícula é reduzido de ca. 600 nm até ca. 100 nm. Este provável resultados na distribuição de partículas mais densas em torno da esfera aquosa 15.

A proteção de compartimentos aquosos reação por um escudo hidrofóbico e sua designação como bolinhas de gude líquidas foi descrita pela primeira vez em 2001 por Aussillous et al e Maria et al. 17 , 18. desde então, têm sido descritos alguns aplicativos desses compartimentos definidos reação. Por exemplo, um sensor de gás baseado em mármores líquido 19 e um método de detecção para a contaminação da água com base em uma base qualitativa opticamente foram desenvolvidas 20. Os autores distinguem as vantagens das taxas de reação e o baixo consumo de produtos químicos de seus sistemas de reação micro. Publicações recentes lidar com a produção de mármores líquidos sensíveis ao pH 16 ou a representação de 'Partículas de Janus' com dois diferentes revestimentos de diferentes funcionalidades. Por exemplo, Bormashenko et al poderia sintetizar um Microrreator com reservatórios de Teflon e semicondutor carbono preto 21. Além disso foi demonstrado que o microreactors pode eficientemente e conveniente sintetizar polyperoxides absorvendo oxigênio externo como comonômero através a interface permeable do gás-líquido 24. Em outra abordagem a concha de mármores líquidos baseados em sílica-partícula fornecem as superfícies do substrato reativo para regular o espelho de prata clássica reação 26. Problemas atuais de investigação e desenvolvimento no campo de gotículas hidrofílico-núcleo-hidrofóbico-shell são o ajuste de tamanho de partícula, a produção reprodutível de gotículas monodisperso, a molhabilidade das superfícies e o efeito de um segundo hidrofílica concha sobre a reação micro compartimentos 22, bem como um melhor controle das trajectórias da gota, por exemplo, para o desenvolvimento de sistemas contínuos microPCR- 4.

Uma atuação magnética destes microreactors oferece a vantagem de intervalos de movimento relativamente alta e uma boa seletividade da força quando se trabalha em sistemas bioquímicos. Quando usando partículas de magnetita hidrofóbicos, cumprem a função da transmissão para o movimento da microreactors força magnética, bem como a função de uma concha hidrofóbica. A circulação magnética de gotículas com partículas magnéticas dentro uma gota foi postulada pela primeira vez em 2006 pelo Lehmann et al 23 e Shikida et al 25, que usaram manualmente movidos ímãs permanentes como atuadores para a mobilização de uma única gotícula. Outra abordagem para mover uma pequena quantidade de líquido foi realizada por Zhao et al, que usado hidrofóbicas partículas Fe3O4 como escudo magnético. O shell do mármore líquido magnético foi aberto na parte superior da queda por um vertical inverter magnético campo 27. Com base neste conceito, Xue et al foram capazes de desenvolver as partículas que formam um Microrreator com uma tensão de superfície da Dina 20,1 cm− 1 28. Lin et al fabricado romance baseado em celulose micro/nano hierárquicas esferas com Superparamagnetismo e superhydrophobicity que preveem estabilidade Deus gotículas de líquido magnético transporte e manipulação de 31. Isso foi até agora lançado apenas como um prova de princípio estudar e não usado para qualquer aplicação. O controle elétrico e magnético dos mármores do líquido atualmente é perseguido em primeiras aproximações. Zhao et al . em 2010 15 e Zhang et al . 2012 29 foram capazes de desenvolver uma manipulação da gota pelo movimento manual (manual) de um ímã permanente sob casca-núcleo de gotículas. Bormashenko et al . 11 alcançou a aceleração de um mármore ferromagnético líquido a uma velocidade de 25 cm s-1 por aproximar um ímã de neodímio. O princípio acima mencionado foram realizados estudos exclusivamente pelo movimento manual de um pequeno ímã permanente. Como uma próxima etapa de desenvolvimento, Zhao et al foram recentemente capazes de estimar a densidade de fluxo magnético necessária para o movimento de mármore líquido magnético variando a distância de um ímã permanente de 30. Para um controle de reação comparável de sistemas comuns de laboratório-em-um-microplaqueta, parece inevitável para fornecer os meios de controle automatizado do discreto líquido volumes. Para satisfazer esta necessidade, desenvolvemos um novo sistema de controle baseado em gradientes de campo variável se fixam, mover e abrir o microreactors magnético.

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Protocol

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1. Hydrophobization de nanopartículas magnéticas

  1. para a síntese de partículas magnéticas hidrofóbicas, adicionar 0,85 g FeCl 3 hexa-hidratado (3.14 mmol) e 0,30 g de FeCl 2 Tetra (1.51 mmol) de 200 mL solução de etanol/água (4:1 v/v).
  2. a esta mistura, adicione 0,20 mL 1H, 1H, 2 H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5,23 mmol) com agitação vigorosa por um agitador magnético (500 rpm). Realizar a síntese em uma atmosfera de gás inerte (N 2) usando um balão de fundo redondo com uma rolha para evitar a oxidação secundária das partículas de magnetita.
  3. Ajustar a gota de solução inteligente com uma solução de hidróxido de amônio (1,5 M) a um pH de 8 (pH determinada por um medidor de pH). Agitar a solução durante 24 h, utilizando um agitador magnético.
  4. Separar as partículas magneticamente a solução, colocando o frasco em uma barra de ímã (adesivo de neodímio ímã cuboide 40 x 20 x 10 mm, força 25 kg). Deite fora a solução, mantendo o ímã anexado à parte inferior do frasco.
  5. Lavar as partículas três vezes com a solução de água/etanol enquanto estiver usando uma barra de ímã, conforme descrito em 1.4). Seca as partículas a 60 ° C por 24 h (rendimento ca. 0,43 g).
  6. Para analisar as partículas, usar um microscópio eletrônico de varredura de acordo com o fabricante ' instruções de s.

2. Fabricação de Microreactors

  1. moer todas as partículas secas ligeiramente usando um pilão de vidro e posteriormente colocar todos eles diretamente em uma panela de pesagem (46 × 46 × 8 mm, poliestireno).
  2. Pipeta 10 solução de reação de µ l (composição como descrito em 5.1) sobre todas as partículas e a pesagem de movimento pan ligeiramente de forma circular por aproximadamente 10 s (massa da partícula para um Microrreator de 10 µ l: ca. 3.2 x 10 -7 kg < sup classe = "xref" > 33). Armazenar as restantes partículas (partículas que não auto-montagem em torno da solução de reação) à temperatura ambiente para novas aplicações.
  3. Para medir o ângulo de contacto da Microrreator, a construir um Microrreator de 5 µ l com água, conforme descrito no ponto 2.2), coloque-o em um filme de teflon e analisar o ângulo de contato usando um dispositivo de medição do ângulo de contato óptico de acordo com o fabricante ' s instruções.

3. 3D-impressão dos corpos bobina

  1. desenha os corpos de bobina dupla, com uma altura de 16 mm (uma câmara), um diâmetro de 10 mm e um diâmetro interior de ca. 4 mm usando um software de CAD de acordo com o fabricante ' s instruções.
  2. Imprimir os corpos de bobina com uma impressora 3D de acordo com o fabricante ' instruções s usando materiais como polilactida filamento. Enrole os corpos com um fio de cobre 0,08 milímetros para alcançar 4.500 enrolamentos usando uma máquina de enrolamento controlados computador.

4. Fabricação da plataforma de atuação

  1. organizar a dupla bobinas em uma matriz (por exemplo, 3 x 3 matriz) em um quadro eléctrico com um elemento Peltier debaixo, aparafusar as bobinas duplas e conectá-los a um controle via fita cabo ( a Figura 3).
  2. Dependendo da aplicação desejada, adicionar um núcleo de ferro (32 mm de altura, diâmetro de 4 mm) ou um ímã de neodímio (12,5 mm de altura, diâmetro de 4 mm, 1.035 kA m -1) para o corpo de bobina para obter um campo magnético mais forte.
  3. Para terminar a plataforma colocar uma placa, de preferência de vidro de quartzo, com uma altura máxima de 1 mm na matriz da bobina.
  4. Colocar um Microrreator na superfície da plataforma.
  5. Para retirar as partículas superiores a solução de reação e, assim, abrir uma Microrreator ativa uma bobina com um íman de neodímio dentro usando o controle mencionado no 4.1). Para fechar a Microrreator outra vez desactivar a bobina.
  6. Para mesclar duas microreactors que são inicialmente ca. 10 mm separado usa ímãs de neodímio, conforme descrito em 4.2). Levante o ímã nos corpos bobina necessária ativando as bobinas para ca. 25 s para abrir um Microrreator (distância necessária entre Microrreator e ímã encontra-se cerca de 12 mm) e mover o outro para a mesma posição na plataforma.
  7. Esfriar a reação solução na Microrreator sobre a superfície da plataforma e para diminuir a temperatura da bobina ligar o elemento Peltier, posicionado abaixo da matriz de bobina, conforme descrito em 4.1).

5. Reação enzimática por fusão Microreactors

  1. peroxidase de rábano e dissolver em uma concentração de 0,1 µ g mL -1 em tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 6.5). Diluir o substrato, 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine (10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) com tampão de fosfato de potássio (0,1 M, pH 6.5) a uma concentração de 200 µM.
  2. Uso de 10 µ l de cada uma destas soluções para construir duas microreactors, conforme descrito no ponto 2.2). Mesclar os dois microreactors a média das forças magnéticas (ímã de neodímio cilindro: 12,5 mm x 4 mm, 1.035 kA m -1) conforme descrito em 4.6) a 25 ° C.
  3. Detectar a reação pelo posicionamento de uma sonda de fluorescência (comprimento de onda de excitação: 570 nm, comprimento de onda de emissão: 585 nm) ca. 10 mm diretamente acima de um Microrreator aberto antes da mesclagem.

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Representative Results

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As partículas de casca têm um diâmetro de cerca de 640 nm. As nanopartículas magnetizáveis colocadas entre esta partículas de casca de fluorosilane têm diâmetros em uma faixa entre 22 nm e 37 nm. Um Microrreator de 5 µ l com água como um núcleo líquido tinha um ângulo de contato de em torno de 160°.

A força necessária para mover um Microrreator de 10 µ l como descrito acima é 1,34 ± 0,08 µN. a Figura 1 mostra a força eletromagnética de uma bobina com 4.500 enrolamentos de fio de cobre e um núcleo de ferro interna alimentado com 58 mA. A distribuição de força é estimada por um modelo de elementos finitos (FEM) para determinar as propriedades de bobina necessária para mover um Microrreator. Como pode ser visto na Figura 1, a força magnética realizada pela bobina descrita é forte o suficiente para mover um Microrreator para uma distância mais longe do que 10 mm de distância do centro da bobina.

A força magnética para abrir um Microrreator igual a 0,85 ± 0.05 mN que é muito maior do que a força necessária para mover o droplet. Como a força magnética criada pela bobina com núcleo de ferro dentro (Figura 1) não é forte o suficiente para abrir um Microrreator, um ímã de neodímio foi usado nas bobinas. Por ligar as bobinas duplas em direções de fluxo de corrente alternada, o ímã permanente pode ser movido em direção ou para longe da plataforma. Desse modo, o Microrreator pode ser aberta ou fechada magneticamente. Se dois microreactors com uma casca intacta mentir ao lado eles não mesclar como a tensão superficial inibe sua fusão. Portanto, pelo menos um deve ser aberto.

A Figura 2 mostra a cinética de Michaelis-Menten, resultante da fusão de um Microrreator de 10 µ l contendo peroxidase com outro 10 µ l Microrreator, contendo o substrato correspondente (n = 3). Pelo valor dem de linearização o K calculado de Lineweaver-Burk para a reação dentro do Microrreator é 86.85 µM ± 10,95 µM, o valormáximo de v encontra-se no 378.8 nmol L-1 s-1 ± 115.6 nmol L-1 s-1. Como o valor dem K é em boa correspondência com que dado na literatura, 81 ± 3 µM 32, pode-se supor que a reação enzimática dentro o Microrreator em pequena escala com o material de shell hidrofóbico não é influenciada com respeito à afinidade.

Figure 1
Figura 1: Eletromagnético forçar a simulação de uma bobina com 58 mA e 4.500 enrolamentos de cobre do fio na dependência da distância entre o Microrreator para o centro da bobina determinado pela FME O diâmetro da bobina é de 10 mm, o diâmetro do núcleo de ferro é de 4 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Cinética de Michaelis-Menten de peroxidase medido através da fusão de dois 10 µ l microreactors. A temperatura é de 25 ° C e o buffer usado é o fosfato de potássio (0,1 M) com um pH de 6.5. Realizaram-se três repetições.

Figure 3
Figura 3: Plataforma de atuação. A plataforma de atuação consiste em uma matriz 3 x 3 das bobinas duplas. Uma bobina tem 4.500 enrolamentos, uma altura de 16 mm (uma câmara), um diâmetro de 10 mm e um diâmetro interno de aproximadamente 4 mm. A altura das bobinas é predefinida pela altura do ímã do neodymium usado cilindro. O diâmetro foi escolhido porque estudos anteriores mostraram que se trata de uma distância razoável para a movimentação de um Microrreator com esse tipo de ímã. O número de enrolamentos e a corrente foi determinado por FEM clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Para o uso bem sucedido de microfluidic tecnologias, é importante mudar o volume de reação correspondente às exigências da síntese biotecnológica e análises. A plataforma de atuação aqui apresentada, torna possível mover microfluidic gotículas por força magnética. O movimento pode ser realizado livremente em duas dimensões sobre uma superfície plana de uma plataforma de reação colocando-se a gota de líquido com um escudo magnético superhydrophobic. Assim, um sistema alternativo para canais microfluídicos predefinidos com instalações de controle de fluxo complexo, como costumava para passar de solventes e amostras em sistemas microfluídicos convencional, é introduzido. A atuação automatizada de gotas pequenas reação é assim uma significativa simplificação das conhecidas plataformas lab-on-a-chip. Além disso, a plataforma torna possível reversivelmente abrir um Microrreator para adicionar e remover amostras de reação. Em combinação com um sistema de dispensador, isto pode resultar em um alto grau de controle de reação automatizada e é o primeiro passo para em silico projetáveis microreactions em uma virtual lab-em-um-gota. A principal limitação dessa técnica é que o microreactors só pode ser construída com pequenos volumes (até ca. 30 µ l). Um passo crítico no protocolo é a detecção da reação enzimática no interior da microreactors porque a sonda de fluorescência deve ser ajustado adequadamente. Uma possibilidade mais adicional da deteção pode ser espectroscopia UV/vis.

O processo de desenvolvimento da plataforma mostrou que uma bobina eletromagnética com um diâmetro de 10 mm é suficiente para o movimento da gota. Por outro lado, uma bobina dupla preenchida com ar ou com um núcleo de ferro não é capaz de induzir a força magnética que é necessário para abrir um shell Microrreator. Portanto, núcleos de neodímio foram escolhidos nas bobinas para executar essa tarefa. Os gradientes de campo magnético resultante novamente podem ser variados pelo movimento electromagnética do íman vertical para a plataforma de reação. O tamanho do campo da plataforma é limitado apenas pelo controle. O controle já existente e o software é projetado e pronto para uso para uma matriz de 10x10. O elemento Peltier não é necessária para as aplicações descritas, mas pode ser necessário quando o Microrreator precisa ser consertado por mais tempo e permitirá que arrefecer a mistura de reação acima da superfície da plataforma.

No futuro, a combinação da plataforma de atuação com mármores do líquido pode funcionar como laboratório-em-um-gota-sistemas flexíveis para a implementação de seleções, análises rápido ópticas e reações de cascata complexo enzima com volumes muito pequenos de reação. Além disso, a plataforma pode ser usada para análises químicas (bio-) como PCR, eletroforese ou ELISA. Além disso, a triagem de novas enzimas industriais relevantes e amplificações aptamer é possibilidades promissoras.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de reconhecer a DFG pelo apoio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printer FelixPrinters Pro1
10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Red) Life Technologies A12222
Ammonium hydroxide TU-KL 1072
CAD software Siemens Soled edge
Contact angle measuring device Dataphysics OCA 20
Cylinder magnet Webcraft GmbH S-04-13-N https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Dipotassium phosphate Bernd Kraft 7758-11
Drying oven Binder FD 115
Ethanol Sigma-Aldrich 68-17-5
FeCl2 tetrahydrate TU-KL 1625
FeCl3 hexahydrate TU-KL 1622
Fluorescence probe PerkinElmer LS 55
Horseradish peroxidase Carl Roth 9003-99-0
Hydrogen peroxide Th.Geyer GmbH & Co 7722-84-1
Monopotassium phosphate Bernd Kraft 7778-77-0
Peltier element Conrad  193569
Perfluoroctyltriethoxysilane Sigma-Aldrich 51851-37-7
Scanning Electron Microscope FEI Helios NanoLab 650 DualBeam
Separation bar magnet Webcraft GmbH Q-40-20-10-N
Winding machine IWT GmbH FW122

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Aquosas gotículas usadas como Microreactors enzimática e sua atuação eletromagnética
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Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).More

Al-Kaidy, H., Kuthan, K., Hering, T., Tippkötter, N. Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation. J. Vis. Exp. (126), e54643, doi:10.3791/54643 (2017).

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