Introduction
Gnagere modeller har blitt brukt til å studere mange menneskelige sykdoms manifestasjoner, inkludert pyelonefrit og urinveisinfeksjoner (UTI). UTI er et globalt helseproblem, og kan påvirke barn, menn og kvinner i alle aldre. 1 , 2 , 3 Den første manifestasjonen av UTI-er inkluderer blærebetennelse, og hvis infeksjonen stiger opp langs urineren, kan en nyreinfeksjon (pyelonefrit) følge. Samtidig nærmer utbredelsen av diabetes 400 millioner mennesker over hele verden. 4 , 5 Det er viktig at UTI-forekomsten kan være opptil 4 ganger høyere hos pasienter som er overvektige eller har type 2 diabetes mellitus, noe som resulterer i økt risiko for gjentatt UTI-infeksjon (RUTI), sepsis, nyrefibrose fra pyelonefrit og blæredysfunksjon. 6 , 7 , 8 GnagereModeller er viktige for å studere UTI, fordi nåværende antibiotikabehandlinger produserer en vedvarende, forebyggende respons bare i en delmengde av UTI-pasienter. For å forbedre klinisk UTI-omsorg er hovedtrinnene å forstå mekanismen for RUTI og dens patofysiologiske prosesser fra akutt infeksjon til betennelse i fibrose, samt virkningen av type 2 diabetes mellitus.
Målet med å forbedre dyremodeller er å utvikle teknikker som muliggjør en mer nøyaktig vurdering av sykdomsprogresjon og terapeutiske inngrep. Flere forskjellige tilnærminger har blitt anvendt for å indusere pyelonefrit hos rotter og / eller mus for å studere patofysiologien av nyrebeskadigelse, effekten av antibiotisk behandling og andre aspekter av den naturlige forlengelsen av UTI. En felles tilnærming til å etablere retrograd UTI er transuretral kateterisering. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Denne metoden introduserer bakterier via urinrøret i urinblæren hos bedøvede dyr. Selv om denne teknikken nøye simulerer menneskelig pyelonefrit, kan den faktiske forekomsten og størrelsen på pyelonefritisinfeksjonen være svært variabel på grunn av flere faktorer, inkludert mangel på spontan ureterisk refluks eller urinrengjøring under eller umiddelbart etter inokulering. 11 Som et resultat av eksperimentell variabilitet i å indusere en stigende pyelonefritt infeksjon kan begrense anvendeligheten av denne modell for å studere nyre-infeksjoner, så vel som terapeutiske strategier.
Denne rapporten beskriver en kirurgisk pyelonephritis rotte modell hvor E. coli injiseres direkte i rotteryren. Til tross for at denne rottemodellen er invasiv, kan mengden av E. coli levert til nyrene effektivt kontrolleres slik at det blir en robust nyreinfeksjon og betennelse. 14 Innenfor denne prosedyren beskriver vi ogsåHvordan disse induserte nyreinfeksjonene kan overvåkes langsgående med in vivo magnetisk resonansimaging (MR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til godkjente protokoller for institusjonell dyrepleie og brukskomité (IACUC) ved Case Western Reserve University. Varigheten av den kirurgiske prosedyren beskrevet nedenfor er ca. 45-60 minutter. MR-prosedyren i seg selv er ca. 15 minutter for hvert tidspunkt.
1. Anestesi
- Bedøv råtten i isoflurankammer satt til 2% isofluran blandet med oksygen for å lette dyrehåndtering og fastholdelse før administrering av injiserbar anestesi intraperitonealt.
- Etter 3-5 min eksponering for isofluran, kontroller at dyret er bedøvet og ikke utviser noe respons på tåfinger.
- Videre sederende rotte med en intraperitoneal injeksjon av en blanding av xylazin og ketamin: 75 mg / kg ketamin / 10 mg / kg xylazin. Når du utfører intraperitoneale injeksjoner, trekk nålen for å sikre at deler av tarmene eller andre vitale organer ikke har blitt punktert.
- JegInjiser 2 mg / kg bupivakain subkutant på snittstedet for å gi lokal smertelindring.
2. Forberedelse av kirurgisk område
- Steriliser kirurgiske instrumenter og forsyninger før de brukes til kirurgi og legg ut på kirurgisk puten for sterilitet. De fleste instrumenter og forsyninger kan autoklaveres og gjenbrukes.
- Bruk sterile hansker til alle kirurgiske prosedyrer.
- Bruk en elektrisk barberhøvel til å barbere pelsen av dyrets høyre side. Barber dyret fra bunnen av ribbeholderen til toppen av bakbenet, og sørg for et stort hårfritt område for snittet.
- Plasser dyret på en steril kirurgisk pute for å isolere det desinfiserte området fra omkringliggende områder.
- Skrub huden med et desinfiseringsmiddel som povidon jod eller betadin. Start skrubbingen i midten av kirurgisk område og beveg deg utvendig på en sirkulær måte. Gjenta minst tre ganger med en ny tørke av povidon jod eller betadin. Skrub det kirurgiske stedet med 70% alkoholpotter inntil huden er tydelig, da jod kan være giftig hvis det absorberes.
3. kirurgisk prosedyre
- Opprettholde denne prosedyren under aseptiske forhold.
- Plasser det bedøvede dyret på en varm oppvarmings seng i venstre lateral decubitus stilling med høyre flanke vendt oppover.
MERK: Det må tas vare på å opprettholde dyrets kjerne kroppstemperatur ved 35-37 ° C for å forhindre hypotermi. Denne oppvarmingssengen bør også steriliseres etter behov for å opprettholde aseptiske forhold. - Føl for ribbe buret, og lage en liten 2-3 cm høyre dorsal retroperitoneal snitt ved hjelp av en steril størrelse 10 skalpellblad startende på bunnen av ribbe bur.
- Plasser sterilt gauze i lengderetningen langs hver side av snittet.
- Disseksér det subkutane vev, fett og muskler for å visualisere og få tilgang til bukhulen. Bruk buet bladet Mayo saks for å tillate dypere penetreringRasjon i sår og kutt tykt vev.
- Når leveren er tydelig synlig og tilgjengelig, bruk stump tenger for å trekke leveren oppover.
- Bruk et annet par stumpe pincett i den annen side, avslør høyre nyre slik at den sitter like utenfor bukhulen.
- Bruk pekefingeren og tommelen på venstre hånd for å holde nyren på plass. Med den høyre hånd injiserer du langsomt og støt 0,1 ml UTI89 E. coli løsning (konsentrasjon mellom 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) fra en steril sprøyte inn i nyrebjelken (som vises som en hvit boble) 15 .
MERK: Forbered bakterietitteren som beskrevet i referanse 15 . - Legg en strimmel absorberbar hemostat over nålen for å forhindre utstrømning av inokulum i bukhinnen. Dra langsomt nålen ut av nyrebjelken.
MERK: Det må tas forsiktighet for ikke å gjennomsyre eller infisere omgivende vev, noe som resulterer i off-target infectiOns og / eller komplikasjoner. - Bruk en større sprøyte til å skylle nyren grundig med vanlig saltoppløsning før du legger den tilbake i bukhulen.
4. Suturer
Merk: Sutur som skal bli begravet i vev, skal være 4-0 ikke-absorberbare flettede suturer. Absorberbare eller monofilament suturer kan brukes til kroppsoverflater.
- Plasser suturene jevnt og så nær vevkanten som mulig for å forhindre hindring av blodstrømmen; Vanligvis ikke mer enn 0,3 cm fra kanten er nødvendig.
- Ta tak i huden og ta den litt ut med et par fine tannpinner, og roter nålholderen i en uttalt stilling for å gjennomsøke huden.
- Kjør nålen gjennom hele tykkelsen av huden ved å supine håndleddet for å rotere nålen og passere den gjennom huden.
- Gjenta denne prosessen for hudkanten nærmest den enkelte som utfører prosedyren.
- StrammeSuturene er nok til å motvirke vevskanter. En hvilken som helst strammere vil hindre blodtilførsel, langsom sårheling og kan resultere i dehiscens.
- Slå av suturen ved hjelp av firkantede knuter, som om det var en enkel avbrutt søm, bortsett fra at bare den korte strengen er kuttet, og går om en 3-4 mm hale.
- Etter at den første sømmen er bundet av, forbereder du på å plassere en ny søm ca 3 mm fra den første, og fortsett løpende sutur.
- Når slutten av snittet er nådd, ikke trekk den siste sømmen helt gjennom. I stedet bruker du sløyfen som holdes med nålholderen her som den korte strengen for å knytte den distale enden av suturlukningen.
- Ved hjelp av instrumentbånd, knytt suturen ved hjelp av firkantede knuter. Dette resulterer i tre tråder som stikker opp fra den ferdige knuten ved den distale enden.
5. Animal Recovery
- Injiser 2,1 mg / kg Yohimbin intraperitonealt etter kirurgi for å reversere anestesi. ENNimaler forventes å komme seg fullt ut fra den kirurgiske prosedyren etter 3-5 timer.
- Hold dyret på en varmepute (for å unngå hypotermi) og absorberende mykt sengetøy etter operasjonen.
- Gi rehydrering med orale eller parenterale væsker til det kan gå tilbake til normal fôring (innen 24 timer). Injiser omtrent 0,6 ml normal saltoppløsning peritonealt umiddelbart etter operasjonen for å begrense dehydreringseffekter.
- Gi analgesi som beskrevet i IACUC godkjent dyrepleie og bruk protokoll. Injiser 5 mg / kg carprofen subkutant for smertebehandling.
- Overvåk innsnitt regelmessig for hevelse, ekssudat, smerte eller dehiscens.
6. Validering via Magnetic Resonance Imaging
- Utfør i vivo MR-eksperimenter på småfelt MRI-skannere på høyfelt.
- Fremkall anestesi med 3% isofluran i oksygen og plasser dyret med den rette nyre på isocenter i MR-skanneren og hensiktsmessigSpiste radiofrekvensspole. Gi dyr med 1-2% isofluranbedøvelse kontinuerlig gjennom bildebehandlingprosedyren via en nosekon.
MERK: For in vivo MR-bilder vist i figur 1 ble det brukt en rattstørrelsesvolumspole (indre diameter = 72 mm). - Bruk et dyr overvåking og kontrollsystem for å opprettholde hvert dyrs respirasjonshastighet (40-60 pust / min) og kjerne kroppstemperatur (35 ± 1 ° C).
- Bruk et multi-slice, multi-echo spin echo MR-oppkjøp for å oppnå høyoppløselige, aksiale T2-vektede bilder av både de infiserte og kontrollerte nyrene. Typiske MR-oppkjøpsparametere er repetisjonstid = 5000 msek, ekotid = 40 msek, skive tykkelse = 2,0 mm, romlig oppløsning i flyet = 200 μm, 3 signal gjennomsnitt og en oppkjøpstid på 8 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medisinsk billedteknikk gir mulighet til å vurdere ikke-invasiv UTI og terapeutisk effekt. Derfor MRI ble anvendt for å validere induksjon av akutt infeksjon etter injeksjon av 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli, og for å visualisere endringene i nyrene før og etter operasjonen. Figur 1a-b viser et gradvis økende område av nyreinfeksjon (gule piler). MR-bilder oppnådd for hvert dyr i dag 1 og 4 etter infeksjon, bidrar til å karakterisere veksten av den akutte pyelonefritis-infeksjonen.
Figur 1: Aksialt T1-vektet MR-bilder fra en E. coli -indusert gnagermodell av pyelonefrit på ( a ) Dag 1 og ( b ) Dag 4 etter infeksjon (gule piler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stigende akutt pyelonefrit hos gnagere (dvs. mus og rotter) kan produseres ved transuretral kateterisering. 16 , 17 , 18 Denne transuretrale infeksjonsmetoden er fordelaktig ved at den er ikke-invasiv og etterligner den menneskelige patofysiologi av stigende infeksjon. 17 , 18 , 19 , 20 Imidlertid kan denne metoden også lider av uregelmessige infeksjonshastigheter og variabel E. coli dosering til nyren på grunn av fysiologiske begrensninger som voiding og anatomisk variasjon. 11 Fierer et al. (1971) rapporterte 6 av 40 (15%) rotteryrer som viste tegn på pyelonefrit etter infusjon av E. coli i blæren. 15 Videre ble gjentatte infusjoner av E. coli som kreves flere ganger i uken for å ReliAbly produserer pyelonefrit. 15 , 19
I denne rapporten beskriver vi en alternativ gnagere pyelonephritis modell som kirurgisk introduserer E. coli direkte inn i nyrebjelken. Den primære fordelen med den kirurgiske modellen av pyelonefritisk teknikk inkluderer administrering av en konsistent dose av E. coli- konsentrasjon mellom 1 x 10 8 - 1 x 10 9 samt injeksjon av bakteriene på samme anatomiske område (høyre nyrebælke) for hver dyr. 15 Denne direkte injeksjon unngår kravet om tilbakestrømning som gir en mer pålitelig infeksjon, samt en mer nøyaktig bestemmelse av injisert dose. Samlet gir denne kirurgiske pyelonefritmodellen et alternativ for studier som krever konsistent, reproduserbar infeksjon med minimal påvirkning av uretral reflux.
Optimalisering av suksessen til denne kirurgiske teknikken inkluderer:1) å oppnå dyp anestesi for å begrense luftveisbevegelsen og å gi tilstrekkelig arbeidstid 2) barbering området av kirurgisk snitt for å hindre forurensning fra ikke prepped områder; 3) sterilisering for å hindre innføring av forurensning; 4) forsiktig injeksjon av en kjent dose av E. coli i rottene, nyrebjelken; 5) grundig saltvannskylling av nyre etter injeksjon; 6) nær tilnærming av sårkanter via suturer; Og 7) overvåkning av intraoperative og postoperative komplikasjoner som hypotermi og systemiske bivirkninger. Selv om en varmepute ble brukt til å øke dyrekomforten, kan denne protokollen bli ytterligere optimalisert ved å bruke en rektal temperatursensor for å opprettholde kjerne kroppstemperatur. Et viktig skritt for å oppnå en vellykket overlevelse kirurgi er riktig anestesi og overvåking av dyrets respirasjon. Unnlatelse av å gjøre det resulterer i utvidede kirurgiske tider for å stabilisere dyrets bedøvelsesnivå og begrense uønsket skade på grunn av overdrevenbevegelse. Kompromittert sterilitet i arbeidsområdet og / eller utilsiktet infeksjon av peritoneum med E. coli- bakterier er også vanlige komplikasjoner forbundet med den kirurgiske modellen. Derfor, tilstrekkelig forberedelse til autoklaver kirurgiske verktøy, å sterilisere hele arbeidsområdet, og prosedyreinnsats for å begrense ytterligere E. coli- infeksjoner bidrar alle til å minimere dyredødeligheten, samt feile infeksjonsresultater.
Til tross for fordelene ved direkte injeksjon av E. coli i nyrene, har denne kirurgiske modellen av pyelonefrit også flere begrensninger i forhold til transuretral leveringsmetode. Den største ulempen ved å bruke den direkte kirurgiske tilnærming er den inneboende invasiviteten til teknikken. Dødligheten er imidlertid betydelig lav med implementering av en riktig steril teknikk og bruk av tilstrekkelig smertebehandling, temperaturkontroll via varmeputer og mykt, absorberende sengetøy etter kirurgi tilSikre rask gjenoppretting. I tillegg er autoklaverende kirurgiske verktøy for sterilisering en ekstremt pålitelig og kostnadseffektiv metode for sterilisering. Den totale kirurgiske tidsforpliktelsen er vanligvis mindre enn 1 time. Videre sørger administrasjonen av anestesi, samt lokal og systemisk levering av smertestillende legemidler som er kalibrert til kroppsvekt, nøyaktig dosering og sikkerhetssikkerhet. En annen potensiell begrensning i den kirurgiske modellen er at kirurgiske teknikker er vanskeligere i mus på grunn av de mindre anatomiske størrelsene. I motsetning til den transuretrale metoden som kan implementeres i både rotter og mus, øker kravet til bruk av rottemodeller for den kirurgiske modellen den totale kostnaden av studien og kan legge begrensninger på studiet av ulike genetiske endringer som kan være lettere tilgjengelige Og kostnadseffektiv i musemodeller. Som nevnt ovenfor er en annen signifikant begrensning av den kirurgiske metoden at den ikke representerer human pyelonefrit somTett som den transuretrale metoden.
Her brukte vi MR-teknikker til å spore nyreinfeksjonene. Som vist i figur 1 , gir MR-skanning muligheten til å overvåke nyreneinfeksjonene uten tid. En alternativ tilnærming til sporing av E. coli- infeksjoner er gjennom fluorescensmerking av bakteriene. 11 , 18 Imidlertid er fluorescerende bildebehandling mindre effektiv i denne rottemodellen (i motsetning til musemodeller) på grunn av lysabsorpsjon av vevet, noe som resulterer i sterkt redusert deteksjonsfølsomhet. Derfor gir MRI et mer sensitivt middel for å spore E. coli- infeksjoner i de tidligste stadiene og å gi regional informasjon om omfanget av infeksjonen i tre dimensjoner.
Mekanismene til UTI / akutt pyelonephritis-patofysiologi, og fremdriften til nyresvikt, er dårlig forstått. Infeksjonsmidlene, den underLøgn immunologisk vertsrespons, og inflammatoriske reaksjoner spiller en integrert rolle, men betydningen av hver er ukjent. Forbedringen i målrettet levering av bakterier til nyrene ved hjelp av denne direkte injeksjonsprosedyren har potensial til å øke reproduserbarheten av akutt pyelonefrit i gnagermodeller, og kanskje for bedre å vurdere tidlige terapeutiske inngrepstiltak for behandling av UTI. Denne metoden ble opprinnelig utviklet som en tilnærming for å optimalisere levering av bakterier til nyrene, men har også anvendelse for levering av andre reagenser og patogener. Denne metoden kan også gi fordeler til studier av blærebetennelse, pyelonefrit, UTI og diabetisk nyresykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
- Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
- Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
- Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
- Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
- Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
- Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
- Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
- Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
- Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
- Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
- Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
- Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
- Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
- Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
- Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
- Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
- Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
- Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
- Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).
