Introduction
Os modelos de roedores têm sido utilizados para estudar numerosas manifestações de doenças humanas, incluindo pielonefrite e infecções do trato urinário (UTI). As UTIs são um problema de saúde global e podem afetar crianças, homens e mulheres de todas as idades. 1 , 2 , 3 A manifestação inicial de UTIs inclui cistite, e se a infecção ascende ao longo do ureter, pode ocorrer uma infecção renal (pielonefrite). Ao mesmo tempo, a prevalência de diabetes está se aproximando de 400 milhões de pessoas em todo o mundo. 4 , 5 Importante, a incidência de UTI pode ser até 4 vezes maior em pacientes obesos ou com diabetes mellitus tipo 2, resultando em maior risco de infecção recorrente de UTI (rUTI), sepse, fibrose renal de pielonefrite e disfunção da bexiga. 6 , 7 , 8 RoedorOs modelos são importantes no estudo de UTI, porque as terapias antibióticas atuais produzem uma resposta preventiva sustentada somente em um subconjunto de pacientes com UTI. Para melhorar o atendimento clínico de UTI, os principais passos são compreender o mecanismo da rUTI e seus processos fisiopatológicos de infecção aguda a inflamação à fibrose, bem como o impacto do diabetes mellitus tipo 2.
O objetivo de melhorar os modelos animais é desenvolver técnicas que permitam uma avaliação mais precisa da progressão da doença e das intervenções terapêuticas. Várias abordagens diferentes foram empregadas para induzir pielonefrite em ratos e / ou camundongos para estudar a fisiopatologia do dano renal, o efeito do tratamento antibiótico e outros aspectos do curso natural das UTIs. Uma abordagem comum para estabelecer UTI retrógrada é o cateterismo transuretral. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Este método introduz bactérias através da uretra na bexiga urinária de animais anestesiados. Embora esta técnica simula de perto a pielonefrite humana, a incidência real e a magnitude da infecção por pielonefrite podem ser altamente variáveis devido a múltiplos fatores, incluindo a falta de refluxo ureteriano espontâneo ou micção urinária durante ou imediatamente após a inoculação. 11 Como resultado, a variabilidade experimental na indução de uma infecção de pielonefrite ascendente pode limitar a utilidade deste modelo para estudar infecções renais, bem como estratégias terapêuticas.
Este relatório descreve um modelo de rato de pielonefrite cirúrgico onde E. coli é diretamente injetado no rim do rato. Apesar de este modelo de rato ser invasivo, a quantidade de E. coli administrada ao rim pode ser efetivamente controlada, possibilitando uma infecção e inflamação robusta do rim. 14 Dentro deste procedimento, também descrevemosComo essas infecções renais induzidas podem ser monitoradas longitudinalmente com a Ressonância Magnética In vivo (MRI).
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Protocol
Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais (IACUC) na Case Western Reserve University. A duração do procedimento cirúrgico descrito abaixo é de aproximadamente 45-60 min. O procedimento de ressonância magnética em si é de aproximadamente 15 min para cada ponto do tempo.
1. Anestesia
- Anestesiar o rato na câmara de isoflurano ajustada a 2% de isoflurano misturado com oxigênio para facilitar o manuseio e restrição de animais antes da administração de anestesia injetável intraperitoneal.
- Após 3-5 minutos de exposição ao isoflurano, verifique se o animal é anestesiado e não exibe resposta à pitada do dedo do pé.
- Mais rato sedado com injeção intraperitoneal de uma mistura de xilazina e cetamina: 75 mg / kg de cetamina / 10 mg / kg de xilazina. Ao realizar injeções intraperitoneais, retire a agulha para garantir que partes do intestino ou outros órgãos vitais não tenham sido perfurados.
- EuNjeção 2 mg / kg de bupivacaína subcutaneamente no local da incisão para fornecer alívio da dor tópica.
2. Preparação da área cirúrgica
- Esterilizar instrumentos e suprimentos cirúrgicos antes de serem utilizados para cirurgia e colocar na almofada cirúrgica para esterilidade. A maioria dos instrumentos e suprimentos podem ser autoclavados e reutilizados.
- Use luvas estéreis para todos os procedimentos cirúrgicos.
- Use uma lâmina elétrica para raspar a pele do lado direito do animal. Raspar o animal do fundo da caixa torácica até o topo da perna traseira proporcionando uma grande área livre de cabelo para a incisão.
- Coloque o animal em uma almofada cirúrgica estéril para isolar a área desinfectada das áreas circundantes.
- Esfregue a pele com um desinfetante, como povidona iodo ou betadina. Comece a esfregar no centro do local cirúrgico e se mova para o exterior de forma circular. Repita pelo menos três vezes com uma nova limpeza de povidona iodo ou betadina. Esfregue o local cirúrgico com 70% de cotonete com álcool até a pele ficar clara, pois o iodo pode ser tóxico se for absorvido.
3. Procedimento cirúrgico
- Mantenha este procedimento em condições assépticas.
- Posicione o animal anestesiado em uma cama de aquecimento quente na posição de decúbito lateral esquerdo com o flanco direito voltado para cima.
NOTA: Deve-se ter cuidado para manter a temperatura corporal central do animal a 35-37 ° C para prevenir a hipotermia. Esta cama de aquecimento também deve ser esterilizada conforme necessário para manter condições assépticas. - Sinta-se para a caixa torácica e faça uma pequena incisão retroperitoneal dorsal direita de 2-3 cm usando uma lâmina de bisturi esterilizada de tamanho 10 começando no fundo da caixa torácica.
- Coloque a gaze estéril longitudinalmente ao longo de cada lado da incisão.
- Dissecte o tecido subcutâneo, gordura e músculos para visualizar e acessar a cavidade abdominal. Use tesoura de ponta curvada para permitir uma penetração mais profundaRacionar em ferida e cortar tecidos grossos.
- Uma vez que o fígado é claramente visível e acessível, use fórceps sem corte para retrair o fígado para cima.
- Usando outro par de fórceps contundentes, por outro lado, exponha o rim direito, então fica sentado fora da cavidade abdominal.
- Use o ponteiro do dedo e o polegar da mão esquerda para segurar o rim na posição. Com a mão direita, injete lentamente e de forma constante 0,1 ml de solução de E. coli UTI89 (concentração entre 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) de uma seringa estéril para a pelve renal (que aparece como uma bolha branca) 15 .
NOTA: Prepare o título bacteriano conforme descrito na referência 15 . - Coloque uma tira de hemostato absorvível sobre a agulha para evitar a saída de inóculo no peritoneu. Puxe lentamente a agulha para fora da pelve renal.
NOTA: Deve-se ter cuidado para não perfurar ou infectar os tecidos circundantes, resultando em infecções fora do alvoOns e / ou complicações. - Use uma seringa maior para enxaguar completamente o rim com solução salina normal antes de colocá-lo de volta na cavidade abdominal.
4. Suturas
Nota: A sutura que será enterrada nos tecidos deve ser 4-0 sutura trançada não absorvível. Suturas absorventes ou monofilamentos podem ser utilizadas para superfícies do corpo.
- Coloque as suturas de forma uniforme e tão perto da borda do tecido quanto possível para evitar a obstrução do fluxo sanguíneo; Normalmente não é necessário mais de 0,3 cm da borda.
- Segure a pele e evite-a ligeiramente usando um par de fórceps com dentes finos e gire o suporte da agulha em uma posição pronada em preparação para perfurar a pele.
- Dirija a agulha através da espessura total da pele, supinando o pulso para girar a agulha e passá-la através da pele.
- Repita este processo para a borda da pele mais próxima do indivíduo que executa o procedimento.
- ApertarAs suturas são suficientes para se opor às bordas dos tecidos. Qualquer mais apertado irá obstruir o suprimento de sangue, cicatrização lenta e pode resultar em deiscência.
- Amarre a sutura usando nós quadrados, como se fosse um simples ponto interrompido, exceto que apenas a corda curta é cortada, deixando cerca de uma cauda de 3-4 mm.
- Após o primeiro ponto ter sido amarrado, prepare-se para colocar um segundo ponto a cerca de 3 mm de distância do primeiro e continue com a sutura em execução.
- Uma vez que o fim da incisão é atingido, não puxe o último ponto completamente. Em vez disso, use o loop que está sendo mantido com o suporte da agulha aqui como a corda curta para amarrar a extremidade distal do fechamento da sutura.
- Usando laços do instrumento, amarre a sutura usando nós quadrados. Isso resulta em 3 strands que sobrescrevem do nó preenchido na extremidade distal.
5. Recuperação de animais
- Injete 2,1 mg / kg de Yohimbina intraperitonealmente após a cirurgia para reverter a anestesia. UMAEspera-se que os nimais se recuperem completamente do procedimento cirúrgico após 3-5 horas.
- Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento (para evitar hipotermia) e roupa de cama suave absorvente após a cirurgia.
- Fornecer reidratação com líquidos orais ou parenterais até que ele possa retornar à alimentação normal (dentro de 24 horas). Injetar aproximadamente 0,6 ml de solução salina normal peritonealmente imediatamente após a cirurgia para limitar os efeitos de desidratação.
- Forneça analgesia conforme descrito no protocolo de uso e cuidado de animais aprovado pela IACUC. Injete 5 mg / kg de carprofen por via subcutânea para o tratamento da dor.
- Monitorar incisões regularmente para inchaço, exsudato, dor ou deiscência.
6. Validação por imagem de Ressonância Magnética
- Realizar i n vivo em experiências MRI alto campo animal pequeno ressonância magnética.
- Induzir anestesia com 3% de isoflurano em oxigênio e posicionar o animal com o rim direito no isocentro no scanner MRI e apropriadoComia bobina de radiofrequência. Fornecer animais com 1-2% de anestesia com isoflurano continuamente ao longo do procedimento de imagem por meio de uma nosecone.
NOTA: Para as imagens de MRI in vivo mostradas na Figura 1 , utilizou-se uma bobina de volume de tamanho de rato (diâmetro interno = 72 mm). - Use um sistema de monitoramento e controle de animais para manter a taxa de respiração de cada animal (40-60 respirações / min) e temperatura corporal central (35 ± 1 ° C).
- Use uma aquisição de MRI de eco de rotação multi-fatia e multi-eco para obter imagens ponderadas axiais de alta resolução de ambos os rins infectados e de controle. Os parâmetros típicos de aquisição de MRI são o tempo de repetição = 5,000 ms, tempo de eco = 40 ms, espessura da fatia = 2,0 mm, resolução espacial no plano = 200 μm, 3 médias de sinal e um tempo de aquisição de 8 min.
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Representative Results
As técnicas de imagem médica oferecem a oportunidade de avaliar de forma não invasiva UTI e eficácia terapêutica. Portanto, a RM foi utilizada para validar a indução de infecção aguda após a injeção de 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli e para visualizar as alterações no rim antes e após a cirurgia. A Figura 1a-b mostra uma região progressivamente crescente de infecção renal (setas amarelas). As imagens de ressonância magnética obtidas para cada animal nos dias 1 e 4 pós-infecção ajudam a caracterizar o crescimento da infecção aguda da pielonefrite.
Figura 1: Imagens de MRI Axial T1 ponderadas de um Modelo de Pirinefrite induzido por E. coli em ( a ) Dia 1 e ( b ) Dia 4 pós-infecção (setas amarelas).
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Discussion
A pielonefrite aguda ascendente em roedores (por exemplo, ratos e ratos) pode ser produzida por cateterismo transuretral. 16 , 17 , 18 Este método de infecção transuretral é vantajoso por não ser invasivo e simula a fisiopatologia humana da infecção ascendente. 17 , 18 , 19 , 20 No entanto, este método também pode sofrer de taxas de infecção irregulares e doses variáveis de E. coli no rim devido a limitações fisiológicas, como micção e variação anatômica. 11 Fierer et al. (1971) relataram 6 de 40 (15%) rins de ratos mostrando evidência de pielonefrite após infusão de E. coli na bexiga. 15 Além disso, as infusões repetidas de E. coli foram necessárias várias vezes por semana para reliFacilmente produzir pielonefrite. 15 , 19
Neste relatório, descrevemos um modelo alternativo de pielonefrite de roedores que apresenta cirurgicamente E. coli diretamente na pélvis renal. O benefício primário do modelo cirúrgico da técnica de pielonefrite inclui a administração de uma dose consistente de concentração de E. coli entre 1 x 10 8 - 1 x 10 9 , bem como a injeção da bactéria no mesmo local anatômico (pélvis renal direita) para cada animal. 15 Esta injeção direta evita o requisito de refluxo, proporcionando uma infecção mais confiável, bem como uma determinação mais precisa da dose injetada. Em geral, esse modelo de pielonefrite cirúrgica fornece uma opção alternativa para estudos que requerem infecção consistente e reprodutível com impacto mínimo do refluxo uretral.
Otimizar o sucesso desta técnica cirúrgica inclui:1) alcançar uma anestesia profunda para limitar o movimento respiratório e permitir tempo de trabalho suficiente; 2) raspar a área de incisão cirúrgica para prevenir a contaminação de áreas não preparadas; 3) esterilização para prevenir a introdução de contaminação; 4) injeção cuidadosa de uma dose conhecida de E. coli na pélvis renal renal; 5) lavagem salina completa do rim pós-injeção; 6) aproximação próxima das bordas da ferida através de suturas; E 7) monitoramento de complicações intra-operatórias e pós-operatórias, como hipotermia e efeitos colaterais sistêmicos. Embora tenha sido utilizada uma almofada de aquecimento para aumentar o conforto dos animais, este protocolo pode ser ainda mais otimizado usando um sensor de temperatura retal para manter a temperatura corporal do núcleo. Um passo fundamental na obtenção de uma cirurgia de sobrevivência bem-sucedida é anestesia adequada e monitoramento da respiração do animal. A falta de fazê-lo resulta em tempos cirúrgicos prolongados para estabilizar o nível de anestesia do animal e limitar lesões indesejadas devido a excessomovimento. A esterilidade comprometida da região de trabalho e / ou infecção não intencional do peritoneu com bactérias E. coli também são complicações comuns associadas ao modelo cirúrgico. Portanto, a preparação adequada para autoclave ferramentas cirúrgicas, para esterilizar todo o espaço de trabalho e os esforços processuais para limitar infecções adicionais por E. coli ajudam a minimizar a mortalidade animal, bem como resultados de infecção errônea.
Apesar dos benefícios da injeção direta da E. coli no rim, esse modelo cirúrgico de pielonefrite também possui múltiplas limitações em relação ao método de entrega transuretral. A maior desvantagem para o uso da abordagem de injeção cirúrgica direta é a invasividade inerente da técnica. No entanto, a mortalidade é consideravelmente baixa com a implementação de uma técnica estéril adequada e o uso de controle adequado da dor, controle de temperatura através de almofadas de aquecimento e pós-cirurgia suave e absorvente paraAssegure uma recuperação rápida. Além disso, as ferramentas cirúrgicas autoclavadoras para esterilização são um método extremamente confiável e econômico para a esterilização. O compromisso geral do tempo cirúrgico é tipicamente inferior a 1 h. Além disso, a administração de anestesia, bem como a entrega local e sistêmica de medicamentos contra a dor calibrados para o peso corporal garantem a entrega precisa da dose e a segurança do sujeito. Outra limitação potencial no modelo cirúrgico é que as técnicas cirúrgicas são mais difíceis em camundongos devido aos tamanhos anatômicos menores. Em contraste com o método transuretral que pode ser implementado em ratos e camundongos, o requisito de usar modelos de ratos para o modelo cirúrgico aumenta o custo total do estudo e pode colocar restrições no estudo de várias alterações genéticas que podem estar mais prontamente disponíveis E rentável em modelos de mouse. Como mencionado acima, outra limitação significativa do método cirúrgico é que ele não representa a pielonefrite humana comoDe perto como o método transuretral.
Aqui, utilizamos técnicas de RM para acompanhar as infecções renais. Conforme mostrado na Figura 1 , a varredura de MRI oferece a capacidade de monitorar de forma não invasiva as infecções renais ao longo do tempo. Uma abordagem alternativa para rastrear infecções por E. coli é através da rotulagem fluorescente das bactérias. 11 , 18 No entanto, a imagem fluorescente é menos eficaz neste modelo de rato (em oposição aos modelos de mouse) devido à absorção de luz pelo tecido, resultando em sensibilidade de detecção muito reduzida. Portanto, a ressonância magnética fornece um meio mais sensível para rastrear infecções por E. coli em seus estágios iniciais e fornecer informações regionais sobre a extensão da infecção em três dimensões.
Os mecanismos de UTI / fisiopatologia da piroonefrite aguda e a progressão para a fibrose renal são mal compreendidos. Os agentes infectantes, osA resposta imunológica imigrante do hospedeiro e as reações inflamatórias desempenham um papel fundamental, mas a importância de cada uma é desconhecida. A melhoria na entrega direta de bactérias ao rim usando este procedimento de injeção direta tem potencial para aumentar a reprodutibilidade da pielonefrite aguda em modelos de roedores e, talvez, para avaliar com mais precisão as intervenções terapêuticas em estágio inicial para o tratamento da UTI. Este método foi inicialmente desenvolvido como uma abordagem para otimizar a entrega de bactérias ao rim, mas também possui aplicação para a administração de outros reagentes e agentes patogênicos. Este método também pode oferecer benefícios para estudos de cistite, pielonefrite, UTI e doença renal diabética.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
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