Abstract
O recente desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) provou que células somáticas maduras podem voltar a um estado indiferenciado, pluripotentes. Agora, a reprogramação é feito com vários tipos de células somáticas adultas: queratinócitos, células de urina, f ibroblastos, etc. experiências iniciais foram normalmente feito com fibroblastos da derme. No entanto, isto requer um procedimento cirúrgico invasivo para se obter fibroblastos de pacientes. Portanto, as células em suspensão, tais como células de sangue e urina, foram considerados ideais para a reprogramação por causa da conveniência de obtenção de células primárias. Aqui, nós relatamos um protocolo eficiente para a geração de iPSC a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Por plaqueamento das PBMC transduzidas em série para um novo, placa utilizando centrifugação revestido de matriz, este protocolo pode facilmente fornecer colónias IPSC. Este método é também aplicável a células mononucleares de sangue do cordão umbilical (CBMCs). Este estudo apresenta um prot simples e eficienteOCOL para a reprogramação de PBMC e CBMCs.
Introduction
As células-tronco têm sido um dos materiais mais atraentes da terapia clínica durante os últimos várias décadas 1. As propriedades atraentes de células-tronco são pluripotência ea capacidade de auto-renovação. Em 1981, as primeiras células estaminais embrionárias (CES) foram isolados a partir do embrião de rato 2. No entanto, quando a técnica foi aplicada a embriões humanos, enfrentou vários problemas éticos.
Em 2006, quando o Dr. Yamanaka e sua equipe reprogramou a primeira célula pluripotente a partir de células somáticas de rato, o campo de células-tronco recuperou a sua possibilidade e interesse foi reavivado 3. Ao entregar vários fatores definidos, as células-tronco pluripotentes foram com sucesso "induzida" a partir de células somáticas adultas, e foram assim chamado "células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)." Em 2007, esta técnica foi aplicada às células humanas 4, as células com as características exactas do CES rendendo mas nenhum do debate ético. Teoricamente, iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer tipo de célula obtido a partir de um indivíduo ou paciente. iPSCs específicos do paciente estão subindo como uma ferramenta potencial que pode simular os fenótipos da doença e condições epigenéticas de cada paciente individual. Usando edição gene ou outros métodos que podem reverter a condição patogénica, iPSCs específicos do paciente também pode ser usado em medicina personalizada 5. Além disso, são menos iPSCs associada com a rejeição imunitária porque eles têm a mesma identidade imune como doador, tornando auto-transplante mais viável 6. Portanto, iPSCs tornaram-se a plataforma mais promissora na modelagem de doença, o rastreio de drogas e terapias regenerativas. Tendo em conta estes benefícios, melhores protocolos que podem dar mais puro e rendimentos mais elevados no menor espaço de tempo a partir da fonte de células menores são constantemente em desenvolvimento. Uma consideração importante de encontrar o protocolo mais eficaz para aplicação no futuro é o tipo de célula primária. A maioria dos primeiros geração proto iPSCcols são otimizados para células aderentes uma vez que as linhas de IPSC originais foram induzidas a partir de fibroblastos da pele 4. No entanto, o isolamento e a preparação destas células são trabalho intensivo. Além disso, o isolamento de fibroblastos da pele inclui procedimentos cirúrgicos invasivos que podem se tornar uma grande falha de aplicação mais ampla.
Portanto, para a continuação da utilização de iPSCs, uma fonte de células com a aquisição conveniente é necessária. O sangue é considerado como uma fonte de células ideal, uma vez que é obtido através de um procedimento minimamente invasivo, em vez de 7-9. Neste estudo, foi desenvolvida uma modificação simples de gerar o protocolo hiPSCs de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Sem o difícil processo de expansão de um tipo de células específico, tais como as células CD34 +, células de sangue completo ou PBMC foram serialmente plaqueadas em placas revestidas com matriz por centrifugação após transdução com vírus Sendai contendo factores Yamanaka. Este método reduz o tempo necessário para ofixação de células flutuantes transduzidos e diminuiu a perda de células reprogramadas que não foram capazes de anexar por conta própria.
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Protocol
Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861).
1. Isolamento de células monocíticas a partir de sangue
- Isolamento de células monocíticas (dia -5)
- Obter pelo menos 10 ml de sangue fresco a partir de uma colheita de sangue em um tubo de preparação de células (CPT).
- Transferir o sangue para um novo tubo cónico de 50 ml e dilui-la com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a uma proporção de 1: 4.
NOTA: Uma maior razão de diluição pode ser usado para uma pureza mais elevada. - Adicionar 10 mL de meio de gradiente de densidade para um novo tubo cónico de 50 ml e cuidadosamente em camadas o sangue diluído em cima dos meios de gradiente de densidade. Centrifugar a 750 xg durante 30 min à temperatura ambiente (TA), sem um freio de centrifugação.
- Transferir cuidadosamente a camada Buffy para um novo tubo cónico de 50 ml, adicionar 30 ml de PBS ao tubo, e lavar as células.
- Centrifugar as células a 515 xg durante 5 min à TA. </ Li>
- Descartar o PBS e ressuspender as células em 0,5 ml de meio de células de sangue.
- Contar as células e placa 1 x 10 6 células por poço de uma placa de 24 poços. Adicionar PBS aos poços circundantes para evitar a evaporação.
- Estabilizar as células durante 5 dias a 37 ° C em 5% de CO 2 antes da transdução. Adicionar um adicional de 0,5 ml de meio de células do sangue fresco nos dias 3-4, sem perturbar as células.
2. A transdução por vírus Sendai
- Transdução (Dia 0)
- Coletar e transferir as células do sangue para um tubo cônico de 15 ml e contá-los usando um hemocitômetro.
- Preparar 3 x 10 5 células por transdução e centrifugar as células a 515 xg durante 5 min à TA.
- Descartar o sobrenadante por aspiração e ressuspender as células em 0,5 ml de meio de células de sangue.
- Transferir as células para um poço de uma placa não-revestido de 24 poços.
- Descongelar a mistura de vírus Sendai em gelo e adicioná-lo ao sucélulas spended. Adicionar vírus Sendai para as células com base nas recomendações do fabricante.
- Selar a placa com uma película de selagem e centrifugar que a 1.150 xg durante 30 min a 30 ° C.
- Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em CO 2 durante a noite (O / N) 5%.
- transferência de células de matriz alimentador (Dia 1)
- No dia seguinte, revestimento de uma placa de 24 poços com vitronectina. Dilui-se a solução de vitronectina em PBS para uma concentração final / ml 5 ug. Adicionar 1 mL de vitronectina a um poço de uma placa de 24 poços e incuba-se que à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Remover a solução de revestimento antes da sua utilização. As placas revestidas podem ser armazenadas em TA durante 3 dias.
- Transferir todos os meios contendo as células e os vírus para o poço revestido.
- Recolher as células restantes com um adicional de 0,5 ml de meio de células de sangue fresco e adicioná-lo para a célula contendo bem.
- Centrifugar a placa a 1150 xg durante 10 min a 35 ° C.
- Depois centorifugation, remover o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio CIPS, e manter as células a 37 ° C em 5% de CO 2 O / N.
- transferência de segunda célula (Dia 2)
- Revestir os poços de uma nova placa de 24 cavidades com 5 ug / mL de vitronectina, conforme descrito no passo 2.2.1. Utilize uma das cavidades da placa para cada transdução.
- Transferir a suspensão de células a partir da primeira placa de placa de vitronectina recém-revestidos.
NOTA: Se não for necessário, as células em suspensão podem ser descartados. O procedimento indicado no passo 2.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se as etapas serão repetidas, a colheita das células. - Enquanto isso, adicionar 1 ml de meio iPSC ao poço da primeira placa, para manutenção, e incuba-se que a 37 ° C em 5% de CO 2 O / N.
- Manter as células ligadas a 37 ° C e 5% de CO 2 e efectuar uma mudança de meio ao dia com meios iPSC fresco. Colónias aparecerão nos dias 14-21 após a transdução.
- Centrifuge a placa de recém-revestidos contendo as células em suspensão a 1.150 xg e 35 ° C durante 10 min.
- Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 O / N.
- No dia seguinte, remover o sobrenadante e substituí-la por meios IPSC frescos.
NOTA: O procedimento mencionado na etapa 2.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se as etapas serão repetidas, a colheita das células do sobrenadante e repetir o passo 2.3. - Manter as células unidas com mudanças de meio dia até 80% de confluência é atingido.
3. Manutenção celular reprogramadas
- manutenção cedo após a cultura em placa de 24 poços
- 7-10 dias após a transdução, uma vez que as células estão confluentes, preparar, um prato de vitronectina-revestido de 60 mm. Diluir solução vitronectina em PBS para uma concentração final / ml 5 ug. Adicionar 1 mL de vitronectina para o prato e incubar-lo à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Lava-se aas células com PBS e adicionar 1 ml de PBS EDTA / 1 mM para separar as células.
- Incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 min.
- Colheita das células e centrifugar a 250 xg los e TA durante 2 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de meio fresco IPSC.
- Placa todas as células ressuspenso para o prato recém-revestida de 60 mm.
- Adiciona-se 10 mM de inibidor de cinase RHO para as células e mantê-las a 37 ° C em 5% de CO 2 até que as células estão 80% confluentes.
- Dividir para o aparecimento de colónias (Subclonagem Preparação)
- Prepare, um prato revestido com vitronectina de 100 mm, tal como descrito no passo 3.1.2.
- Lavam-se as células com PBS e adicionar 1 ml de EDTA PBS / 1 mM para separar as células.
- Incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 min.
- Colheita das células e centrifugar a 250 xg los e TA durante 2 min.
- Contar as células utilizando um hemocitómetro e preparar a 1 x 10 4 células por prato.
- Centrifugar as células a 250 xg e TA durante 2 min.
- Ressuspender 1 x 10 4 células em 6 ml de meios iPSC, placa-los sobre o prato revestido de 100 mm, e adicionar 10 RHO mM inibidor da quinase para a mídia.
- Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO 2 durante uma semana até grandes colónias aparecem.
NOTA: manter e expandir as colônias para subclonagem. Subclonagem geralmente é feito em menos de 5 passagens.
- Colony escolher usando iPSC colónia solução destacando
- Uma semana antes de picking colônia, semente 1 x 10 4 células em uma, de 100 mm prato revestido de vitronectina, conforme mencionado na etapa 3.2.7.
- Prepare, um prato revestido de vitronectina de 60 mm por adição de 2 ml de solução de vitronectina e incubou-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Ao observar através de um microscópio (40X ou 100X), marque as colónias com limites claros usando uma caneta. Remover a solução de vitronectina a partir da nova placa feita no passo 3.3.2 e adicionar 6 mliPSC de meio suplementado com 10 mM de RHO quinase.
- Remover o meio de cultura das células e lavá-los com 3 ml de PBS.
- Adicionar 1 ml de solução de retirar iPSC colónia e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente.
- Remover a solução a partir da placa e incubar-lo à TA durante mais 30 seg.
- Com uma pipeta P200, desenhe 200 mL de mídia da placa e retire as colônias alvejados por pipetagem. Transferir as colônias espalhadas ao novo prato de 100 mm.
- Incubar e manter as células a 37 ° C em 5% de CO 2.
NOTA: Depois de obter uma colónia iPSC pura, as células foram mantidas até que chegaram passagem 10. Caracterização foi feito depois de pelo menos 10 passagens. Diluições de anticorpos e informações iniciador são mostrados nas Tabelas 1 e 2.
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Representative Results
Este protocolo apresenta um método simples para reprogramar CMSPs isolados a partir de sangue. Usando a combinação de chapeamento de série e centrifugação, iPSCs foram geradas com sucesso. Com este método, iPSCs poderia ser gerado com uma pequena quantidade de células de sangue completo, sem isolamento ou a expansão de um tipo de célula específico. Nós com sucesso gerado iPSCs de apenas 1x10 4 células em uma placa de cultura de células pequenas.
Antes de reprogramação, células do sangue foram isoladas usando a mídia de gradiente de densidade. As células do sangue foram transduzidas 5 dias após o isolamento. A Figura 1A ilustra o esquema do método de reprogramação para as células em suspensão. Após o isolamento, as PBMC foram transduzidas com o vírus Sendai contendo factores Yamanaka em um não-revestidos bem. No dia seguinte, as células em suspensão foram colhidas e plaqueadas sobre uma placa revestida com vitronectina utilizando a centrifugação, enquanto que as células ATTdoía ao poço não revestido foram descartados. As células unidas que apareceram na placa revestida com vitronectina foram retidos e expandiu ainda mais. células anexas foram mantidas com mudanças de meio dia usando a mídia da IPSC. O processo de revestimento com centrifugao foi repetido para as restantes células em suspensão.
iPSCs reprogramados podem ser distinguidos pelos seus distintos morfologia de vários dias após a transdução. No entanto, durante a reprogramação, era difícil para expandir as células reprogramadas em uma forma pura. Na fase inicial de reprogramação, os iPSCs foram misturados com células não-ligados reprogramadas diferenciadas (Figura 2A). A seta na Figura 2A mostra os tipos de células-iPSC como na imagem. Antes de expansão, as iPSCs e outras células eram difíceis de discriminar. Portanto, uma colónia única puro foi obtido pelo processo de separação de colónias. Semeando as células em uma baixa densidade, as colónias que foram LObtiveram-se arge suficiente para a colheita, como mostrado na Figura 2B. Após o isolamento da colónia, os aglomerados de células foram dissociadas em células isoladas e cultivadas (Figura 2C). IPSC colónias puras foram visto mais tarde (Figura 2D). Após as iPSCs puras foram expandidas, a qualidade das células foi testada. As células foram coradas com fosfatase alcalina para confirmar o estado indiferenciado do iPSCs (Figura 3A). As colónias derivadas de iPSCs isoladas todas apresentaram coloração positiva. Marcadores pluripotentes foram confirmadas por coloração por imunofluorescência, mostrado na Figura 3B. As células reprogramadas altamente expressa marcadores pluripotentes como SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-81, KLF4, e, mais importante, TRA-1-60. A expressão dos marcadores pluripotentes foi confirmada por RT-PCR, mostrado na Figura 3C. OCT4 e SOX2 foram detectados, tal como mostrado nos dados de fluorescência. marcadores adicionais, tais como NANOG, DPPA5, TDGF1 foram positivEly expressa bem.
Para uma análise mais aprofundada, a análise do cariótipo foi feito. Como mostrado na Figura 4A, os iPSCs gerados mostrou um padrão cromossómico normal. Para confirmar pluripotência verdade, as células foram diferenciadas em ectoderme, mesoderme e endoderme. As iPSCs gerados diferenciadas com sucesso em todas as três camadas germinais, visto na Figura 4B. Uma vez que o vírus Sendai é conhecida pela sua propriedade livre de integração, a remoção do ADN virai é mostrado na Figura 4C. Um em cada três células tendem a ter DNA viral permanecem, mesmo depois de várias passagens. No entanto, o gene integrado foi removível por subclonagem processos.
Em conclusão, nós mostramos um protocolo gerar iPSCs de PBMC flutuantes. O protocolo mostrou elevada eficiência e necessária apenas uma pequena quantidade de sangue. As iPSCs gerados teve alta pluripotência e evitou vi integração ral.
Figura 1: Esquema do protocolo de geração iPSC de PBMC. Um diagrama detalhado do protocolo concebido com base no tipo e forma cronograma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem-campo brilhante de iPSCs gerados a partir de PBMC. (A) a morfologia precoce de células reprogramadas. (B) Imagem de uma colônia antes de escolher. (C) células após o processo de purificação colônia colheita. (D) Morfologia de uma colônia pura. Todas as barras de escala indicam a 200 uM. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: pluripotência das iPSCs gerada a partir de PBMC. As colónias (A) coradas com fosfatase alcalina. (B) Imagem de Fluorescência dos iPSCs gerados. A razão de diluição de anticorpo é apresentada na Tabela 1. Análise (C) por PCR de marcadores pluripotentes. Primer informação é fornecida na Tabela 2. Todas as barras de escala indicam a 200 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4: Uma análise mais aprofundada das iPSCs gerados. (A) karyogram normal do CIPS. (B) Imagem de fluorescência das células após a diferenciação três camadas de germe. (C) Análise de PCR de vectores virais Sendai. As células não transduzidas foram usadas como controlo negativo, e as células colhidas de um dia após a transdução foram usadas como controlo positivo. Primer informação é fornecida na Tabela 2. Todas as barras de escala indicam a 200 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome anticorpo | Concentração |
| SSEA4 | 1: 200 |
| OCT3 / 4 | 1: 100 |
| TRA-1-60 | 1: 200 |
| Sox2 | 1: 100 |
| TRA-1-81 | 1: 100 |
| KLF4 | 1: 250 |
| Alexa Fluor-rato de cabra anti-IgG 488 (H + L), anticorpo | 1: 400 |
| Alexa Fluor 594 IgG de cabra anti-coelho (H + L), anticorpo | 1: 400 |
Tabela 1. diluições do anticorpo.
| Nome alvo | Direção | sequência iniciadora | Tamanho |
| OCT3 / 4 | para a frente | ACC CCT GGT GCC GTG AA | 190 |
| Reverso | GGC TGA ATA CCT TCC CAA ATA | ||
| SOX2 | para a frente | CAG CGC ATG GAC AGT TAC | 321 |
| Reverso | GGA GTG GGA GGA AGA GGT | ||
| NANOG | para a frente | AAA GGC AAA ACT CAA CCC | 270 |
| Reverso | GCT ATT CTT CGG CCA GTT | ||
| LIN28 | para a frente | GTT CGG CTT CCT GTC CAT | 122 |
| Reverso | CTG CCT CAC CCT CCT TCA | ||
| DPPB5 | para a frente | CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT | 215 |
| Reverso | AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC | ||
| TDGF1 | para a frente | TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG | 140 |
| Reverso | AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA | ||
| SeV | para a frente | GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C | 181 |
| Reverso | ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC | ||
| KOS | para a frente | ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC | 528 |
| Reverso | ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG | ||
| KLF4 | para a frente | TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C | 410 |
| Reverso | AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA |
Tabela 2. Informações Primer.
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Discussion
Dado que as células estaminais embrionárias (CES) mostrou várias deficiências, foi necessária a necessidade de uma ferramenta alternativa. Portanto, o desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) por Yamanaka ficou sob os holofotes internacionais. Tem sido quase uma década desde Yamanaka descobriu que pluripotência pode ser induzida pela adição de apenas quatro genes em células somáticas adultas. Desde iPSCs são "induzidos" a partir de células somáticas adultas, eles podem fugir questões éticas que tinham sido uma vez a preocupação quanto a CES. Ao contrário CES, iPSCs pode ser gerada a partir de cada indivíduo. Por conseguinte, eles podem ser utilizados na pesquisa médica personalizado e outros estudos, tais como triagem de drogas, doença de modelagem, ou medicina regenerativa.
O primeiro iPSC humano foi gerado a partir de fibroblastos dérmicos em 2007. Vários grupos reprogramadas com sucesso este tipo de célula, mas um procedimento cirúrgico invasivo foi necessária para obter essa célula primária. Portanto, não era a ideial fonte de geração de vários iPSCs doença ou concepção de medicina regenerativa. Uma alternativa e tipos celulares facilmente obtidos eram necessários, tais como queratinócitos, monócitos e células de urina, de sangue. No entanto, estas células são difíceis de se expandir, e alguns deles têm uma maior chance de contaminação 10.
Neste estudo, foi apresentado um protocolo que pode gerar iPSCs com sucesso a partir de células de sangue inteiras, como PBMCs. Sem qualquer processo de expansão de um tipo de célula específico, este protocolo sugere um método relativamente simples de gerar iPSCs, mesmo a partir de uma pequena quantidade de células sanguíneas primárias. Uma vez que as PBMCs foram isolados a partir do sangue, as células foram estabilizadas em meios de células de sangue durante 5 dias. A etapa de estabilização antes da transdução foi fundamental neste protocolo. A eficiência de reprogramação foi melhor após incubação das células em meios de células de sangue. Este meio foi usado para a expansão de células CD34 +. No entanto, quando as células sanguíneas foram mantidos nesta media durante 5 dias, o número de células era quase idêntica à primeira contagem. Usando células de sangue total, foi difícil para confirmar se as células CD34 + foi expandida. No entanto, o próprio passo de estabilização pareceu ser importante para reprogramação.
Após a transdução, banhado em série as células em uma placa revestida com vitronectina por centrifugação. Originalmente, as células reprogramadas afundou para o fundo do poço após a transdução. Ao impulsionar as células com força mecânica ou centrifugação, as células transduzidas foram capazes de prender e proliferar. No entanto, uma vez que o protocolo utilizado células do sangue total, metade das tentativas de ensaios com amostras diferentes, resultou em vários tipos de morfologias, quando expandido. Portanto, isolamento de colónias IPSC puros pela colônia colheita foi fundamental neste protocolo. As células expandidas a partir da colónia isolada mostrou todas as características de um iPSCs puros.
Apesar de outros benefícios, iPSCs possuemvários obstáculos a ultrapassar. Uma vez que vários fatores Yamanaka são conhecidos oncogenes, há preocupações de que iPSCs podem se desenvolver em tumores in vivo. Portanto, é importante que as células reprogramadas têm nenhuma expressão do gene exógeno remanescente por integração. Nos primeiros anos após o desenvolvimento de iPSCs, vírus, tais como retrovírus e lentivírus, foram usadas para reprogramação. A taxa de reprogramação foi sucesso de altura, no entanto, esses vírus necessária integração aleatória no genoma da célula. Por esta razão, vários outros métodos têm sido desenvolvidos. Os vírus como vírus Sendai são conhecidos para transduzir as células sem integração, e outros métodos que utilizam pequenas moléculas e vectores epissomais foram desenvolvidos como bem. Neste estudo, foram utilizados vírus Sendai para a reprogramação. A taxa de integração foi relativamente baixo em comparação com os lentivírus. Nós também confirmou que houve alguns componentes virais restantes nos iPSCs gerados. Um em cada três ensaios resultaram em integratião, mesmo após 15-20 passagens. No entanto, esta integração foi removível por subclonagem as colónias derivadas de uma única célula. Na nossa experiência, a densidade para se obter uma colónia saudável derivada de uma única célula foi 1x10 4 culas por prato de 100 mm. As colónias que resultaram em uma forma circular perfeita foram escolhidas e expandida para PCR re-confirmação dos componentes virais remanescentes. As colónias derivadas de células não-integrados foram mantidas para posterior utilização. Uma vez apagadas, as células mantiveram o estado não-integrado.
Neste estudo, sugerem um protocolo para a reprogramação das células sanguíneas. Adicionamos vários passos, tais como chapeamento e centrifugação de série, para aumentar a taxa de reprogramação das células flutuantes. Este método foi feita com PBMC e as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMCs). Este protocolo foi usado para gerar iPSCs homozigotos em instalações GMP na Coreia do Sul. O nosso grupo aguarda com expectativa a aceleração do processo de reprogramação iPSC usandonosso protocolo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 ml Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
