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Cancer Research

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

doi: 10.3791/54657 Published: November 30, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Los pacientes con un número limitado de metástasis hepáticas y bajas tasas de progresión pueden ser tratados con éxito con el tratamiento local se aproxima a 1,2. Sin embargo, poco se sabe acerca de la heterogeneidad de las metástasis hepáticas, y se necesitan modelos animales capaces de evaluar el desarrollo de las colonias metastásicas individuales. A continuación, presentamos un modelo avanzado de las metástasis hepáticas que proporciona la capacidad de visualizar cuantitativamente el desarrollo de clones individuales del tumor en el hígado y estimar su cinética de crecimiento y la eficiencia de la colonización. Hemos generado un panel de derivados monoclonales de células de cáncer colorrectal humano HCT116 de forma estable con la etiqueta luciferasa y tdTomato y que poseen diferentes propiedades de crecimiento. Con una inyección esplénica seguido de una esplenectomía, la mayoría de estos clones son capaces de generar metástasis hepáticas, pero con diferentes frecuencias de la colonización y diferentes tasas de crecimiento. Uso de la Syste In Vivo Imagingm (IVIS), es posible visualizar y cuantificar el desarrollo de metástasis con luminiscente in vivo y ex vivo de imagen fluorescente. Además, Diffuse luminiscentes tomografía (DLIT) proporciona una distribución 3D de las metástasis hepáticas in vivo. Ex vivo de imágenes de fluorescencia de hígados cosechadas proporciona mediciones cuantitativas de colonias metastásicas hepáticas individuales, lo que permite la evaluación de la frecuencia de colonización hígado y la cinética de crecimiento de metástasis. Puesto que el modelo es similar a metástasis hepáticas clínicamente observados, puede servir como una modalidad para la detección de genes asociados a metástasis de hígado y para probar posibles tratamientos ablativos o adyuvante para la enfermedad metastásica de hígado.

Introduction

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Los pacientes con metástasis hepáticas de los cánceres primarios de colon (CRC) se caracterizan por un mal pronóstico. La tasa de supervivencia a 5 años para los primarios no metastásicos CRC (estadios I - III) se estima en un 75 - 88% 3,4, mientras que los pacientes con metástasis hepáticas (estadio IV) tienen una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 8 - 12% 5 , 6. Sin embargo, los pacientes metastásicos representan un grupo heterogéneo presentando con diferente número de metástasis y recurrencia diferentes momentos. Las observaciones clínicas indican que el número de metástasis (que puede ser proporcional a la capacidad de colonización o la frecuencia de colonización) y el tamaño de cualquier metástasis única (proporcional a la tasa de crecimiento local) son factores pronósticos independientes 1,7. En otras palabras, el éxito de clones metastásicos que colonizan el hígado depende de dos propiedades principales: su capacidad para crecer y su capacidad para difundir y sobrevivir en el microambiente de hígado.

El diseñode modelos clínicos exitosos con la capacidad de capturar y cuantificar las propiedades de clones metastásicos puede mejorar drásticamente nuestra comprensión de la biología del hígado metástasis y proporcionar una herramienta eficaz para el diseño de posibles enfoques terapéuticos. Modelos de metástasis hepática experimental se ha informado anteriormente 8,9, pero ninguno de ellos siempre que la capacidad de capturar y describir las propiedades de clones metastásicas individuales tanto in vivo como ex vivo cuantitativamente.

A continuación, presentamos un nuevo modelo, avanzada de la metástasis hepática que incluye la generación de clones tumorales con diferentes eficiencias de colonización del hígado y propiedades de crecimiento. Empleamos una combinación de de doble etiquetado de las células cancerosas con la luciferasa y la proteína fluorescente tdTomato con la generación de líneas de células monoclonales que tienen diferencias intrínsecas en la capacidad metastásica. En este modelo experimental, los datos indican que el desarrollo demetástasis hepáticas pueden ser descritos en términos de frecuencia de colonización y el tiempo de duplicación (Td), que es coherente con las observaciones clínicas. La naturaleza cuantitativa de este modelo hace que sea fácil adopción para el descubrimiento de fármacos y diagnóstico.

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Protocol

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Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Chicago (Protocolo # 72213-09) y llevaron a cabo en condiciones estériles.

1. Preparativos

  1. Hacer 500 ml de medio para el cultivo de las células tumorales HCT116: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
  2. Autoclave los instrumentos que pueden utilizarse para el modelo de inyección bazo, incluyendo 3 - 4 toallas quirúrgicos, gasas, dos pastillas Adson pequeños, un conductor de la aguja, dos pares de tijeras, una pequeña pinza, y 3 microclips, a 251 ° F durante 20 minutos .
  3. Preparar anestesia postoperatoria de los ratones, a ser administrado por vía subcutánea después de la inyección bazo. Diluir de 2 - 4 mg de buprenorfina en 500 l de solución salina normal al 0,9 por ratón.
  4. Preparar alícuotas de 150 mg / 150 ml de luciferina de luciérnaga para inyecciones intraperitoneales During los ensayos de bioluminiscencia. Almacenar a -20 ° C y proteger de la luz.

2. Generación de marcadas con tdTomato luciferasa / Líneas celulares monoclonales 10,11

  1. Descongelar y mantener las células cancerosas HCT116 humanos colorrectales y 293FT células de riñón de embriones humanos en DMEM con 10% de SFB, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Mantener en cultivo a 5% de CO2 y 37 ° C.
  2. Producir un lentivirus alto título.
    1. En D 1, la placa de 10 - 12 x 10 6 293FT células entre el paso 3 y 10 en 15 cm placas de cultivo celular en 18 ml de DMEM completo (cDMEM) con 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales . Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2.
    2. En D2, transfectar las células utilizando la siguiente solución de transfección:
      1. Para cada plato, utilice la siguiente: una mezcla de ADN de 37,5 g de pFUG vector lentiviral insertado con la luciferasa (Luc2) y tdTomatoconstruye 11 (un regalo del doctor Geoffrey Greene en la Universidad de Chicago), 25 g de pCMVΔ8.74, y 12,5 g de pMD2.G se volvieron a suspender en un total de 1.062 l de H2O estéril Añadir 188 l de 2 M de CaCl2.
      2. Añadir 1,250 l de solución salina tamponada con Hepes 2x (HBS, HEPES 50 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, y NaCl 180 mM, pH 7,12) a la solución de ADN / CaCl 2, una gota a la vez, mientras que las burbujas que soplan a través de la solución con una pipeta.
      3. Incubar a TA durante 20 min, y a continuación, añadir 15,5 ml de RT cDMEM y cloroquina para hacer una concentración final de 25 mM.
    3. Aspirar los medios de comunicación en cada plato de 293FT células y reemplazar con la solución de transfección. Añadir 16 ml de la solución de transfección lentamente, como las células cultivadas en placas desprendan fácilmente.
    4. En el día 3, después de las 8 - 16 horas, se retira la solución de transfección y se lavan las células una vez con Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS), de nuevo taking cuidado de no desalojar las células. Reemplazar los medios de comunicación con 18 ml de cDMEM fresca con Hepes 10 mM.
      NOTA: mueva lentamente platos, aspirar la solución de transfección, y añadir los medios de comunicación a través de la pared lateral de las placas de modo que no se desprenda de las células.
    5. En D 4, a las 48 h desde el momento de la transfección, recoger los medios de comunicación de los platos mediante la aspiración lentamente con una pipeta a fin de no desalojar las células. Centrifugar los medios recogidos a 300 xg durante 5 min para precipitar los restos celulares grandes.
    6. Filtrar el sobrenadante viral utilizando un 0,45 micras de baja unión a proteínas matraz de filtración y se centrifuga usando un rotor SW-28 durante 2 horas a 50.000 xg y 4 ° C. Se decanta el sobrenadante inmediatamente después de que finalice centrifugación y secar el interior del tubo del compartimiento de carga.
    7. Resuspender el sedimento viral en 50 l de medio de suero reducido (RSM) con 1% de FBS. Las alícuotas se pueden almacenar a -80 ° C para su uso futuro (Stock viral).
  3. Transducir la lentivirusES en las células HCT116 y generan un panel de clones tdTomato-positivos.
    1. Placa de las células HCT116 a una densidad de 1 x 10 5 en placas de 24 pocillos 1 d antes de la infección viral.
    2. Diluir 40 l de virus resuspendido (de 2.2.7) en 4 ml de RSM (dilución 1: 100) con 1% de penicilina / estreptomicina y 8 mg / ml de polibreno (CRSM).
    3. En el día de la infección, se lavan las células una vez con DPBS, y a continuación, añadir 250 l de virus diluido desde el paso 2.3.2 a cada pocillo. Se incuba durante 4 horas a 37 ° C y CO 2 al 5% y, a continuación, añadir 1 ml de cDMEM a cada pocillo; incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 48 - 72 h.
    4. Resuspender las células con 1 ml de tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM, y después se añade 1 ml de cDMEM para neutralizar la tripsina. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga y pellet a 300 xg durante 4 min. Lavar el sedimento 3 veces en 1 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) más 2% de FBS.
    5. Resuspender el precipitado de la etapa 2.3.4con tampón FACS (2% FBCs y EDTA 2 mM en PBS) en una suspensión de una sola célula a 1 x 10 6 células / ml.
    6. Ordenar las células HCT116 tdTomato positivos utilizando un clasificador celular, apertura de puerta de células PE positivas (excitación / emisión: 556/585 nm). Cultivar las células recogidas en una placa de 10 cm a 5% de CO2 y 37 ° C para generar células HCT116 tdTomato positivo parentales (Figura 1A).
    7. Resuspender las células HCT116 tdTomato-positivo de los padres de 2.3.6 con 8 ml de tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM durante 3 - 5 min, y luego añadir 8 ml de cDMEM para neutralizar la tripsina.
      1. Transferir las células a un tubo y pellet 50 ml a 300 xg durante 4 min. Eliminar el sobrenadante y diluir las células HCT116 tdTomato-positivo de los padres a 1 célula por cada 200 l en cDMEM (Figura 1B).
    8. Placa de una sola célula (200 l de la dilución) por pocillo en una placa de 96 pocillos a 5% de CO2 y 37 ° C (Figura 1C).
    9. Crecer monoclones individuales en matraces a 5% de CO2 y 37 ° C. (Figura 1D).

3. calibrar la intensidad fluorescente de la señal en función del número de la célula

  1. Placa de las células HCT116 transfectadas, que ahora se conoce como HCT116-L2T, a una densidad de 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 y 10 5 células / pocillo en placas de 96 pocillos por triplicado para cada densidad.
  2. Después de 5 h de incubación, cuantificar los tdTomato intensidad de fluorescencia utilizando IVIS 10.
    1. Haga clic en el icono de la imagen del software en el escritorio para iniciar el software. Haga clic en el botón "Iniciar" para iniciar el sistema de imágenes. Una vez finalizada la inicialización (que dura unos pocos minutos), seleccione, "4 segundos" tiempo de exposición, hurgar en la basura "Fluorescencia" "Medium", "2" F / parada, "535" filtro de excitación,y el filtro de "580" emisión.
    2. Coloque la placa de 96 pocillos en la estación de formación de imágenes y haga clic en "Adquirir" para iniciar la imagen. Después se adquiere la imagen, haga clic en "Herramientas" retorno de la inversión en la paleta de herramientas y seleccione 12 x 8 desde el icono de hendidura.
    3. Crear 12 x 8 ranuras para cubrir el área de la señal en la imagen de la placa de 96 pocillos y haga clic en la pestaña mediciones. Observar una ventana con una tabla de mediciones de ROI con las unidades de fotones por s por estereorradián por cm cuadrado (fotones / s / sr / cm2).
  3. Construir un diagrama de dispersión con el argumento (eje X) igual al número de las células y la función (eje Y) que representa la intensidad de la señal. Calcule curvas de regresión usando un software de análisis de datos para calcular la cantidad de celdas correspondientes a la unidad de intensidad de fluorescencia (Figura 2) 10.

4. Modelo Animal de metástasis hepáticas

  1. Una vez que las células HCT116-l2t llegan a 70- 80% de confluencia, prepararlos aproximadamente 1 h antes de la inyección bazo. Disociar las células utilizando tripsina al 0,05% en EDTA 0,53 mM durante 3 - 5 min, y después neutralizar con una cantidad igual de cDMEM. Asegúrese de pipeta a fondo para evitar la formación de grumos.
  2. Contar las células con un contador de células automático.
  3. Resuspender las células en 1x DPBS hasta una concentración de 1,2 - 2 x 10 6 células / 100 l. Asegúrese de pipeta y resuspender las células a fondo para evitar la formación de grumos.
  4. Mantener las células en hielo hasta la inyección, de vez en cuando resuspendiéndolas en el tubo.
  5. Antes de anestesiar a los ratones, proporcionar un anestésico preoperatorio y bolo de líquido por inyección subcutánea de 500 l de la mezcla de la buprenorfina se describe en el paso 1.3. Administrar la misma dosis de buprenorfina mezcla adicional de dos veces al día hasta que los signos de dolor (movilidad reducida, estatura encorvada, ausencia de limpieza, la vocalización cuando se maneja) han resuelto.
  6. Anestesie de 6 a 8 semanasratones atímicos hembra -old desnuda con 2% de isoflurano en oxígeno en una cámara de anestesia. Confirman que los ratones son completamente bajo anestesia pellizcando la cola. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Transferir cada ratón anestesiado con un cono de nariz individual para la inyección bazo. Antes de la incisión, cada ratón se debe cubrir con un paño quirúrgico estéril.
  7. Identificar el bazo como un área púrpura visto externamente a través de la piel en el flanco izquierdo de los ratones desnudos. Con unas tijeras de microdisección, hacer una incisión en el costado izquierdo de 8 mm en la piel justo por encima del bazo.
    1. A continuación, levante la pared abdominal y hacer una pequeña incisión. Permitir que el aire en la cavidad abdominal a fin de que los órganos internos se alejan de la zona de la incisión. Agrandar la incisión de la pared abdominal a aproximadamente 5 mm.
    2. Exponer el bazo mediante la aplicación de una suave presión alrededor de la incisión con un hisopo de algodón. Si es necesario, la grasa de páncreas puede ser suavemente hombreipulated para ayudar con la exposición a fin de no lesionar el bazo.
  8. inyectar lentamente 100 l de células por medio de una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G en la punta del bazo expuesta. Inyectar lentamente, durante un período de al menos 30 - 60 s, para evitar los tumores de hígado extra.
  9. Colocar un microclip en el bazo antes de retirar la aguja al final de la inyección para evitar la fuga de la suspensión celular inyectada.
  10. Deje el microclip en su lugar durante 5 minutos.
  11. 5 minutos después de la inyección, lleve a cabo una esplenectomía utilizando un dispositivo de cauterio de mano para la hemostasia. Diseccionar el hilio esplénico, a partir de la cara anterior. Cuando la disección de los vasos grandes, pre-coagular el lado proximal de los vasos con el tejido adiposo adyacente, usando cauterio para evitar el sangrado excesivo.
    NOTA: Los métodos para la hemostasia: coagulan el punto de sangrado directamente con cauterio, aplique presión en el punto de sangrado durante 3 - 5 min, o sutura ligar el punto de sangrado con una corbata de seda 5-0. Cierre la incisión en el flanco de cada ratón en dos capas. En primer lugar, cierre de la pared abdominal con sutura absorbible 5-0 trenzada (por ejemplo, vicryl) en una sola puntada horizontal. A continuación, cerrar la piel mediante una sutura de monofilamento no absorbible 4-0 (por ejemplo, prolene), de nuevo con una única puntada horizontal.
  12. Limpiar todos los instrumentos mediante pulverización isopropanol al 70% para mantener las condiciones estériles entre cada procedimiento.
    NOTA: Asegúrese de que los animales se calientan mientras se despiertan de la anestesia. Supervisar todos los ratones después de la operación hasta que se convierten ambulatoria y retorno a la actividad normal. Típicamente, el tiempo de recuperación es de aproximadamente 3 - 5 min. No deje los animales sin vigilancia hasta que hayan recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.

5. En Vivo bioluminiscente de imágenes

  1. Realizar las imágenes enuna vez por semana para medir y cuantificar los cambios en la bioluminiscencia con el tiempo.
  2. Coloque los ratones en una cámara de anestesia y anestesiar con 2% de isoflurano en oxígeno. Confirman que los ratones son completamente bajo anestesia pellizcando las colas. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
  3. A continuación, por vía intraperitoneal inyectar cada ratón con 150 l de la preprepared luciferina de luciérnaga desde el paso 1.4.
  4. Coloque los ratones en una IVIS con conos delanteros individuales administración de isoflurano. Coloque los ratones en la posición supina con los espaciadores en el medio para reducir al mínimo la señal a ratones adyacentes. Un máximo de cinco ratones puede ser proyectado en una sola vez.
  5. Medir y analizar las intensidades bioluminiscentes 3 min después de la inyección luciferina.
    1. Después de inicializar el IVIS como se describe en el paso 3.2.1, seleccione "luminiscente", "1 segundos" tiempo de exposición, y hurgar en la basura "Medio".
    2. Haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imagingramo. Asegúrese de realizar cada imagen a la vez coherente (3 min) después de la inyección luciferina.
    3. Después se adquiere la imagen, aparecerá una ventana de imagen y la paleta de herramientas. Haga clic en "Herramientas de ROI" y seleccione "1", "2", "3", "4" o "5" en el icono de círculo, que corresponde al número de ratones fotografiados.
    4. Para definir regiones de interés (ROI), un círculo alrededor del área de la señal de la señal luminiscente en la cavidad abdominal del ratón, y luego haga clic en "mediciones" del retorno de la inversión como una unidad arbitraria de la eficiencia radiante ((fotones / s / cm2 / estereorradián) / (mW / cm 2)). Asegúrese de tener un círculo de retorno de la inversión adicional del fondo.
  6. A las cuatro semanas después de la inyección y antes del sacrificio de los animales, realice difusa luminiscentes de imágenes de Tomografía (DLIT) usando IVIS para evaluar la carga tumoral y la distribución por la reconstrucción 3D en tiempo real de las intensidades bioluminiscentes de colonias tumorales individuales. Anestesiar los ratones y se inyecta luciferina, como se describe en el paso 5.2.4. DLIT se realiza en un ratón a la vez.
  7. Después de inicializar el IVIS, tal como se describe en el paso 3.2.1, seleccione "Asistente de imagen", "bioluminiscencia", y haga clic en "Siguiente". Seleccione "DLIT" y haga clic en "Siguiente". Seleccionar sondas "Firefly" y haga clic en "Siguiente". Seleccionar objeto "ratón" de la imagen, el parámetro "Auto" de la exposición, el campo "C-13 cm" de vista, y "0,5 cm" altura de tema, y ​​haga clic en "Siguiente". Haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imágenes.
  8. Después se adquiere la imagen, seleccionar la pestaña "Reconstrucción DLIT 3D" y el "Analizar" ficha y haga clic en "Reconstruir" para generar la imagen de reconstrucción 3D.
  9. Haga clic en "Herramientas" y "Animación 3D". Seleccione "CCW Girar el eje Y" en la ventana de animación 3D. Haga clic en "Grabar" y "Guardar" en un archivo de formato .mov.

6. ex vivo de imágenes fluorescentes

  1. Sacrificar a los ratones por dislocación cervical, mientras anestesiado, o de acuerdo con las directrices institucionales a las 4 - 6 semanas después de las inyecciones de bazo.
  2. Se recoge el hígado. Hacer una incisión horizontal de izquierda a flanco derecho. Agarrando el proceso xifoides con una pastilla, diseccionar el falciforme, la vena hepática y la vena cava inferior.
    1. Diseccionar el ligamento hepatorrenal derecha, el ligamento hepatoduodenal, y el ligamento hepatorrenal la izquierda, teniendo cuidado de no dañar el lóbulo caudado, mientras que la disección del ligamento hepatoduodenal. Después de cosechar el hígado, extraer la vesícula biliar, ya que esto mostrará autofluorescencia. Tome nota de los tumores de hígado supletoria adicional presente.
  3. Tome nota de los números y los tamaños de los tumores hepáticos presente macroscópicamente, y colocar los hígados cosechados en DPBS.
    NOTA: Los tumores son macroscópicamente visible para el ojo desnudocomo tumores blancos (para un ejemplo representativo, véase la Figura 4).
  4. Antes de la colocación en la hoja de formación de imágenes, tome cada hígado y eliminar cuidadosamente el exceso de líquido por transferencia sobre una toalla de papel.
  5. Medir la intensidad de fluorescencia de cada colonia tumor usando el IVIS.
    1. Seleccione "fluorescencia", "4 segundos" tiempo de exposición, hurgar en la basura "Medium", "2" F / parada, "535" filtro de excitación, y el filtro de emisión "580". Haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imágenes.
    2. Tras la adquisición de la imagen, busque la ventana de la imagen y la paleta de herramientas. Haga clic en "Herramientas de ROI" y seleccione "1" en el icono de círculo. Para definir regiones de interés, un círculo alrededor del área de la señal de colonias tumorales individuales en la imagen, y luego haga clic en "mediciones" del retorno de la inversión como una unidad arbitraria de la eficiencia radiante ((fotones / s / cm2 / estereorradián) / (mW / cm2) ). Asegúrese de tener un círculo de retorno de la inversión adicional del fondo.
    3. Calcular el volumen total del tumor suponiendo que sea una esfera. El volumen del tumor = 4 x π xr 3/3 (r = radio). Calcular la fracción de células formadoras de colonias tumor (FC) como el número de tumores en el hígado dividido por el número de células splenically inyectado.
    4. Calcular el número total de células por colonia (= X) de la aproximación lineal de la etapa 3.3. Calcular el número de divisiones celulares (= Y) como Y = log 2 X y la Td como Td (día) = 28 / Y.

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Representative Results

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El objetivo de este experimento fue establecer un modelo animal consistente y fácilmente reproducible con el potencial para la cuantificación de serie de la carga tumoral metastásica in vivo y para la estimación de la frecuencia de colonización y la cinética de crecimiento de desarrollar metástasis hepáticas. Figuras 2-6, con leyendas, están provistos de nuestra publicación anterior bajo una licencia Creative Commons CC-BY 10.

Generación de Monoclones Doble etiquetado de células tumorales

En primer lugar, un panel de luminiscente y líneas de células monoclonales marcados con fluorescencia se generó con capacidades diferentes metastásicos. Después de la transfección con éxito de luminiscente (Luc2) y proteínas fluorescentes (tdTomato) en células de cáncer de colon HCT116 los padres, 16 monoclones doble etiquetado se generaron por dilución de la HCT1 parentalCélulas 16-l2t a 1 célula / 200 l en placas de 96 pocillos (figura 1) 10. In vitro de fluorescencia y luminiscencia de HCT116-L2T se cuantificaron utilizando una cantidad cada vez mayor de células para estimar el número de células tumorales de in vivo y ex vivo de imágenes de tumores de hígado (Figura 2) 10.

Desarrollo metástasis por clones con diferencial de hígado Colonización

A continuación, para generar metástasis hepáticas, los 16 clones generados previamente HCT116-l2t individuales se inyectaron intraesplénicamente en ratones; Después se realizó una esplenectomía. El desarrollo de las metástasis hepáticas se controló mediante formación de imágenes in vivo semanal bioluminiscente, seguido de formación de imágenes ex vivo fluorescente después de sacrificar los ratones. Fuera de los 16 monoclones generados, se seleccionaron clones designados como P1, P2, O1, y O2, debido a su different observó capacidad de colonización y crecimiento en el hígado. Los clones O1 y O2 tenían una carga tumoral más pequeña, lo que representa clones "oligometastásica", y, potencialmente, una recapitulación de un fenotipo de enfermedad metastásica limitada. Los clones P1 y P2 tenían una carga tumoral mayor, lo que representa una amplia difusión, que también se conoce como enfermedad polymetastatic. La bioluminiscencia fue mayor en el P1 y ratones P2 (6,7 × 10 6 ± 4,7 × 10 6 y 3,6 × 10 6 ± 2,5 × 10 6 fotones / s / cm 2 / estereorradián) en comparación con los ratones O1 y O2 (2,0 × 10 5 ± 1,3 × 10 5 y 1,7 × 10 5 ± 9,1 × 10 4 fotones / s / cm2 / estereorradián) 3 semanas después de la inyección del bazo (Figura 3A, B) 10. La cuantificación de la fluorescencia ex vivo de los hígados a las 4 semanas después de la inyección bazo demostrado que P1 y P2 hígados tenían LUZ FLUORESCENTE mayoresintensidades ciento en comparación con hígados O1 y O2 (Figura 3C). Las distribuciones de tumor en las imágenes ex vivo fluorescentes fueron consistentes con los hallazgos macroscópicos (Figura 3C, D) 10.

La colonización y la cinética de crecimiento de los diferentes clones

Los números y tamaños de los tumores macroscópicamente visualizados se contaron y se miden en cada hígado individual. Además, ex vivo de formación de imágenes de fluorescencia se realizó en cada colonia tumor individual para cada monoclone (Figura 4) 10. El número total de tumores en P1 era mayor, en comparación con P2, O1, y O2, mientras que el tamaño de los tumores fue mayor en P2 que en P1, O1, y O2 (p <0,001; Figura 5A, B) 10. Sin embargo, el volumen total del tumor en el hígado en P1 y P2 era más grande en comparación con O1 y O2 (Figura 5C) 10-5 ± 1,1 × 10-5, 6,0 × 10-6 ± 2,3 × 10-6 en P1 y O1, respectivamente, p <0,001; Figura 5D) 10. Aunque P2 tenía una capacidad similar para colonizar el hígado como clones O1 y O2, el tamaño de los tumores generados era más grande que los otros clones. El número total de células por colonia tumor, el TD, y el número de divisiones celulares se puede calcular a partir de estos datos mediante el uso de la calibración previamente genutilizar desde la correlación entre intensidad de fluorescencia y el número de células (Figuras 2 y 5E - G) 10. P1, que generaron muchos tumores pequeños en el hígado, como se ve por inspección visual macroscópica, tenía un Fc más grande, a pesar de que tenía un Td similar a O1 y O2 (p <0,05). P2, lo que generó un número limitado de tumores grandes macroscópicas, tenía un Fc similar pero un Td más corto en comparación con O1 y O2 (p <0,05). En conjunto, estos resultados indican que la Fc y Td son dos parámetros clave que contribuyen a potencial metastásico.

La distribución 3D de los tumores metastásicos en el hígado fue demostrado por DLIT (Figura 6) 10. Usando esta técnica de formación de imágenes, es posible para controlar el comportamiento dinámico espacial-temporal de las metástasis mediante la detección y medición de la bioluminiscencia de las colonias metastásicas hepáticas individuales.

Los datos generados fueron analizados utilizando el software de análisis de datos estándar, y las barras de error se demostraron como la media ± desviación estándar. Los coeficientes de correlación de Pearson se utilizaron para evaluar las asociaciones entre parámetros. Los valores de p fueron evaluados mediante pruebas t de Student de 2 colas, con un p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Figura 1
Figura 1:. Generación de un grupo especial de Monoclones de células HCT116 marcado (a) Se cultivan las células HCT116 los padres marcadas con luciferasa y tdTomato. (B) Diluir las células HCT116 los padres a 1 célula / 200 mL. (C) de la placa 200 l de la dilución en una placa de 96 pocillos. (D) Crecer monoclones de cada pocillo de la placa de 96 pocillos. (E) Inyectar monoclones intraesplénicamente en ratones para generar metástasis hepáticas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: La imagen luminiscente de diferentes números de células por triplicado en una placa de 96 pocillos de estimación de la cantidad de células por fluorescentes intensidades (A).. (B) La correlación entre el número de células y la luminiscencia (R = 0,99, p <0,0001). La barra de escala representa la intensidad luminiscente (fotones / s / cm2 / estereorradián). (C) La imagen fluorescente de diferentes números de células por triplicado en una placa de 96 pocillos. intensidades nosotrosre adquirida como eficiencias radiantes con una excitación de 535 nm y una emisión de 580 nm. (D) La correlación entre el número de células y la fluorescencia (R = 0,99, p <0,0001). La barra de escala representa la intensidad de fluorescencia en una unidad arbitraria de la eficiencia radiante ((fotones / s / cm2 / estereorradián) / (mW / cm2)). Reproducido con permiso 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: La bioluminiscencia y E x Vivo fluorescencia del hígado en clones seleccionados (A) imágenes bioluminiscentes representativos.. La barra de escala representa int luminiscenteensity (fotones / s / cm2 / estereorradián). (B) La bioluminiscencia medido semanal de 1 - 3 semanas en P1 y P2, y 1 - 4 semanas en O1 y O2. Los datos se representan como la media ± desviación estándar. (C) Representante ex vivo imágenes fluorescentes de hígados. Las intensidades fueron adquiridos como eficiencias radiantes con una excitación de 535 nm y una emisión de 580 nm. La barra de escala representa la intensidad de fluorescencia en una unidad arbitraria de la eficiencia radiante ((fotones / s / cm2 / estereorradián) / (mW / cm2)). (D) Imágenes de hígado macroscópicas (las flechas indican tumores pequeños blancos). P1 y P2: clones polymetastatic, O1 y O2: clones oligometastásica. Reproducido con permiso 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 4:. La cuantificación de las intensidades de fluorescencia de las colonias individuales de hígado Imágenes de la izquierda son representativos hallazgos macroscópicos e imágenes de la derecha son intensidades fluorescentes en cada clon. Las intensidades fluorescentes fueron adquiridas como las eficiencias radiantes con una excitación de 535 nm y una emisión de 580 nm. P1 y P2: clones polymetastatic, O1 y O2: clones oligometastásica. Reproducido con permiso 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. Estimación cuantitativa de los colonizadores capacidad y la cinética de crecimiento ( (B) tamaño macroscópico de tumores individuales, (C) calcula el volumen total del tumor en el hígado, (D) colonizando fracción de células formadoras de colonias del tumor (Fc), (E) número total de células por colonia, (F) el tiempo de duplicación (Td) y el número (G) de divisiones celulares de cada clon. P1 y P2: clones polymetastatic, O1 y O2: clones oligometastásica. Los datos se representan como la media ± desviación estándar para todos los paneles de la figura en la que se muestran las barras de error. Reproducido con permiso 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Quantificatiel de la bioluminiscencia de colonias tumorales individuales utilizando la tomografía difusa luminiscentes (DLIT). vista aérea (A) 3D. La barra de escala representa la intensidad de fluorescencia en una unidad arbitraria de la eficiencia radiante. (B) Corte coronal. (C) sagital sección. Sección (D) Transaxial. (E) imagen macroscópica de hígado. (F) Ex vivo imagen fluorescente del hígado. Reproducido con permiso 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El modelo animal presentado en el informe actual se basa en dos enfoques principales. En primer lugar, a fin de garantizar la capacidad de observar clones metastásicos con diferentes propensiones a colonizar y proliferar en el hígado, se estableció un panel de líneas celulares monoclonales altamente heterogéneos, en lugar de una línea celular de cáncer no fraccionada establecido 12,13. El enfoque monoclonal para el desarrollo de la metástasis es justificado por los datos genómicos últimos 14 y fue utilizado con éxito anteriormente para modelar el proceso metastásico 10,15,16. En segundo lugar, de doble etiquetado de la línea celular parental por los marcadores de luciferasa y tdTomato fue incorporado con el fin de proporcionar un análisis mejorado de crecimiento metastásico tanto in vivo como ex vivo. El luminiscente y etiquetado fluorescente permite para un examen anatómico detallado y el potencial cuantificación tanto de la cantidad de tumores metastásicos (considerado como la frecuencia o la eficacia de colonizatio hígadon) y el tamaño de cualquier colonia individual. Este último se puede convertir fácilmente a un número real de células por medio de un procedimiento de calibración sencilla se describe en el paso 2 y las Figuras 2 y 10 4 10. Utilizando estos datos, es posible estimar la Td para cada nodo metastásico en el hígado y para evaluar la cinética de crecimiento de metástasis en el hígado para cada monoclone inicial inyectada (Figura 5) 10.

Se observaron tres fenotipos diferentes colorrectal metastásico en este sistema experimental, designado como P1, P2, y O1 / O2. Estos fenotipos metastásicos diferían cuando se comparan los datos de frecuencia de colonización y las tasas de crecimiento locales para cada clon metastásico. La primera fenotipo metastásico, P1, demostró una mayor capacidad para colonizar el hígado, pero una tasa de crecimiento local relativamente baja, que corresponde a muchos pequeños tumores metastásicos en todo el hígado. El segundo fenotipo metastásico, P2, teníauna menor frecuencia de colonización, pero una tasa de crecimiento local significativamente mayor, lo que resulta en un número relativamente pequeño de grandes tumores secundarios. Por último, el tercer fenotipo metastásico, O1 y O2, demostró tanto una baja frecuencia de colonización y las tasas de crecimiento lentas locales. Esta tercera fenotipo metastásico se puede considerar como una representación de clínicos de enfermedad hepática oligometastásica (Figuras 3 y 10 5 10). Además, el análisis de la expresión génica comparando estos clones 10 identificadas diferencias significativas en los patrones de expresión. Por ejemplo, al comparar con P1 O1 y O2 clones, había 756 genes expresados ​​diferencialmente, incluyendo un subconjunto de los genes implicados en las respuestas inflamatorias y la señalización de interferón. Este estudio, así como otros, han implicado a estos genes en jugar un papel clave en el crecimiento del tumor y la supervivencia 21, 22. Además, al comparar P2 a O1 y O2, había 461 diferencialmente explícitod genes, con la participación de un subconjunto de genes críticos para el crecimiento celular y la proliferación mediada a través de señalización ERK1 / 2.

La diversidad de fenotipos metastásicos producidos por este modelo experimental es consistente con las representaciones clínicos observados de heterogeneidad metastásico. Por ejemplo, se ha demostrado que el tamaño de las metástasis hepáticas (un parámetro relacionado con el potencial de crecimiento) y sus números (un parámetro relacionado con la capacidad de colonización) son factores de riesgo independientes de metástasis a distancia 1. Con el potencial de crecimiento mejorada o capacidad de colonización, las propiedades observadas en P1 y P2 son consistentes con estos datos. Además, recientes observaciones de los pacientes tratados con corporal estereotáctica Radio-terapia (SBRT) o con metástasis pulmonar resecado quirúrgicamente apuntan tanto al número de tumores y la tasa de progresión como factores clave que determinan general y los resultados libres de la enfermedad 17,18. Por lo tanto, la colonización y el crecimiento habilidades parecenser uno de los factores más críticos para determinar el desarrollo de clones metastásicos en sitios distantes 19,20. Los modelos experimentales, que se basan en estas propiedades de clones metastásicos, pueden proporcionar herramientas útiles para la comprensión de los mecanismos de desarrollo de metástasis, así como proporcionar un medio para el ensayo de nuevas modalidades de tratamiento para la curación de la enfermedad metastásica hígado.

Mientras que un modelo ortotópico capaz de producir metástasis espontáneas es ideal, sigue habiendo una escasez de modelos espontáneos fácilmente reproducibles y consistentes. Aunque se han descrito modelos que utilizan implantación intracecal o inyecciones, demostraron tasas variables de absorción y la metástasis formación 23-26. Otros métodos han utilizado un enfoque de implantación ectópica por inyección el interior del bazo o intraportal para generar metástasis hepáticas. Si bien la técnica general de la inyección es el mismo, el modelo presentado aquí proporciona un enfoque sensible a understanding los mecanismos de desarrollo de metástasis, a partir de la etapa de células tumorales circulantes (CTC). Sensibilidad y reproducibilidad de nuestro enfoque se determina por el doble etiquetado de las líneas celulares para permitir tanto bioluminiscente y fluorescente de imágenes para rastrear la dinámica del proceso metastásico. Debido a la capacidad de cuantificar la carga metastásica de la luminiscente y datos fluorescentes, es posible medir de forma sistemática y realizar un seguimiento de la cinética de crecimiento de metástasis en el tiempo. Aunque los enfoques alternativos, como las imágenes basadas en ultrasonidos, se han utilizado, estas modalidades son mucho más dependiente del usuario, con una posible mayor entre usuarios Variabilidad 27. Además, mediante la generación de un panel de líneas de células monoclonales, que son capaces de proporcionar metástasis fenotipos reproducibles y distintas con el fin de un mejor modelo de la variabilidad de la enfermedad metastásica se observa en el ámbito clínico.

Mientras que el dominio de esta técnica experimental,específicamente la inyección el interior del bazo para el modelo de ratón in vivo (ver paso 4), hay algunos pasos críticos que pueden requerir modificación. Es de destacar que la realización de la inyección esplénica es la parte más importante del modelo, como una inyección inadecuada del bazo puede dar lugar a resultados pobres. La fuga de las células durante la inyección, o la fuga causada por la colocación inapropiada de la microclip, puede resultar en un menor número de metástasis en el hígado y / o una cantidad significativa de tumores de hígado adicional o carcinomatoses peritoneales. Además, es importante para inyectar las células tumorales lentamente, por lo menos tan larga como se describe en el protocolo, a fin de evitar un aumento de la presión en el interior, lo que puede conducir a la extravasación de las células a los tejidos adyacentes y el crecimiento de los tumores de hígado adicional alrededor del tronco de la disección del bazo.

Por último, en el paso 4.3, hay una gama de células dadas para la inyección esplénica (1,2-2 × 10 6 </ Sup> células). El propósito de esta gama es para tener en cuenta para los operadores individuales de esta técnica. Puede tomar tiempo para calibrar un número óptimo de células para inyectar. Si se inyectan muy pocas células, las metástasis hepáticas no pueden desarrollar constantemente, y si se inyectan demasiadas células, pueden ocurrir una oclusión de la vena porta, lo que lleva a la temprana muerte del animal. Puede ser prudente tratar inicialmente varias concentraciones diferentes de células tumorales cuando se inicia este modelo con el fin de encontrar el número óptimo.

Un error del modelo presentado es que se basa en un enfoque de xenoinjerto y explota ratones desnudos inmunodeficientes. Un método alternativo propuesto es la generación de un panel similar de derivados monoclonales de la línea celular colorrectal murino MC38, doble marcado con luciferasa y tdTomato o proteínas EGFP. Estos clones se pueden utilizar en modelos animales singénicos con el fin de capturar las interacciones de desarrollo metástasis hepáticas con la Immu anfitriónne sistema.

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Acknowledgments

Nos gustaría agradecer al Dr. Geoffrey L. Greene (Universidad de Chicago) para el plásmido Luc2-tdTomato y la línea celular HCT116, el Sr. Solanki Ani (Centro de Recursos de animales) para la gestión de los ratones, y el Dr. Lara Leoni por la asistencia con la DLIT. Cuantificaciones de intensidades fluorescentes y luminiscentes se realizaron en la Investigación de Recursos de imagen Pequeños Animales integrada en la Universidad de Chicago en un espectro IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Virginia y DK Ludwig para la Investigación del Cáncer, la Fundación de Investigación de Cáncer de Pulmón (LCRF), la Fundación de Cáncer de Próstata (PCF), y el Centro de soporte de Grant Cáncer (P30CA014599). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

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References

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Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones
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Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).More

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