Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ

doi: 10.3791/54657 Published: November 30, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

المرضى الذين يعانون من عدد محدود من النقائل الكبدية وبطء معدلات التقدم يمكن علاجها بنجاح مع العلاج المحلية النهج 1،2. ومع ذلك، لا يعرف إلا القليل عن عدم تجانس الانبثاث الكبد، وهناك حاجة إلى نماذج حيوانية قادرة على تقييم وضع المستعمرات النقيلي الفردية. هنا، نقدم نموذجا متقدما النقائل الكبدية التي توفر القدرة على تصور كمي لتطوير استنساخ ورم الفردية في الكبد وتقدير حركية النمو والكفاءة الاستعمار. ولدت لنا لوحة من المشتقات وحيدة النسيلة من HCT116 خلايا سرطان القولون البشري المسمى مستقر مع وسيفيراز وtdTomato وحيازة خصائص النمو المختلفة. مع حقن الطحال يتبعه استئصال الطحال، ومعظم هذه الحيوانات المستنسخة قادرة على توليد الانبثاث الكبد، ولكن مع ترددات مختلفة من الاستعمار ومتفاوتة معدلات النمو. باستخدام الانظمه في فيفو التصويرم (IVIS)، فمن الممكن تصور وقياس تطور ورم خبيث في الجسم الحي مع الانارة وخارج الجسم الحي التصوير الفلورسنت. وبالإضافة إلى ذلك، منتشر الفلورسنت التصوير المقطعي (DLIT) يوفر التوزيع 3D الانبثاث الكبد في الجسم الحي. فيفو السابقين التصوير الفلورسنت من كبد تحصد يوفر القياسات الكمية للفرد المستعمرات النقيلي الكبد، مما يسمح لتقييم وتيرة الاستيطان الكبد وحركية النمو الانبثاث. منذ نموذج مشابه لالانبثاث الكبد لوحظ سريريا، يمكن أن تكون بمثابة طريقة للكشف عن الجينات المرتبطة ورم خبيث في الكبد ولاختبار علاجات الجر أو مادة مساعدة المحتملة لمرض النقيلي الكبد.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتتميز المرضى الذين يعانون من الانبثاث الكبد من سرطان القولون الأولية (CRC) من المضاعفات الخطيرة. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الأولية nonmetastatic اتفاقية حقوق الطفل (المرحلتين الأولى - III) ويقدر أن 75 - 88٪ 3،4، في حين أن المرضى الذين يعانون من الانبثاث الكبد (المرحلة الرابعة) لديها معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات فقط 8-12٪ 5 (6). ومع ذلك، والمرضى المنتشر تمثل مجموعة غير متجانسة، مع تقديم أرقام مختلفة من الانبثاث ومرات تكرار مختلفة. وتشير الملاحظات السريرية أن عدد الانبثاث (التي قد تكون متناسبة مع استعمار القدرة أو تردد من الاستعمار) وحجم أي ورم خبيث واحد (النسبي لمعدل النمو المحلي) عوامل النذير مستقلة 1،7. وبعبارة أخرى، فإن نجاح استنساخ النقيلي استعمار الكبد يعتمد على خاصيتين رئيسية هي: قدرتها على النمو وقدرتها على نشر والبقاء على قيد الحياة في المكروية الكبد.

التصميمنماذج سريرية ناجحة مع القدرة على التقاط وقياس خصائص الحيوانات المستنسخة المنتشر يمكن أن تحسن بشكل كبير من فهمنا للكبد البيولوجيا ورم خبيث وتوفير أداة فعالة لتصميم مناهج علاجية محتملة. وقد ذكرت نماذج من ورم خبيث في الكبد التجريبية سابقا 8،9، ولكن أيا منهما قدم القدرة على التقاط كميا ووصف خصائص الحيوانات المستنسخة النقيلي الفردية على حد سواء في الجسم الحي وخارج الحي.

هنا، نقدم نموذج جديد متطور من ورم خبيث في الكبد الذي يتضمن جيل من الحيوانات المستنسخة ورم مع مختلف الكفاءات الاستعمار الكبد وخصائص النمو. قمنا بتوظيف مجموعة من ثنائي العلامات على الخلايا السرطانية مع وسيفيراز وtdTomato بروتين فلوري مع جيل من خطوط الخلايا وحيدة النسيلة التي لديها اختلافات جوهرية في قدرة النقيلي. في هذا النموذج التجريبي، وتشير البيانات إلى أن تطويريمكن وصف الانبثاث الكبد من حيث التردد الاستعمار ومضاعفة الوقت (الدفتيريا)، وهو ما يتسق مع الملاحظات السريرية. طبيعة الكمية من هذا النموذج يجعل من تبنيهم بسهولة لاكتشاف الأدوية وأغراض التشخيص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة شيكاغو (بروتوكول # 72213-09) وتتم تحت ظروف معقمة.

1. التحضيرات

  1. جعل 500 مل من المتوسط ​​لثقافة الخلايا السرطانية HCT116: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 البنسلين U / مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين.
  2. الأوتوكلاف الأدوات التي ستستخدم لنموذج حقن الطحال، بما في ذلك 3-4 المناشف الجراحية والشاش، واثنين من التقاطات أدسون صغيرة، وهو سائق إبرة، واثنين من أزواج من مقص، المشبك صغيرة، و 3 microclips، في 251 درجة فهرنهايت لمدة 20 دقيقة .
  3. إعداد التخدير بعد العملية الجراحية للفئران، على أن تدار تحت الجلد بعد الحقن الطحال. تمييع 2-4 ميكروغرام من البوبرينورفين في 500 ميكرولتر من 0.9 ملحي في الماوس.
  4. إعداد aliquots من 150 ميكروغرام / 150 ميكرولتر من وسيفيرين يراعة لحقن داخل الصفاق الدرجي المقايسات تلألؤ بيولوجي. مخزن في -20 درجة مئوية، وحماية من ضوء.

2. توليد المسمى tdTomato-luciferase المراسل / خطوط خلية وحيدة النسيلة 10،11

  1. ذوبان الجليد والحفاظ على HCT116 خلايا سرطان القولون الإنسان و293FT خلايا الكلى الجنينية البشرية في DMEM مع FBS 10٪، و 100 البنسلين U / مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين. الحفاظ على الثقافة في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
  2. إنتاج الفيروسة البطيئة ارتفاع عيار.
    1. على D 1، لوحة 10-12 × 10 6 293FT خلايا بين مرور 3 و 10 في أطباق زراعة الخلايا 15 سم في 18 مل من DMEM كاملة (cDMEM) مع 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية . احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. على D 2، transfect الخلايا باستخدام الحل ترنسفكأيشن التالية:
      1. لكل طبق، استخدم ما يلي: خليط الحمض النووي من 37.5 ميكروغرام من ناقلات lentiviral pFUG إدراجها مع وسيفيراز (Luc2) وtdTomatoيبني 11 (هدية من الدكتور جيفري غرين في جامعة شيكاغو)، و 25 ميكروغرام من pCMVΔ8.74، و 12.5 ميكروغرام من pMD2.G معلق في ما مجموعه 1،062 ميكرولتر من H 2 O. معقم إضافة 188 ميكرولتر من 2 M CaCl 2.
      2. إضافة 1250 ميكرولتر من مخزنة المالحة HEPES-2X (HBS، 50 ملي HEPES، 1.5 ملي نا 2 هبو و 180 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.12) إلى حل الحمض النووي / CaCl وانخفاض في وقت واحد، في حين تهب فقاعات من خلال الحل مع ماصة.
      3. في احتضان RT لمدة 20 دقيقة، ثم قم بإضافة 15.5 مل من RT cDMEM والكلوروكين لجعل تركيز النهائي من 25 ميكرومتر.
    3. نضح في وسائل الإعلام في كل طبق من 293FT الخلايا واستبدالها مع الحل ترنسفكأيشن. إضافة 16 مل من محلول ترنسفكأيشن ببطء، والخلايا مطلي طرد بسهولة.
    4. على D 3، بعد 8-16 ساعة، وإزالة الحل ترنسفكأيشن وغسل خلايا مرة واحدة مع Dulbecco ومخزنة الفوسفات المالحة (DPBS)، ومرة ​​أخرى تقينانوغرام لا يهتمون لإزاحة الخلايا. استبدال وسائل الإعلام مع 18 مل من cDMEM جديدة مع 10 ملي HEPES.
      ملاحظة: تحرك ببطء الأطباق، نضح الحل ترنسفكأيشن، وإضافة وسائل الإعلام من خلال جدار لوحات حتى لا طرد الخلايا.
    5. على D 4، بعد 48 ساعة من وقت ترنسفكأيشن، وجمع وسائل الإعلام من الأطباق بواسطة الشفط ببطء مع ماصة حتى لا طرد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في وسائل الإعلام التي تم جمعها في 300 x ج لمدة 5 دقائق لترسيب حطام خلية كبيرة.
    6. تصفية طاف الفيروسية باستخدام 0.45 ميكرون قارورة مرشح وأجهزة الطرد المركزي باستخدام SW-28 الدوار لمدة 2 ساعة في 50000 x ج و 4 درجات مئوية ملزمة منخفض البروتين. صب وطاف على الفور بعد انتهاء الطرد المركزي وتجفيف داخل أنبوب مع مساحات.
    7. Resuspend وبيليه الفيروسي في 50 ميكرولتر من انخفاض مصل المتوسطة (RSM) مع 1٪ FBS. ويمكن تخزين aliquots في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل (الأسهم الفيروسية).
  3. تنبيغ من الفيروسة البطيئةوفاق في الخلايا HCT116 وتولد لوحة من الحيوانات المستنسخة tdTomato إيجابية.
    1. لوحة الخلايا HCT116 في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 5 24 لوحات جيدا 1 د قبل عدوى فيروسية.
    2. تمييع 40 ميكرولتر من فيروس معلق (من 2.2.7) في 4 مل من RSM (1: 100 تمييع) مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 8 ميكروغرام / مل polybrene (cRSM).
    3. في يوم من العدوى، وغسل خلايا مرة واحدة مع DPBS، ثم قم بإضافة 250 ميكرولتر من الفيروس المخفف من الخطوة 2.3.2 إلى كل بئر. احتضان لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪، ثم يضاف 1 مل من cDMEM إلى كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل48-72 ساعة.
    4. resuspend الخلايا مع 1 مل من التربسين 0.05٪ و 0.53 ملي EDTA، ثم قم بإضافة 1 مل من cDMEM لتحييد التربسين. نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge وبيليه في 300 x ج لمدة 4 دقائق. غسل 3X بيليه في 1 مل من هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS)، بالإضافة إلى 2٪ FBS.
    5. resuspend الكرية من الخطوة 2.3.4مع العازلة FACS (2٪ FBCS و 2 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني) في تعليق وحيد الخلية في 1 × 10 6 خلية / مل.
    6. فرز الخلايا tdTomato إيجابي HCT116 باستخدام فارز الخلية، النابضة للخلايا-PE الإيجابي (الإثارة / الانبعاثات: 556/585 نانومتر). تنمو الخلايا التي تم جمعها في صحن 10 سم في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية على توليد خلايا HCT116-tdTomato إيجابي الأبوية (الشكل 1A).
    7. resuspend الخلايا HCT116-tdTomato إيجابي الوالدين من 2.3.6 مع 8 مل من التربسين 0.05٪ و 0.53 ملي EDTA عن 3-5 دقائق، ثم قم بإضافة 8 مل من cDMEM لتحييد التربسين.
      1. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وبيليه في 300 x ج لمدة 4 دقائق. إزالة طاف وتمييع الخلايا HCT116-tdTomato إيجابي الأبوية إلى 1 خلية لكل 200 ميكرولتر في cDMEM (الشكل 1B).
    8. لوحة خلية واحدة (200 ميكرولتر من تمييع) لكل بئر في لوحة 96-جيدا في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية (الشكل 1C).
    9. تنمو monoclones فرد في قوارير في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. (1D الشكل).

3. معايرة شدة نيون الإشارة في وجود عدد الخلايا

  1. لوحة الخلايا HCT116 transfected، يشار إليها الآن باسم HCT116-L2T، في مناطق ذات كثافة من 0، 10 2 × 10 3 × 10 5 × 10 7 × 10 9 × 10 4 و 10 5 خلايا / جيد في 96 لوحات جيدا في يثلث لكل الكثافة.
  2. بعد 5 ساعات من الحضانة، وقياس شدة الفلورسنت tdTomato باستخدام IVIS 10.
    1. انقر على أيقونة البرنامج صورة على سطح المكتب لبدء البرنامج. انقر على زر "تهيئة" لتهيئة نظام التصوير. بعد انتهاء التهيئة (والذي يستغرق حوالي دقائق قليلة)، حدد "الإسفار"، "4 الثاني" وقت التعرض، "المتوسطة" binning، "2" F / إيقاف، "535" مرشح الإثارة،و "580" مرشح الانبعاثات.
    2. وضع 96 لوحة جيدا على محطة التصوير وانقر على "اكتساب" لبدء التصوير. بعد حصلت على صورة، انقر فوق "أدوات العائد على الاستثمار" في لوحة الأدوات واختيار 12 × 8 من رمز الشق.
    3. إنشاء 12 × 8 الشقوق لتغطية المنطقة من إشارة على الصورة من 96 لوحة جيدا وانقر فوق علامة التبويب القياسات. مراقبة نافذة مع جدول قياسات العائد على الاستثمار مع وحدات من الفوتونات في الصورة في ستيراديان لكل سم مربع (الفوتونات / ق / ريال / سم 2).
  3. بناء مخطط التشتت مع مقولة (محور X) يساوي عدد الخلايا وظيفة (Y محور) تمثل كثافة الإشارة. حساب منحنيات الانحدار باستخدام برمجيات تحليل البيانات لحساب كمية من الخلايا المقابلة لوحدة من شدة الفلورسنت (الشكل 2) 10.

4. نموذج حيواني من الكبد الانبثاث

  1. مرة واحدة الخلايا HCT116-L2T تصل إلى 70- 80٪ confluency، إعدادهم حوالي 1 ساعة قبل حقن الطحال. فصل الخلايا باستخدام 0.05٪ التربسين في 0.53 ملي EDTA عن 3-5 دقائق، ثم تحييدها مع مبلغ مساو من cDMEM. تأكد من ماصة جيدا لتجنب تراكمها.
  2. عد الخلايا مع عداد الخلايا التلقائي.
  3. resuspend الخلايا في 1X DPBS إلى تركيز من 1،2-2 × 10 6 خلية / 100 ميليلتر. تأكد من ماصة وresuspend الخلايا بدقة لتجنب تراكمها.
  4. تبقي الخلايا على الجليد حتى الحقن، وإعادة التعليق في بعض الأحيان لهم في الأنبوب.
  5. قبل التخدير الفئران، وتوفير مخدر قبل الجراحة وبلعة السوائل التي تحت الجلد عن طريق الحقن 500 ميكرولتر من خليط البوبرينورفين هو موضح في الخطوة 1.3. إدارة نفس جرعة من خليط البوبرينورفين إضافية مرتين يوميا حتى تزول علامات الألم (إعاقة حركية، مكانة منحنية، وعدم العريس، النطق عند التعامل معها).
  6. تخدير 6- 8 أسابيع-old الإناث الفئران عارية athymic مع 2٪ الأيزوفلورين في الأكسجين في غرفة التخدير. تأكد من أن الفئران هي تماما تحت التخدير بواسطة معسر الذيل. استخدام البيطري مرهم على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. نقل كل فأر تخدير للمخروط الأنف الفردية لحقن الطحال. قبل شق، يجب أن تغطي كل فأر مع ثنى الجراحية المعقمة.
  7. تحديد الطحال كمنطقة الأرجواني ينظر من الخارج من خلال الجلد على الجهة اليسرى من الفئران عارية. باستخدام مقص تسليخ مجهري، وجعل 8 مم الجهة اليسرى شق في الجلد فقط فوق الطحال.
    1. وبعد ذلك، رفع على جدار البطن وإجراء شق صغير. سماح للهواء في تجويف البطن بحيث الأعضاء الداخلية تتحرك بعيدا عن موقع شق. توسيع جدار شق البطن إلى حوالي 5 ملم.
    2. فضح الطحال من خلال تطبيق الضغط بلطف حول شق مع مسحة القطن. إذا لزم الأمر، يمكن أن الدهون البنكرياس يكون بلطف رجلipulated للمساعدة في التعرض حتى لا تجرح الطحال.
  8. حقن ببطء 100 ميكرولتر من الخلايا باستخدام حقنة 1 مل مع 27 G إبرة في غيض من الطحال المكشوفة. حقن ببطء، على مدى فترة لا تقل عن 30 - 60 ثانية، لتجنب أورام خارج الكبد.
  9. وضع microclip على الطحال قبل إزالة الإبرة في نهاية حقن لمنع تسرب تعليق حقن الخلايا.
  10. مغادرة microclip في مكان لمدة 5 دقائق.
  11. 5 دقائق تال للحقن، إجراء استئصال الطحال باستخدام جهاز الكي باليد لالارقاء. تشريح نقير الطحال، بدءا من الجانب الأمامي. عندما تشريح السفن الكبيرة، قبل تخثر الجانب القريب من السفن مع الأنسجة الدهنية المجاورة، وذلك باستخدام الكي لتجنب النزيف.
    ملاحظة: طرق لالارقاء: تخثر نقطة نزيف مباشرة مع الكي، والضغط لدرجة النزيف عن 3-5 دقائق، أو خياطة-ligate نقطة نزيف بالتعادل 5-0 الحرير. إغلاق شق الجناح من كل فأر في طبقتين. أولا، إغلاق جدار البطن مع 5-0 خياطة مضفر امتصاص (على سبيل المثال، vicryl) في غرزة أفقي واحد. بعد ذلك، إغلاق الجلد باستخدام خياطة 4-0 حيدة غير ممتص (على سبيل المثال، البرولين)، ومرة أخرى مع غرزة أفقي واحد.
  12. تنظيف جميع الصكوك عن طريق الرش 70٪ الأيزوبروبانول للحفاظ على ظروف معقمة بين كل إجراء.
    ملاحظة: تأكد من درجة حرارة الحيوانات في حين أنها مستيقظا من التخدير. رصد جميع الفئران بعد العملية حتى تصبح المتنقلة والعودة إلى النشاط العادي. عادة، في الوقت الانتعاش ما يقرب من 3-5 دقيقة. لا تترك الحيوانات غير المراقب إلا بعد أن استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.

5. في فيفو التصوير Bioluminescent

  1. أداء التصوير علىأساس أسبوعي لقياس وتحديد التغيرات في تلألؤ بيولوجي مع مرور الوقت.
  2. وضع الفئران في غرفة التخدير وتخدير لهم مع 2٪ الأيزوفلورين في الأكسجين. تأكد من أن الفئران هي تماما تحت التخدير بواسطة معسر ذيول. استخدام البيطري مرهم على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  3. بعد ذلك، حقن داخل الصفاق كل فأر مع 150 ميكرولتر من preprepared يراعة وسيفيرين من الخطوة 1.4.
  4. وضع الفئران في IVIS مع المخاريط الأنف الفردية التي تدير شؤون الأيزوفلورين. وضع الفئران في موقف ضعيف مع الفواصل بين للحد من إشارة إلى الفئران المجاورة. ويمكن تصوير كحد أقصى من خمسة فئران في وقت واحد.
  5. قياس وتحليل شدة إضاءة الحيوية 3 دقائق بعد الحقن وسيفيرين.
    1. بعد تهيئة IVIS كما هو موضح في الخطوة 3.2.1، حدد "الفلورسنت"، "1 ثانية" وقت التعرض، و "متوسطة" binning.
    2. انقر على زر "اكتساب" لبدء IMAGINز. تأكد من تنفيذ كل التصوير في وقت ثابت (3 دقائق) بعد حقن وسيفيرين.
    3. بعد حصلت على صورة، سوف تظهر نافذة الصورة ولوحة الأداة. انقر على "أدوات العائد على الاستثمار" وحدد "1"، "2"، "3"، "4"، أو "5" من رمز الدائرة، والمقابلة لعدد من الفئران تصوير.
    4. لتحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس)، دائرة منطقة إشارة للإشارة الانارة في تجويف البطن من الفأرة، ومن ثم انقر فوق "القياسات" من العائد على الاستثمار مع وحدة تعسفية من الكفاءة مشع ((الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان) / (مللي واط / سم 2)). تأكد من أن يكون دائرة العائد على الاستثمار إضافية من الخلفية.
  6. في أربعة أسابيع بعد الحقن وقبل التضحية الحيوانية، نفذ منتشر الفلورسنت التصوير المقطعي (DLIT) باستخدام IVIS لتقييم عبء الورم والتوزيع في الوقت الحقيقي باستخدام 3D إعادة الإعمار من شدة إضاءة الحيوية من المستعمرات ورم الفردية. تخدير الفئران وحقن وسيفيرين، كما هو موضح في الخطوة 5.2.4. يتم تنفيذ DLIT على الماوس في وقت واحد.
  7. بعد تهيئة IVIS، كما هو موضح في الخطوة 3.2.1، حدد "معالج التصوير"، "ضوء بارد"، وانقر على زر "التالي". حدد "DLIT" وانقر على "التالي". حدد "اليراع" تحقيقات وانقر على "التالي". حدد "الماوس" صورة الموضوع، "تلقائي" المعلمة التعرض، "C-13 سم" مجال الرؤية، و "0.5 سم" ارتفاع الموضوع، وانقر على زر "التالي". انقر على زر "اكتساب" لبدء التصوير.
  8. بعد حصلت على صورة، حدد "DLIT 3D إعادة الإعمار" علامة التبويب و"تحليل" علامة التبويب وانقر على "إعادة إعمار" لتوليد صورة إعادة الإعمار 3D.
  9. انقر على "أدوات" و "الرسوم المتحركة 3D". حدد "اتفاقية الأسلحة التقليدية تدور حول المحور Y" في إطار الرسوم المتحركة 3D. انقر على "سجل" و "حفظ" إلى ملف تنسيق وسائل التحقق.

التصوير 6. فيفو السابقين نيون

  1. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم في حين تخدير، أو وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية في 4-6 أسابيع بعد الحقن الطحال.
  2. حصاد الكبد. جعل شق أفقي من اليسار إلى الجهة اليمنى. الاستيلاء على عملية الخنجري مع سيارة بيك آب، تشريح المنجلي، والوريد الكبدي، والوريد الأجوف السفلي.
    1. تشريح الرباط الصحيح الكبدي الكلوي والكبدي الرباط، والرباط الكبدي الكلوي الأيسر، مع الحرص على عدم إصابة الفص المذنب في حين تشريح الرباط الكبدي الإثناعشري. بعد حصاد الكبد، إزالة المرارة، حيث سيؤدي ذلك إلى عرض تألق ذاتي. تقديم مذكرة من أي أورام خارج الكبد إضافية الحالية.
  3. يحيط علما أعداد وأحجام مختلفة من أورام الكبد الحاضر ظاهريا، ووضع كبد تحصد في DPBS.
    ملاحظة: الأورام مرئية ظاهريا للعين المجردةكما الأورام البيضاء (للمثال تمثيلي، انظر الشكل 4).
  4. قبل وضعها على ورقة التصوير، واتخاذ كل الكبد وإزالة بلطف السائل الزائد من قبل النشاف على منشفة ورقية.
  5. قياس كثافة الفلورسنت من كل مستعمرة الورم باستخدام IVIS.
    1. حدد "الإسفار"، "4 ثوان" وقت التعرض، "المتوسطة" binning، "2" F / إيقاف، "535" مرشح الإثارة، و "580" مرشح الانبعاثات. انقر على زر "اكتساب" لبدء التصوير.
    2. بعد الحصول على صورة، حدد موقع نافذة الصورة ولوحة الأداة. انقر على "أدوات العائد على الاستثمار" وحدد "1" من رمز الدائرة. لتحديد رويس، دائرة منطقة إشارة من المستعمرات ورم الفردية على الصورة، ثم انقر فوق "القياسات" من العائد على الاستثمار مع وحدة تعسفية من الكفاءة مشع ((الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان) / (مللي واط / سم 2) ). تأكد من أن يكون دائرة العائد على الاستثمار إضافية من الخلفية.
    3. حساب حجم الورم الكلي بافتراض أن يكون المجال. حجم الورم = 4 × π XR 3/3 (ص = نصف القطر). حساب جزء من مستعمرة ورم الخلايا تشكيل (بورتو) حيث بلغ عدد الأورام في الكبد مقسوما على عدد من حقن الخلايا splenically.
    4. حساب عدد الخلايا الإجمالي لكل مستعمرة (= X) من تقريب خطي من الخطوة 3.3. احسب عدد انقسامات الخلية (= Y) كما Y = 2 X تسجيل والدفتيريا كما الدفتيريا (يوم) = 28 / Y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وكان الهدف من هذه التجربة لإنشاء نموذج حيواني ثابت واستنساخه بسهولة مع إمكانية القياس الكمي التسلسلي للعبء الورم النقيلي في الجسم الحي ولتقدير وتيرة الاستيطان وحركية النمو تطوير الانبثاث الكبد. أرقام 2-6، مع الأساطير، وتقدم من نشر تقريرنا السابق تحت رخصة المشاع الإبداعي CC-BY 10.

جيل من Monoclones ورم الخلية المسمى نقرا مزدوجا

أولا، تم إنشاء لجنة للالانارة وخطوط الخلايا وحيدة النسيلة fluorescently المسمى مع قدرات النقيلي مختلفة. بعد ترنسفكأيشن ناجحة للالانارة (Luc2) فلوري والبروتينات (tdTomato) في الخلايا السرطانية HCT116 القولون والمستقيم الأبوية، تم إنشاء 16 monoclones المسمى نقرا مزدوجا من قبل تمييع HCT1 الوالدينخلايا 16 L2T إلى 1 خلية / 200 ميليلتر في 96 لوحات جيدة (الشكل 1) 10. في المختبر مضان والتلألؤ من HCT116-L2T ثم كميا باستخدام كمية متزايدة من الخلايا لتقدير عدد الخلايا السرطانية من في الجسم الحي والسابقين فيفو الكبد ورم التصوير (الشكل 2) 10.

الانبثاث التنمية عن طريق النسخ مع التفاضلية الكبد الاستعمار

وبعد ذلك، لتوليد الانبثاث الكبد، تم حقن 16 إنشاؤه مسبقا استنساخ HCT116-L2T الفردية intrasplenically في الفئران. ثم تم تنفيذ عملية استئصال الطحال. تم رصد تطوير الانبثاث الكبد عن طريق الأسبوعي في الجسم الحي التصوير Bioluminescent، تليها خارج الجسم الحي التصوير الفلورسنت بعد التضحية الفئران. من 16 monoclones ولدت، اخترنا استنساخ تسمى P1، P2، O1، وO2، نظرا لد بهملاحظ ifferent قدرات الاستعمار والنمو في الكبد. كان استنساخ O1 و O2 عبئا ورم أصغر، وهو ما يمثل استنساخ "oligometastatic"، وربما تلخص النمط الظاهري من المرض المنتشر محدودة. كان استنساخ P1 و P2 عبء الورم أكبر، وهو ما يمثل نشر على نطاق واسع، والتي يشار اليها على المرض كما polymetastatic أيضا. كان تلألؤ بيولوجي العالي في P1 و P2 الفئران (6.7 × 10 6 ± 4.7 × 10 6 و 3.6 × 10 6 ± 2.5 × 10 6 الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان) بالمقارنة مع الفئران O1 و O2 (2.0 × 10 5 ± 1.3 × 10 5 و 1.7 × 10 5 ± 9.1 × 10 4 الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان) 3 أسابيع بعد الحقن الطحال (الشكل 3A، B) 10. أظهر تقدير من خارج الحي مضان من كبد في 4 أسابيع بعد الحقن الطحال أن P1 و P2 كبد كان fluores أعلىشدة المائة مقارنة مع O1 و O2 كبد (الشكل 3C). وكانت التوزيعات ورم في الصور الفلورسنت خارج الحي متسقة مع النتائج العيانية (الشكل 3C، D) 10.

الاستعمار والنمو حركية النسخ الفردية

احصي أعداد وأحجام الأورام تصور ظاهريا ويتم قياسها في كل كبد الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، تم المجراة سابقا مضان التصوير في كل مستعمرة ورم الفردية لكل monoclone (الشكل 4) 10. وكان العدد الإجمالي للأورام في P1 أعلى، بالمقارنة مع P2، O1، وO2، في حين كان حجم الأورام أكبر في P2 من في P1، O1، وO2 (ع <0.001، الشكل 5A، B) 10. ومع ذلك، كان حجم الورم الكلي في الكبد في P1 و P2 أكبر بالمقارنة مع O1 و O2 (الشكل 5C) 10-5 ± 1.1 × 10-5، 6.0 × 10-6 ± 2.3 × 10-6 في P1 و O1، على التوالي، ف <0.001، الشكل 5D) 10. ولو كان لP2 قدرة مماثلة لاستعمار الكبد كما استنساخ O1 و O2، كان حجم الأورام الناتجة أكبر من الحيوانات المستنسخة أخرى. ويمكن حساب العدد الكلي للخلايا في مستعمرة الورم، والدفتيريا، وعدد من الانقسامات الخلوية من هذه البيانات باستخدام المعايرة من قبل الجنرال erated من العلاقة بين كثافة الفلورسنت وعدد الخلايا (أرقام 2 و 5E - G) 10. P1، التي ولدت العديد من الأورام الصغيرة في الكبد، كما يراها الفحص البصري بالعين المجردة، كان له التيسير أكبر، على الرغم من أنه كان الدفتيريا على غرار O1 و O2 (ع <0.05). كان P2، التي ولدت في عدد محدود من الأورام الكبيرة العيانية، والتيسير مماثل ولكن الدفتيريا أقصر مقارنة O1 و O2 (ع <0.05). معا، وتشير هذه النتائج إلى أن التيسير والدفتيريا نوعان من المعلمات الرئيسية التي تسهم في إمكانية النقيلي.

وقد تجلى توزيع 3D الأورام المنتشر في الكبد عن طريق DLIT (الشكل 6) 10. باستخدام هذه التقنية التصوير، فمن الممكن لمراقبة السلوك الديناميكي المكانية والزمانية لالانبثاث من كشف وقياس تلألؤ بيولوجي الفردية المستعمرات النقيلي الكبد.

ether.within الصفحات = "1"> التحليل الإحصائي

ولدت تم تحليل البيانات باستخدام معيار برامج تحليل البيانات، وتجلت أشرطة الخطأ كمتوسط ​​± الانحراف المعياري. تم استخدام معامل ارتباط بيرسون لتقييم الارتباط بين المعلمات. تم تقييم قيم P باستخدام تي الاختبارات 2 الذيل الطالب، مع ف <0.05 تعتبر ذات دلالة إحصائية.

شكل 1
الشكل 1: الجيل من فريق Monoclones من خلايا HCT116 إعتبر (A) تنمو خلايا HCT116 الوالدين المسمى مع وسيفيراز وtdTomato. (ب) تمييع الخلايا HCT116 الأبوية إلى 1 خلية / 200 ميليلتر. (C) لوحة 200 ميكرولتر من التخفيف في 96 لوحة جيدا. (D) تنمو monocloالأخبار من كل بئر في 96 لوحة جيدا. (E) حقن monoclones intrasplenically في الفئران لتوليد الانبثاث الكبد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تقييم عدد من الخلايا التي البئرية نيون (A) الصورة الانارة من أرقام مختلفة من الخلايا triplicated في 96 لوحة جيدا. (ب) العلاقة بين عدد الخلايا والتلألؤ (R = 0.99، ف <0.0001). يمثل شريط مقياس شدة الانارة (الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان). (ج) صورة الفلورسنت من أرقام مختلفة من الخلايا triplicated في 96 لوحة جيدا. شدة نحنإعادة المكتسبة كما الكفاءات اشعاعا مع الإثارة 535 نانومتر، وانبعاث 580 نانومتر. (D) والعلاقة بين عدد الخلايا ومضان (R = 0.99، ف <0.0001). يمثل شريط مقياس شدة الفلورسنت في وحدة تعسفية من الكفاءة مشع ((الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان) / (مللي واط / سم 2)). أعيد طبعها بإذن 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): ضوء بارد وE س فيفو الإسفار الكبد في النسخ المختارة (A) وصور للإضاءة الحيوية التمثيلية. ويمثل الشريط على نطاق والانارة كثافة العمليات ensity (الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان). (ب) تلألؤ بيولوجي قياس أسبوعيا 1-3 أسابيع في P1 و P2، و1-4 أسابيع في O1 و O2. مثلت البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري. (C) الممثل فيفو السابقين الصور الفلورسنت من كبد. تم الحصول عليها شدة كما الكفاءات اشعاعا مع الإثارة 535 نانومتر، وانبعاث 580 نانومتر. يمثل شريط مقياس كثافة الفلورسنت في وحدة تعسفية من الكفاءة مشع ((الفوتونات / ق / سم 2 / ستيراديان) / (مللي واط / سم 2)). (D) الصور الكبد مجهري (السهام تشير إلى أورام صغيرة بيضاء). P1 و P2: استنساخ polymetastatic، O1 و O2: استنساخ oligometastatic. أعيد طبعها بإذن 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

رقيقة الصفحات = "1"> الشكل (4)
الرقم 4: الكمي من شدة نيون الفردي الكبد المستعمرات الصور على اليسار هي النتائج العيانية التمثيلية والصور على اليمين هي شدة الفلورسنت في كل نسخة. تم الحصول على كثافة الفلورسنت كما الكفاءات اشعاعا مع الإثارة 535 نانومتر، وانبعاث 580 نانومتر. P1 و P2: استنساخ polymetastatic، O1 و O2: استنساخ oligometastatic. أعيد طبعها بإذن 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: تقدير الكمي للاستعمار القدرة وحركية النمو ( (ب) حجم العيانية الأورام الفردية، (ج) يحسب حجم الورم الكلي في الكبد، (D) استعمار جزء من الخلايا وتشكيل مستعمرة الورم (بورتو)، (E) مجموع عدد الخلايا في مستعمرة، (F) مضاعفة الوقت (الدفتيريا)، و (G) عدد من انقسامات الخلية من كل نسخة. P1 و P2: استنساخ polymetastatic، O1 و O2: استنساخ oligometastatic. مثلت البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري للجميع لوحات الرقم الذي عرضت أشرطة الخطأ. أعيد طبعها بإذن 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: Quantificatiعلى ضوء بارد من المستعمرات ورم الفردية باستخدام منتشر الفلورسنت التصوير المقطعي (DLIT). (A) 3D عرض في سماء المنطقة. يمثل شريط مقياس كثافة الفلورسنت في وحدة تعسفية من الكفاءة مشع. (ب) القسم الاكليل. (C) سهمي القسم. القسم (D) عمودي على المحور. (E) صورة العيانية الكبد. (F) خارج الحي صورة الفلورسنت من الكبد. أعيد طبعها بإذن 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويستند نموذج حيواني الواردة في التقرير الحالي على منهجين رئيسيين. أولا، من أجل ضمان القدرة على مراقبة الحيوانات المستنسخة النقيلي مع النزعات المختلفة للاستعمار وتتكاثر في الكبد، تأسست لجنة من خطوط الخلايا وحيدة النسيلة غير متجانسة إلى حد كبير، بدلا من خط الخلايا السرطانية غير المجزأ أنشئت 12،13. له ما يبرره النهج وحيدة النسيلة في التنمية ورم خبيث من بيانات الجينوم الأخيرة 14، وكان يستخدم بنجاح سابقا لنموذج 10،15،16 عملية النقيلي. ثانيا، تأسست المزدوج وضع العلامات على خط الخلية الوالدية التي كتبها وسيفيراز وtdTomato علامات من أجل توفير تحليل تعزيز النمو المنتشر على حد سواء في الجسم الحي وخارج الحي. والانارة ووضع العلامات الفلورية يسمح لفحص تشريحي مفصل وتقدير محتمل من كل من كمية الورم النقيلي (تعتبر تردد أو فعالية colonizatio الكبدن) وحجم أي مستعمرة الفردية. هذا الأخير يمكن بسهولة تحويلها إلى العدد الفعلي للخلايا باستخدام إجراء معايرة بسيط هو موضح في الخطوة 2 وأرقام 2 10 و 4 10. باستخدام هذه البيانات، فمن الممكن لتقدير الدفتيريا لكل عقدة المنتشر في الكبد وتقييم حركية نمو الانبثاث الكبد لكل monoclone الأولي حقن (الشكل 5) 10.

وقد لوحظت ثلاثة مختلف الظواهر المنتشر القولون والمستقيم في هذا النظام التجريبي، تسمى P1، P2، وO1 / O2. هذه الظواهر المنتشر اختلفت عند مقارنة البيانات من وتيرة الاستيطان ومعدلات النمو المحلية لكل استنساخ النقيلي. أول النمط الظاهري النقيلي، P1، تظاهر تعزيز القدرة على استعمار الكبد ولكن معدل النمو المحلي منخفض نسبيا، الموافق العديد من الأورام النقيلي الصغيرة في جميع أنحاء الكبد. النمط الظاهري المنتشر الثاني، P2، وكانأدنى تردد من الاستعمار ولكن أعلى بكثير معدل النمو المحلي، مما أسفر عن عدد صغير نسبيا من أورام ثانوية كبيرة. وأخيرا، أظهرت النمط الظاهري المنتشر الثالث، O1 و O2، سواء التردد المنخفض من الاستعمار ومعدلات النمو المحلية بطيئة. ويمكن اعتبار هذا النمط الظاهري المنتشر الثالث بمثابة تمثيل أمراض الكبد oligometastatic السريرية (الشكلان 3 10 و 5 10). وبالإضافة إلى ذلك، تحليل التعبير الجيني وبمقارنة هذه الحيوانات المستنسخة 10 الاختلافات الهامة التي تم تحديدها في أنماط التعبير. على سبيل المثال، عند مقارنة P1 مع O1 و O2 الحيوانات المستنسخة، كان هناك 756 الجينات وأعرب تفاضلي، بما في ذلك مجموعة فرعية من الجينات المسؤولة عن الاستجابات الالتهابية ويشير مضاد للفيروسات. هذه الدراسة، فضلا عن غيرهم، وقد تورطت هذه الجينات في لعب أدوار رئيسية في نمو الورم والبقاء على قيد الحياة 21، 22. وبالإضافة إلى ذلك، عند مقارنة P2 إلى O1 و O2، كان هناك 461 تفاضلي EXPRESSEالجينات د، مع مجموعة فرعية تشمل الجينات الهامة لنمو الخلايا وانتشار بوساطة من خلال ERK1 / 2 الإشارات.

تنوع الظواهر النقيلي التي تنتجها هذا النموذج التجريبي يتفق مع التمثيل السريرية المرصودة من عدم التجانس النقيلي. على سبيل المثال، فقد تبين أن حجم الانبثاث الكبد (معلمة المتعلقة إمكانات النمو) وعددهم (معلمة المتعلقة القدرة الاستعمار) هي عوامل خطر مستقلة لورم خبيث بعيد 1. مع تعزيز إمكانات النمو أو القدرة الاستعمار، والخصائص التي لوحظت في P1 و P2 تتفق مع هذه البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، الملاحظات الأخيرة من المرضى الذين عولجوا مع التجسيمي الجسم راديو العلاج (SBRT) أو مع الانبثاث الرئة مقطوعة جراحيا تشير إلى كل من عدد الأورام ومعدل التقدم إلى العوامل الرئيسية التي تحدد عموما والنتائج خالية من الأمراض 17،18. وهكذا والاستعمار ونمو قدراتهم ويبدو أنمن بين أهم العوامل الحاسمة في تحديد تطور من الحيوانات المستنسخة المنتشر في مواقع بعيدة 19،20. النماذج التجريبية، والتي تقوم على هذه الخصائص من الحيوانات المستنسخة المنتشر، قد توفر أدوات مفيدة لفهم آليات تطوير ورم خبيث، فضلا عن توفير وسيلة لاختبار طرق العلاج الجديدة للعلاج من المرض المنتشر في الكبد.

في حين أن نموذج مثلي قادر على إنتاج الانبثاث عفوية مثالية، لا تزال هناك ندرة في النماذج عفوية استنساخه بسهولة ومتسقة. في حين أن النماذج باستخدام زرع intracecal أو الحقن وقد وصفت، تظاهروا بنسب متفاوتة من امتصاص والانبثاث تشكيل 23-26. وقد استخدمت أساليب أخرى نهجا زرع خارج الرحم عن طريق الحقن داخل الطحال أو intraportal لتوليد الانبثاث الكبدي. في حين أن تقنية الشاملة للحقن هي نفسها، والنموذج المقدم هنا يوفر نهج حساس للالفضوليةtanding آليات تطوير ورم خبيث، بدءا من مرحلة تعميم الخلايا السرطانية (CTC). يتم تحديد حساسية واستنساخ نهجنا من قبل المزدوج وضع العلامات على خطوط الخلايا للسماح لكل من إضاءة الحيوية والتصوير الفلورسنت لتعقب ديناميات العملية النقيلي. ويرجع ذلك إلى القدرة على تحديد العبء المنتشر من الانارة والبيانات الفلورسنت، فمن الممكن لقياس وتتبع حركية نمو الانبثاث مع مرور الوقت بشكل منهجي. على الرغم من النهج البديلة، مثل التصوير القائم على الموجات فوق الصوتية، وقد استخدمت، هذه الطرائق هي أكثر من ذلك بكثير تعتمد على الاستعمال، مع احتمال تزايد بين المستخدم تقلب 27. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق توليد فريق من خطوط الخلايا وحيدة النسيلة، ونحن قادرون على توفير الظواهر المنتشر استنساخه ومتميزة من أجل أفضل نموذج للتنوع المرض المنتشر ينظر في وضع السريرية.

في حين اتقان هذه التقنية التجريبية،على وجه التحديد الحقن داخل الطحال لفي الجسم الحي نموذج الفأر (راجع الخطوة 4)، وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة التي قد تتطلب التعديل. من المذكرة، وأداء حقن الطحال هو الجزء الأكثر أهمية من هذا النموذج، كما حقنة عدم كفاية الطحال قد يؤدي إلى نتائج سيئة. تسرب الخلايا خلال الحقن، أو تسرب الناجمة عن وضع غير مناسب للmicroclip، قد يؤدي إلى انخفاض عدد الانبثاث الكبد و / أو كمية كبيرة من الأورام خارج الكبد أو carcinomatoses البريتوني. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن حقن الخلايا السرطانية ببطء، على الأقل ما دام هو موضح في البروتوكول، وذلك لتجنب زيادة في الضغط داخل الطحال، مما قد يؤدي إلى تسرب الخلايا إلى الأنسجة المجاورة ونمو الأورام خارج الكبد حول الجذع من تشريح الطحال.

وأخيرا، في خطوة 4.3، هناك مجموعة من الخلايا نظرا لحقن الطحال (1،2-2 × 10 6 </ sup> في الخلايا). والغرض من هذا النطاق لحساب شركات فردية من هذه التقنية. قد يستغرق وقتا لمعايرة العدد الأمثل من الخلايا لحقن. إذا تم حقن عدد قليل جدا من الخلايا، الانبثاث الكبد قد لا تتطور باستمرار، وإذا تم حقن خلايا كثيرة، قد يحدث انسداد وريدي المدخل، مما أدى إلى زوال في وقت مبكر من هذا الحيوان. قد يكون من الحكمة أن يحاول في البداية عدة تركيزات مختلفة من الخلايا السرطانية عند بدء تشغيل هذا النموذج من أجل العثور على العدد الأمثل.

واحد شرك من النموذج المقدم هو أنه يقوم على نهج طعم أجنبي ويستغل الفئران عارية العوز المناعي. واحد طريقة البديل المقترح هو الجيل من لجنة مماثلة للمشتقات وحيدة النسيلة من خط الخلية القولون والمستقيم الفئران MC38، انقر نقرا المسمى مع وسيفيراز وtdTomato أو البروتينات EGFP. ويمكن بعد هذه الحيوانات المستنسخة يمكن استخدامها في النماذج الحيوانية مسانج من أجل القبض على التفاعلات تطوير الانبثاث الكبد مع immu المضيفنظام شمال شرق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونود أن نشكر الدكتور جيفري L. غرين (جامعة شيكاغو) لالبلازميد Luc2-tdTomato وخط الخلية HCT116، السيد العاني سولانكي (مركز الثروة الحيوانية) للإدارة الفئران، والدكتور لارا ليوني للمساعدة مع DLIT. أجريت التحديد الكمي لشدة الفلورسنت والانارة في الحيوانات الصغيرة التصوير الموارد البحثية المتكاملة في جامعة شيكاغو على الطيف IVIS (PERKINELMER، هوبكينتون، MA). وأيد هذا العمل من قبل ولاية فرجينيا وصندوق لودفيغ DK لأبحاث السرطان ومؤسسة الرئة أبحاث السرطان (LCRF)، ومؤسسة سرطان البروستاتا (PCF)، وسرطان مركز دعم جرانت (P30CA014599). كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230, (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241, (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263, (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46, (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62, (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96, (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210, (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122, (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5, (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8, (2), e55714 (2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197, (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4, (6), e5821 (2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28, (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7, (12), e50141 (2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6, (12), e28650 (2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22, (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24, (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18, (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5, (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170, (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).More

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter