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Cancer Research

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

doi: 10.3791/54657 Published: November 30, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

I pazienti con un numero limitato di metastasi epatiche e dei tassi di lenti di progressione possono essere trattati con successo con trattamento locale approcci 1,2. Tuttavia, poco si sa circa l'eterogeneità delle metastasi epatiche, e sono necessari modelli animali in grado di valutare lo sviluppo delle singole colonie metastatiche. Qui, vi presentiamo un modello avanzato di metastasi epatiche che offre la possibilità di visualizzare quantitativamente lo sviluppo dei singoli cloni tumorali nel fegato e stimare la cinetica di crescita e l'efficienza colonizzazione. Abbiamo generato un gruppo di derivati ​​monoclonali di cellule tumorali del colon-retto umano HCT116 stabile etichettati con luciferasi e tdTomato e che presentano caratteristiche diverse di crescita. Con un'iniezione splenica seguita da una splenectomia, la maggioranza di questi cloni sono in grado di generare metastasi epatiche, ma con differenti frequenze di colonizzazione e tassi di crescita variabili. Utilizzando il Syste imaging in vivom (IVIS), è possibile visualizzare e quantificare lo sviluppo di metastasi con luminescenti in vivo ed ex vivo di imaging fluorescente. Inoltre, Diffuse Luminescent Imaging Tomografia (DLIT) fornisce una distribuzione 3D di metastasi epatiche in vivo. Ex vivo l'imaging fluorescente fegati raccolte fornisce misurazioni quantitative delle singole colonie metastatiche epatiche, consentendo la valutazione della frequenza di colonizzazione fegato e la cinetica di crescita di metastasi. Dal momento che il modello è simile a metastasi epatiche clinicamente osservati, può servire come una modalità per la rilevazione di geni associati con metastasi epatiche e per testare potenziali trattamenti ablativi o coadiuvanti per la malattia metastatica epatica.

Introduction

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I pazienti con metastasi epatiche da tumori colorettali primari (CRC) sono caratterizzate da una prognosi infausta. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni per i primari non metastatici CRC (fasi I - III) è stimato in 75-88% 3,4, mentre i pazienti con metastasi epatiche (stadio IV) hanno un tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo l'8 - 12% 5 , 6. Tuttavia, i pazienti metastatici rappresentano un gruppo eterogeneo, che presenta con diverso numero di metastasi e diversi tempi di ricorrenza. Osservazioni cliniche indicano che il numero di metastasi (che può essere proporzionale alla capacità colonizzazione o la frequenza di colonizzazione) e la dimensione di ogni singola metastasi (proporzionale al tasso di crescita locale) sono fattori prognostici indipendenti 1,7. In altre parole, il successo di cloni metastatici che colonizzano il fegato dipende da due importanti caratteristiche: la loro capacità di crescere e la loro capacità di diffondere e sopravvivere nel microambiente del fegato.

Il designmodelli di successo clinici con la capacità di catturare e quantificare le proprietà di cloni metastatiche può migliorare drasticamente la nostra comprensione di fegato metastasi biologia e fornire uno strumento efficace per la progettazione di potenziali approcci terapeutici. Tutti i modelli di metastasi epatiche sperimentale sono stati precedentemente segnalati 8,9, ma nessuno dei due fornito la capacità di catturare e descrivere le caratteristiche dei singoli cloni metastatici sia in vivo e ex vivo quantitativamente.

Qui, vi presentiamo un nuovo, modello avanzato di metastasi epatiche che include la generazione di cloni tumorali con diverse efficienze di colonizzazione del fegato e proprietà di crescita. Abbiamo utilizzato una combinazione di dual-etichettatura delle cellule tumorali con luciferasi e proteina fluorescente tdTomato con la generazione di linee cellulari monoclonali che hanno differenze intrinseche nella capacità metastatica. In questo modello sperimentale, i dati indicano che lo sviluppo dimetastasi epatiche possono essere descritti in termini di frequenza di colonizzazione e tempo di raddoppio (Td), che è coerente con osservazioni cliniche. La natura quantitativa di questo modello lo rende facilmente adottabile per la scoperta di nuovi farmaci e la diagnostica.

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Protocol

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Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa presso l'Università di Chicago (protocollo # 72.213-09) ed eseguite in condizioni sterili.

1. preparati

  1. Rendere 500 ml di terreno per la coltura di cellule tumorali HCT116: Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U / mL di penicillina, e 100 mg / mL di streptomicina.
  2. Autoclave gli strumenti da utilizzare per il modello iniezione milza, di cui 3 - 4 asciugamani chirurgiche, garze, due piccoli pickup Adson, un driver ago, due paia di forbici, un morsetto, e 3 microclips, a 251 ° C per 20 minuti .
  3. Preparare anestesia postoperatoria per i topi, da somministrare per via sottocutanea dopo l'iniezione milza. Diluire 2-4 mg di buprenorfina in 500 ml di soluzione salina allo 0,9 normale per il mouse.
  4. Preparare aliquote di 150 mg / 150 ml di luciferina lucciola per iniezioni intraperitoneali During i saggi di bioluminescenza. Conservare a -20 ° C e al riparo dalla luce.

2. Generazione di luciferasi / tdTomato-etichettati monoclonali linee cellulari 10,11

  1. Scongelare e mantenere umani cellule del cancro del colon-retto e HCT116 293FT cellule renali di embrioni umani in DMEM con 10% FBS, 100 U / mL di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina. Mantenere in cultura al 5% di CO 2 e 37 ° C.
  2. Produrre un lentivirus alto titolo.
    1. Su D 1, piastra di 10 - 12 x 10 6 293FT cellule tra il passaggio 3 e 10 a 15 cm piatti di coltura di cellule in 18 ml di DMEM completo (cDMEM) con il 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e acidi non essenziali amino 1% . Incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
    2. Su D 2, trasfezione le cellule utilizzando la seguente soluzione trasfezione:
      1. Per ogni piatto, utilizzare il seguente: una miscela di DNA di 37,5 mg di pFUG vettori lentivirali inserito con la luciferasi (luc2) e tdTomatocostruisce 11 (un dono del Dr. Geoffrey Greene presso l'Università di Chicago), 25 mg di pCMVΔ8.74, e 12,5 mg di pMD2.G risospese in un totale di 1.062 ml di H 2 O. sterili Aggiungere 188 ml di 2 M CaCl 2.
      2. Aggiungere 1,250 ml di 2x Hepes-buffered saline (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na 2 HPO 4, e 180 mM NaCl, pH 7.12) alla soluzione di DNA / CaCl 2, una goccia alla volta, mentre soffia bolle attraverso la soluzione con una pipetta.
      3. Incubare a temperatura ambiente per 20 min, e quindi aggiungere 15,5 ml di RT cDMEM e clorochina per effettuare una concentrazione finale di 25 pM.
    3. Aspirare i media in ogni piatto di 293FT cellule e sostituirlo con la soluzione di trasfezione. Aggiungere 16 ml di soluzione di trasfezione lentamente, come le cellule placcato facilmente sloggiare.
    4. Su D 3, dopo 8 - 16 ore, rimuovere la soluzione di trasfezione e lavare le cellule una volta con fosfato Dulbecco-Buffered Saline (DPBS), ancora una volta taking cura di non rimuovere le cellule. Sostituire il supporto con 18 ml di cDMEM fresca con 10 mM Hepes.
      NOTA: spostare lentamente piatti, aspirare la soluzione di trasfezione, e aggiungere i media attraverso la parete laterale di lastre in modo da non rimuovere le cellule.
    5. Il D 4, a 48 h dal momento della transfezione, raccogliere i supporti dai piatti aspirando lentamente con una pipetta in modo da non staccare le cellule. Centrifuga i media raccolti a 300 xg per 5 minuti per far precipitare la grande detriti cellulari.
    6. Filtrare il surnatante virale utilizzando un 0,45 micron a basso legame proteico beuta per filtrazione e centrifugare utilizzando un rotore SW-28 per 2 ore a 50.000 xg e 4 ° C. Decantare il surnatante immediatamente dopo la fine centrifugazione e asciugare l'interno del tubo con tergicristalli.
    7. Risospendere il pellet virale in 50 ml di siero ridotto Medium (RSM) con 1% FBS. Aliquote possono essere conservati a -80 ° C per un uso futuro (virale magazzino).
  3. Trasdurre il lentiviruses nelle cellule HCT116 e generano un pannello di cloni tdTomato-positivi.
    1. Piastra le cellule HCT116 ad una densità di 1 x 10 5 a 24 pozzetti 1 d prima dell'infezione virale.
    2. Diluire 40 ml di virus risospeso (da 2.2.7) in 4 mL di RSM (diluizione 1: 100) con 1% di penicillina / streptomicina e 8 mg / mL polibrene (CRSM).
    3. Il giorno di infezione, lavare le cellule una volta con DPBS, e quindi aggiungere 250 ml di virus diluito dal punto 2.3.2 in ogni pozzetto. Incubare per 4 ore a 37 ° C e 5% CO 2, e quindi aggiungere 1 ml di cDMEM a ciascun pozzetto; incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per il 48 - 72 ore.
    4. Risospendere le cellule con 1 ml di 0,05% tripsina e 0,53 mM EDTA, e poi aggiungere 1 ml di cDMEM per neutralizzare la tripsina. Trasferire le cellule in una provetta e pellet a 300 xg per 4 minuti. Lavare il 3x pellet in 1 ml di soluzione Hanks 'salina bilanciata (HBSS) più 2% FBS.
    5. Risospendere il pellet dal punto 2.3.4con FACS tampone (2% FBCS e 2 mM EDTA in PBS) in una cella singola sospensione a 1 x 10 6 cellule / ml.
    6. Ordina le cellule HCT116 tdTomato-positivo con un cell sorter, gating per le cellule in PE-positivo (eccitazione / emissione: 556/585 nm). Far crescere le cellule raccolte in un piatto di 10 cm al 5% di CO 2 e 37 ° C per generare cellule HCT116 tdTomato-positivo parentali (Figura 1A).
    7. Risospendere le cellule HCT116 tdTomato-positivi parentali da 2.3.6 con 8 mL di 0,05% tripsina e 0,53 mM EDTA da 3 - 5 minuti, e quindi aggiungere 8 mL di cDMEM per neutralizzare la tripsina.
      1. Trasferire le cellule in una provetta e pellet da 50 ml a 300 xg per 4 minuti. Rimuovere il surnatante e diluire le cellule HCT116 tdTomato-positivi genitori per 1 cella per 200 ml a cDMEM (Figura 1B).
    8. Piatto una singola cella (200 microlitri della diluizione) per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a 5% di CO 2 e 37 ° C (Figura 1C).
    9. Grow singoli monoclones in fusti al 5% di CO 2 e 37 ° C. (Figura 1D).

3. Calibrazione di intensità del segnale fluorescente in funzione del numero di cellule

  1. Piastra le cellule HCT116 trasfettate, ora denominato HCT116-L2T, ad una densità di 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 e 10 5 cellule / pozzetto in piastre da 96 pozzetti in triplicato per ogni densità.
  2. Dopo 5 ore di incubazione, di quantificare le intensità fluorescenti tdTomato utilizzando IVIS 10.
    1. Fare clic sull'icona del software di immagine sul desktop per avviare il software. Fare clic sul pulsante "Initialize" per inizializzare il sistema di imaging. Al termine di inizializzazione (che dura circa pochi minuti), selezionare, "4 secondi" il tempo di esposizione, binning "fluorescenza" "Medium", "2" F / stop, "535" filtro di eccitazione,e "580" filtro per le emissioni.
    2. Posizionare la piastra ben 96 nella stazione di imaging e clicca su "Acquisire" per avviare l'imaging. Dopo che l'immagine viene acquisita, fare clic su "Strumenti ROI" nella palette degli strumenti e selezionare 12 x 8 dall'icona fessura.
    3. Crea 12 x 8 fessure per coprire l'area del segnale sul immagine della piastra da 96 pozzetti e fare clic sulla scheda misure. Osservare una finestra con una tabella di misurazioni ROI con le unità di fotoni per s per steradiante per centimetro quadrato (fotoni / s / sr / cm 2).
  3. Costruire una dispersione con l'argomento (asse X) pari al numero di cellule e la funzione (asse Y) che rappresenta l'intensità di segnale. Calcolare curve di regressione utilizzando un software di analisi dati per calcolare la quantità di cellule corrispondenti all'unità di intensità fluorescente (Figura 2) 10.

4. modello animale di metastasi epatiche

  1. Una volta che le cellule HCT116-L2T raggiungono 70- 80% di confluenza, a prepararsi circa 1 h prima dell'iniezione milza. Dissociare le cellule utilizzando 0,05% tripsina in 0,53 mM EDTA da 3 - 5 minuti, e poi neutralizzare con una quantità uguale di cDMEM. Assicurati di pipetta a fondo per evitare grumi.
  2. Contare le cellule con un contatore di cellule automatica.
  3. Risospendere le cellule in 1x DPBS ad una concentrazione di 1,2 - 2 x 10 6 cellule / 100 microlitri. Assicurati di pipetta e risospendere accuratamente le cellule per evitare grumi.
  4. Mantenere le cellule in ghiaccio fino ad iniezione, talvolta li risospendere nel tubo.
  5. Prima di anestetizzare i topi, fornire un anestetico preoperatoria e bolo fluido per via sottocutanea iniettando 500 ml di miscela buprenorfina descritto al punto 1.3. Somministrare la stessa dose di miscela buprenorfina aggiuntivo due volte al giorno fino a quando i segni di dolore (mobilità ridotta, statura curvo, il mancato sposo, la vocalizzazione quando gestito) hanno risolto.
  6. Anestetizzare da 6 a 8 settimane-vecchio femmina topi nudi atimici con 2% isoflurano in ossigeno in una camera di anestesia. Verificare che i topi sono completamente sotto anestesia da pizzicare la coda. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Trasferire ogni topo anestetizzato a un musetto individuale per l'iniezione milza. Prima di incisione ogni mouse dovrebbe essere coperto con un telo chirurgico sterile.
  7. Identificare la milza come area viola visto dall'esterno attraverso la pelle sul fianco sinistro dei topi nudi. Utilizzando le forbici microdissezione, fare un otto millimetri fianco sinistro incisione sulla pelle appena sopra la milza.
    1. Successivamente, sollevare la parete addominale e fare una piccola incisione. Consentire l'aria nella cavità addominale in modo che gli organi interni si allontanano dal sito di incisione. Ingrandire l'incisione della parete addominale di circa 5 mm.
    2. Esporre la milza applicando delicatamente pressione intorno l'incisione con un batuffolo di cotone. Se necessario, il grasso del pancreas può essere delicatamente uomoipulated per aiutare con esposizione in modo da non danneggiare la milza.
  8. Iniettare lentamente 100 ml di cellule utilizzando una siringa da 1 ml con un ago G 27 nella punta della milza esposto. Iniettare lentamente, nell'arco di un periodo di almeno 30 - 60 s, per evitare tumori extra-epatiche.
  9. Inserire un microclip sulla milza prima di rimuovere l'ago al termine dell'iniezione per evitare fuoriuscite di sospensione cellulare iniettato.
  10. Lasciare il microclip sul posto per 5 min.
  11. 5 min dall'iniezione, eseguire una splenectomia utilizzando un dispositivo di cauterizzazione portatile per emostasi. Sezionare il ilo della milza, a partire dal lato anteriore. Quando dissezione navi di grandi dimensioni, pre-coagulare il lato prossimale dei vasi con tessuto adiposo adiacente, utilizzando cauterizzazione per evitare un eccessivo sanguinamento.
    NOTA: I metodi per emostasi: coagulano il punto di sanguinamento direttamente con cauterizzazione, applicare una pressione al punto di sanguinamento per 3-5 minuti, o di sutura-legare il punto sanguinante con una cravatta di seta 5-0. Chiudere l'incisione fianco di ogni topo in due strati. Innanzitutto, chiudere la parete addominale con una sutura 5-0 assorbibile intrecciata (es, Vicryl) in un punto singolo orizzontale. Successivamente, chiudere la pelle con un 4-0 non assorbibile sutura monofilamento (ad esempio, prolene), ancora con una sola cucitura orizzontale.
  12. Pulire tutti gli strumenti a spruzzo 70% di isopropanolo per mantenere condizioni di sterilità tra ogni procedura.
    NOTA: Assicurarsi che gli animali sono riscaldati mentre si svegliano dall'anestesia. Monitorare tutti i mouse dopo l'intervento fino a quando diventano ambulatoriale e tornare alla normale attività. Tipicamente, il tempo di recupero è circa 3 - 5 min. Non lasciare gli animali incustoditi fino a che non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.

5. In Vivo Bioluminescent Imaging

  1. Eseguire l'imaging suuna volta alla settimana per misurare e quantificare i cambiamenti in bioluminescenza nel corso del tempo.
  2. Inserire topi in una camera di anestesia e anestetizzare con 2% isoflurano in ossigeno. Verificare che i topi sono completamente sotto anestesia da pizzicare le code. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  3. Successivamente, per via intraperitoneale iniettare ogni mouse con 150 ml di preprepared lucciola luciferina dal punto 1.4.
  4. Posizionare il mouse in un IVIS con i singoli coni naso somministrazione di isoflurano. Posizionare il mouse in posizione supina con distanziali intermedi per minimizzare il segnale di topi adiacenti. Un massimo di cinque topi può essere ripreso in una sola volta.
  5. Misurare e analizzare intensità bioluminescenti 3 minuti dopo l'iniezione luciferina.
    1. Dopo l'inizializzazione del IVIS come descritto al punto 3.2.1, selezionare "luminescenti", "1 secondo" tempo di esposizione, e binning "Medium".
    2. Fare clic sul pulsante "Ripresa" per avviare Imaging. Assicurarsi di eseguire ogni immagini alla volta coerente (3 min) dopo l'iniezione luciferina.
    3. Dopo che l'immagine viene acquisita, apparirà una finestra di immagine e tavolozza degli strumenti. Fai clic su "Strumenti ROI" e selezionare "1", "2", "3", "4", o "5" dall'icona cerchio, corrispondente al numero di topi creata l'immagine.
    4. Per definire regioni di interesse (ROI), il giro l'area del segnale luminescente nella cavità addominale del mouse del segnale, e quindi fare clic su "misure" del ROI come unità arbitraria di efficienza radiante ((fotoni / s / cm 2 / steradiante) / (W / cm 2)). Assicurarsi di avere un cerchio ROI ulteriore dello sfondo.
  6. A quattro settimane dopo l'iniezione e prima del sacrificio animale, eseguire Diffuse luminescenti Imaging Tomografia (DLIT) utilizzando IVIS per valutare il carico tumorale e la diffusione tramite ricostruzione 3D in tempo reale di intensità bioluminescenti di colonie tumorali singole. Anestetizzare i topi e iniettare luciferina, come descritto al punto 5.2.4. DLIT viene eseguita su un mouse alla volta.
  7. Dopo l'inizializzazione del IVIS, come descritto al punto 3.2.1, selezionare "Wizard Imaging", "bioluminescenza" e fare clic su "Avanti". Selezionare "DLIT" e fare clic su "Avanti". Selezionare sonde "Firefly" e fare clic su "Avanti". Selezionare "mouse" immagine del soggetto, l'esposizione parametro "Auto", campo "C-13 cm" di vista, e "0.5 cm" altezza soggetto, e fare clic su "Avanti". Fare clic sul pulsante "Ripresa" per avviare l'imaging.
  8. Dopo che l'immagine viene acquisita, selezionare la scheda "DLIT 3D Reconstruction" e la "Analizza" scheda e fare clic su "Ricostruire" per generare l'immagine ricostruzione 3D.
  9. Fai clic su "Strumenti" e "Animazione 3D". Selezionare "Spin CCW su Y" nella finestra di animazione 3D. Fai clic su "Record" e "Salva" in un file in formato .mov.

Imaging 6. Ex Vivo fluorescente

  1. Sacrificare i topi da dislocazione cervicale mentre anestetizzato, o secondo le linee guida istituzionali a 4 - 6 settimane dopo le iniezioni milza.
  2. Raccolto il fegato. Effettuare una incisione orizzontale da sinistra a fianco destro. Afferrando il processo xifoideo con un pick-up, sezionare il falciforme, la vena epatica, e la vena cava inferiore.
    1. Sezionare il legamento destra epato-renale, il legamento epatoduodenale, e il legamento epato-renale sinistra, facendo attenzione a non danneggiare il lobo caudato mentre sezionare il legamento epatoduodenale. Dopo la raccolta il fegato, rimuovere la colecisti, in quanto questo verrà visualizzato autofluorescenza. Prendere nota di eventuali tumori ulteriori extra-epatiche presenti.
  3. Prendere nota dei numeri e le dimensioni dei tumori al fegato presente macroscopicamente, e posizionare i fegati raccolte in DPBS.
    NOTA: I tumori sono macroscopicamente visibili ad occhio nudocome tumori bianche (per un esempio rappresentativo, vedere la Figura 4).
  4. Prima di posizionamento sul foglio di imaging, prendere ogni fegato e rimuovere delicatamente il liquido in eccesso tamponando su un tovagliolo di carta.
  5. Misurare le intensità fluorescenti da ogni colonia tumore utilizzando il IVIS.
    1. Selezionare "fluorescenza", "4 secondi" il tempo di esposizione, binning "Medium", "2" F / stop, "535" filtro di eccitazione, e filtro per le emissioni "580". Fare clic sul pulsante "Ripresa" per avviare l'imaging.
    2. Dopo aver acquisito l'immagine, individuare la finestra dell'immagine e tavolozza degli strumenti. Fai clic su "Strumenti ROI" e selezionare "1" dall'icona cerchio. Per definire ROI, cerchio l'area di singole colonie tumorali sull'immagine del segnale, e quindi fare clic su "misure" del ROI come unità arbitraria di efficienza radiante ((fotoni / s / cm 2 / steradiante) / (W / cm 2) ). Assicurarsi di avere un cerchio ROI ulteriore dello sfondo.
    3. Calcolare il volume totale del tumore ipotizzando che sia una sfera. Volume del tumore = 4 x π XR 3/3 (r = raggio). Calcolare la frazione di cellule formanti colonie tumorali (Fc) come il numero di tumori nel fegato diviso per il numero di cellule splenically iniettato.
    4. Calcolare il numero totale di cellule per colonia (= X) dal approssimazione lineare dal punto 3.3. Calcolare il numero di divisioni cellulari (= Y) come Y = log 2 X e la Td come Td (giorno) = 28 / Y.

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Representative Results

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L'obiettivo di questo esperimento era di stabilire un modello animale coerente e facilmente riproducibile con il potenziale per la quantificazione di serie del carico tumorale metastatica in vivo e per la stima della frequenza di colonizzazione e cinetica di crescita di sviluppare metastasi epatiche. Figure 2-6, con le leggende, sono forniti dalla nostra precedente pubblicazione sotto una licenza creative Commons CC-BY 10.

Generazione di Double-marcato Monoclones tumore a cellule

In primo luogo, un gruppo di luminescenti e linee di cellule monoclonali fluorescente è stata generata con diverse abilità metastatici. A seguito di trasfezione di successo di luminescenti (luc2) e fluorescenti proteine ​​(tdTomato) nelle cellule tumorali del colon-retto HCT116 parentali, 16 monoclones doppi marcati sono stati generati diluendo il HCT1 dei genitoriCelle 16-L2T a 1 cellula / 200 ml in piastre da 96 pozzetti (Figura 1) 10. In vitro fluorescenza e luminescenza di HCT116-L2T stato poi quantificato utilizzando una quantità crescente di cellule per stimare il numero di cellule tumorali in vivo ed ex vivo l'imaging tumore del fegato (Figura 2) 10.

Metastasi sviluppo da cloni con differenziale fegato colonizzazione

Avanti, per generare metastasi epatiche, i 16 precedentemente generati singoli cloni HCT116-L2T stati intrasplenically iniettate in topi; splenectomia è stata poi eseguita. Lo sviluppo di metastasi epatiche è stata monitorata da settimanale vivo l'imaging bioluminescente, seguito da immagini fluorescenti ex vivo dopo aver sacrificato i topi. Dei 16 monoclones generati, abbiamo selezionato cloni designati come P1, P2, O1, O2 e, a causa della loro different osservato capacità di colonizzazione e di crescita nel fegato. Cloni O1 e O2 ha avuto un carico tumorale più piccolo, che rappresenta "oligometastatic" cloni, e, potenzialmente, ricapitolando un fenotipo della malattia metastatica limitata. Cloni P1 e P2 avevano un carico tumorale più grande, che rappresenta diffusione capillare, che è indicato anche come malattia polymetastatic. La bioluminescenza era più alta nel P1 e topi P2 (6.7 × 10 6 ± 4.7 × 10 6 e 3.6 × 10 6 ± 2.5 × 10 6 fotoni / s / cm 2 / steradiante) rispetto ai topi O1 e O2 (2.0 × 10 5 ± 1.3 × 10 5 e 1,7 × 10 5 ± 9.1 × 10 4 fotoni / s / cm 2 / steradiante) 3 settimane dopo la milza iniezione (Figura 3A, B) 10. La quantificazione della ex vivo fluorescenza delle fegato a 4 settimane dopo l'iniezione milza dimostrato che P1 e P2 fegato avevano FLUORES più altiintensità cento rispetto O1 e O2 fegati (Figura 3C). Le distribuzioni di tumore nelle immagini fluorescenti ex vivo erano coerenti con i risultati macroscopici (Figura 3C, D) 10.

La colonizzazione e crescita cinetica di cloni individuali

Il numero e le dimensioni dei tumori visualizzate macroscopicamente stati contati e misurati in ogni singolo fegato. Inoltre, ex vivo imaging di fluorescenza è stato fatto su ogni colonia tumore individuale per ogni monoclone (Figura 4) 10. Il numero totale di tumori in P1 era superiore, rispetto a P2, O1 e O2, mentre le dimensioni del tumore era più grande in P2 che in P1, O1 e O2 (p <0,001; la figura 5A, B) 10. Tuttavia, il volume totale di tumori al fegato in P1 e P2 era più grande rispetto al O1 e O2 (Figura 5C) - 5 ± 1,1 × 10 - 5. 6.0 × 10 - 6 ± 2.3 × 10 - 6 in P1 e O1 rispettivamente, p <0,001; Figura 5D) 10. Sebbene P2 aveva una capacità simile di colonizzare fegato come cloni O1 e O2, la dimensione dei tumori generati era più grande degli altri cloni. Il numero totale di cellule per colonia tumore, il Td, e il numero di divisioni cellulari può essere calcolata dai dati mediante calibratura precedente generazionerati dalla correlazione tra l'intensità fluorescente ed il numero di cellule (figure 2 e 5E - G) 10. P1, che hanno generato molti piccoli tumori nel fegato, come visto mediante ispezione visiva macroscopica, aveva una grande Fc, anche se aveva un Td simile a O1 e O2 (p <0.05). P2, che ha generato un numero limitato di grandi tumori macroscopiche, aveva un Fc simile ma un Td inferiori rispetto a O1 e O2 (p <0.05). Presi insieme, questi risultati indicano che la Fc e Td sono due parametri chiave che contribuiscono al potenziale metastatico.

La distribuzione 3D di tumori metastatici nel fegato è stata dimostrata DLIT (Figura 6) 10. Utilizzando questa tecnica di imaging, è possibile monitorare il comportamento dinamico spazio-temporale delle metastasi per la rilevazione e misura della bioluminescenza di singole colonie metastatiche epatiche.

I dati generati sono stati analizzati utilizzando il software di analisi dei dati standard e le barre di errore sono state dimostrate come media ± deviazione standard. Coefficienti di correlazione di Pearson sono stati usati per valutare le associazioni tra i parametri. I valori di P sono stati valutati utilizzando t-test di Student 2 a coda, con un p <0.05 considerati statisticamente significativi.

Figura 1
Figura 1:. Generazione di un pannello di Monoclones di cellule HCT116 marcato (A) Crescere le cellule HCT116 parentali etichettati con luciferasi e tdTomato. (B) Diluire le cellule HCT116 genitori per 1 cellula / 200 ml. (C) Piastra 200 ml di diluizione in una piastra da 96 pozzetti. (D) Grow monoclones da ciascun pozzetto della piastra ben 96. (E) Iniettare monoclones intrasplenically in topi per generare metastasi epatiche. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: stima del numero di celle di intensità di fluorescenza (A) L'immagine luminescente diverso numero di cellule triplicato in una piastra da 96 pozzetti.. (B) La correlazione tra il numero di cellule e la luminescenza (R = 0.99, p <0,0001). La barra di scala rappresenta intensità luminescenti (fotoni / s / cm 2 / steradiante). (C) L'immagine fluorescente diverso numero di cellule triplicato in una piastra da 96 pozzetti. intensità noiri acquisita efficienze radianti con eccitazione 535 nm e emissione 580 nm. (D) La correlazione tra il numero di cellule e la fluorescenza (R = 0.99, p <0,0001). La barra della scala rappresenta l'intensità fluorescente un'unità arbitraria dell'efficienza radiante ((fotoni / s / cm 2 / steradiante) / (W / cm 2)). Ristampato con il permesso 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: bioluminescenza ed E x Vivo fluorescenza del Fegato in cloni selezionati (A) immagini bioluminescenti Rappresentante.. La barra di scala rappresenta luminescenti intensità (fotoni / s / cm 2 / steradiante). (B) bioluminescenza misurata settimanale da 1 - 3 settimane in P1 e P2, e 1 - 4 settimane in O1 e O2. I dati sono stati rappresentati come media ± deviazione standard. (C) Rappresentante ex vivo le immagini fluorescenti di fegato. Le intensità sono state acquisite efficienze radianti con eccitazione 535 nm e emissione 580 nm. La barra di scala rappresenta intensità di fluorescenza in una unità arbitraria dell'efficienza radiante ((fotoni / s / cm 2 / steradiante) / (W / cm 2)). (D) le immagini del fegato macroscopici (le frecce indicano piccoli tumori bianchi). P1 e P2: cloni polymetastatic, O1 e O2: cloni oligometastatic. Ristampato con il permesso 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 4:. Quantificazione dei fluorescenti intensità delle singole colonie fegato Immagini a sinistra sono reperti macroscopici rappresentative e immagini sulla destra sono intensità di fluorescenza in ogni clone. Le intensità di fluorescenza sono state acquisite efficienze radianti con eccitazione 535 nm e emissione 580 nm. P1 e P2: cloni polymetastatic, O1 e O2: cloni oligometastatic. Ristampato con il permesso 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Stima quantitativa di colonizzazione capacità e crescita Kinetics ( (B) dimensioni macroscopiche dei singoli tumori, (C) calcolato volume totale del tumore nel fegato, (D) colonizzando frazione di cellule che formano tumori colonie (Fc), (E) numero totale di cellule per colonia, (F) tempo di raddoppio (Td), e (G) il numero di divisioni cellulari di ogni clone. P1 e P2: cloni polymetastatic, O1 e O2: cloni oligometastatic. I dati sono stati rappresentati come media ± deviazione standard per tutti i pannelli figura in cui sono state mostrate barre di errore. Ristampato con il permesso 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Quantificatisu di bioluminescenza delle Colonie singolo tumore utilizzando Diffuse luminescenti Imaging Tomografia (DLIT). (A) 3D vista ambientale. La barra di scala rappresenta intensità della fluorescenza in una unità arbitraria di efficienza radiante. (B) Sezione coronale. (C) sagittale sezione. Sezione (D) transassiale. (E) immagine macroscopica del fegato. (F) ex vivo immagine fluorescente del fegato. Ristampato con il permesso 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il modello animale presentato nella presente relazione si basa su due approcci principali. In primo luogo, al fine di assicurare la capacità di osservare cloni metastatici con differenti inclinazioni di colonizzare e proliferare nel fegato, un pannello di linee cellulari monoclonali altamente eterogenei è stato istituito, piuttosto che una consolidata linea cellulare di tumore non frazionata 12,13. L'approccio monoclonale per lo sviluppo di metastasi è giustificato dai recenti dati genomici 14 ed è stato utilizzato con successo in precedenza per modellare il 10,15,16 processo metastatico. Secondo, doppio etichettatura della linea cellulare parentale mediante marcatori luciferasi e tdTomato stata costituita per fornire un'analisi maggiore della crescita metastatica sia in vivo ed ex vivo. Il luminescenti e marcatori fluorescenti permette un esame dettagliato anatomica e potenziale quantificazione sia la quantità di tumori metastatici (considerato come la frequenza o l'efficacia del colonizatio fegaton) e la dimensione di ogni colonie individuali. Quest'ultimo può essere facilmente convertito in un numero reale di celle utilizzando una semplice procedura di calibrazione descritto nella fase 2 e le figure 2 e 4 10 10. Utilizzando questi dati, è possibile stimare il Td per ciascun nodo metastatici nel fegato e di valutare la cinetica di crescita di metastasi epatiche per ogni monoclone iniziale iniettato (Figura 5) 10.

Tre diversi fenotipi colorettale metastatico sono stati osservati in questo sistema sperimentale, designato come P1, P2, e O1 / O2. Questi fenotipi metastatici differivano quando si confrontano i dati di frequenza di colonizzazione e tassi di crescita locale per ogni clone metastatico. Il primo fenotipo metastatico, P1, ha dimostrato una maggiore capacità di colonizzare il fegato, ma un tasso relativamente basso di crescita locale, che corrisponde a molti piccoli tumori metastatici tutto il fegato. La seconda fenotipo metastatico, P2, avevauna minore frequenza di colonizzazione ma un tasso di crescita locale significativamente più elevato, risultando in un numero relativamente piccolo di grandi tumori secondari. Infine, il terzo fenotipo metastatico, O1 e O2, dimostrato sia una bassa frequenza di colonizzazione e tassi di crescita locali lenti. Questo terzo fenotipo metastatico può essere considerato come una rappresentazione di clinici malattie epatiche oligometastatic (figure 3 e 5 10 10). Inoltre, l'analisi di espressione genica confrontando questi cloni 10 differenze significative individuate nei modelli di espressione. Ad esempio, quando si confrontano P1 con O1 e O2 cloni, c'erano 756 geni differenzialmente espressi, compreso un sottogruppo di geni coinvolti nella risposta infiammatoria e segnalazione interferone. Questo studio, così come altri, hanno implicato questi geni nel giocare ruoli chiave nella crescita tumorale e la sopravvivenza 21, 22. Inoltre, quando si confrontano P2 O1 e O2, c'erano 461 differenzialmente expressed geni, con un sottoinsieme che coinvolge geni critici per la crescita cellulare e la proliferazione mediata attraverso ERK1 2 segnalazione /.

La diversità dei fenotipi metastatici prodotte da questo modello sperimentale è coerente con le rappresentazioni clinici osservati di eterogeneità metastatico. Ad esempio, è stato dimostrato che le dimensioni delle metastasi epatiche (un parametro relativo al potenziale di crescita) e il loro numero (un parametro correlato alla capacità di colonizzazione) sono fattori di rischio indipendenti per metastasi a distanza 1. Con potenziale di crescita maggiore o capacità di colonizzazione, le proprietà osservate in P1 e P2 sono coerenti con questi dati. Inoltre, recenti osservazioni dei pazienti trattati con stereotassica corpo Radio-terapia (SBRT) o con metastasi polmonari chirurgicamente asportati puntano sia al numero di tumori e la velocità di progressione, come fattori chiave che determinano complessivo e risultati libera da malattia 17,18. Così, la colonizzazione e la crescita abilità sembranoessere tra i fattori più importanti nel determinare lo sviluppo di cloni metastatiche in siti distanti 19,20. modelli sperimentali, che si basano su queste proprietà di cloni metastatiche, possono fornire strumenti utili per la comprensione dei meccanismi di sviluppo di metastasi, oltre a fornire un mezzo per testare nuove modalità di trattamento per la cura della malattia metastatica epatica.

Mentre un modello ortotopico in grado di produrre metastasi spontanee è l'ideale, resta una scarsità di modelli spontanei facilmente riproducibili e coerenti. Mentre sono stati descritti i modelli che utilizzano l'impianto intracecal o iniezioni, hanno dimostrato tassi variabili di assorbimento e metastasi formazione 23-26. Altri metodi hanno utilizzato un approccio di impianto ectopica per iniezione intrasplenico o intraportale per generare metastasi epatiche. Mentre la tecnica complessiva dell'iniezione è lo stesso, il modello qui presentato fornisce un approccio sensibile alla underdagiato i meccanismi di sviluppo di metastasi, a partire dalla fase della circolanti cellule tumorali (CTC). La sensibilità e la riproducibilità del nostro approccio è determinato dalla doppia etichettatura delle linee cellulari sia per consentire bioluminescente imaging fluorescente per monitorare la dinamica del processo metastatico. A causa della capacità di quantificare l'onere metastatico dal luminescenti e dati di fluorescenza, è possibile misurare e monitorare la cinetica di crescita di metastasi nel tempo sistematicamente. Anche se approcci alternativi, come l'imaging a ultrasuoni a base, sono state utilizzate, queste modalità sono molto più user-dipendente, con potenzialmente una maggiore inter-utente variabilità 27. Inoltre, generando un pannello di linee cellulari monoclonali, siamo in grado di fornire fenotipi metastatici riproducibili e distinti per modello migliore della variabilità della malattia metastatica visto in ambito clinico.

Mentre padroneggiare questa tecnica sperimentale,in particolare l'iniezione intrasplenico per il modello in vivo nel topo (vedi punto 4), ci sono alcuni passaggi critici che potrebbero richiedere la modifica. Da notare, eseguendo l'iniezione splenica è la parte più importante del modello, come iniezione inadeguata della milza può provocare scarsi risultati. Perdita di cellule durante l'iniezione, o perdite causati dal posizionamento appropriato del microclip, può risultare in un minor numero di metastasi epatiche e / o una quantità significativa di tumori extra-epatiche o carcinomatoses peritoneale. Inoltre, è importante per iniettare le cellule tumorali lentamente, almeno fino a quando descritto nel protocollo, al fine di evitare un aumento della pressione intrasplenico, che può portare a stravaso delle cellule ai tessuti adiacenti e la crescita di tumori extra-epatiche intorno al moncone della dissezione milza.

Infine, nel passo 4.3, vi è un intervallo di celle proposta per l'iniezione splenica (1,2 - 2 × 10 6 </ Sup> celle). Lo scopo di questo intervallo è per tenere conto di singoli operatori di questa tecnica. Si può prendere tempo per calibrare un numero ottimale di cellule da iniettare. Se troppo poche cellule vengono iniettate, metastasi epatiche non possono sviluppare in modo coerente, e se troppe cellule vengono iniettate, si possono verificare l'occlusione della vena porta, che porta alla morte prematura dell'animale. Può essere prudente per cercare inizialmente diverse concentrazioni differenti di cellule tumorali quando si inizia questo modello, al fine di trovare il numero ottimale.

Un trabocchetto del modello presentato è che si basa su un approccio xenotrapianto e sfrutta topi nudi immunodeficienti. Un metodo alternativo proposto è la generazione di un pannello simile di derivati monoclonali della murino linea cellulare colorettale MC38, doppio marcato con luciferasi e tdTomato o proteine ​​EGFP. Questi cloni possono quindi essere utilizzati in modelli animali singenici al fine di cogliere le interazioni di sviluppo metastasi epatiche con il Immu ospiteil sistema ne.

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Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il Dott Geoffrey L. Greene (Università di Chicago) per il plasmide luc2-tdTomato e la linea cellulare HCT116, Mr. Ani Solanki (Resource Center Animale) per la gestione topi, e il Dr. Lara Leoni per l'assistenza con il DLIT. Quantificazioni di intensità di fluorescenza e luminescenti sono stati eseguiti in Small Animal Imaging integrata delle risorse di ricerca presso l'Università di Chicago su un Spectrum IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Virginia e Fondo Ludwig DK per la ricerca sul cancro, il Lung Cancer Research Foundation (LCRF), il Prostate Cancer Foundation (PCF), e il Cancer Center Support Grant (P30CA014599). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l'analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

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References

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Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni
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Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).More

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