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Cancer Research

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

doi: 10.3791/54657 Published: November 30, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

간 및 전이 진행의 느린 속도의 제한된 수의 환자는 성공적으로 치료 로컬로 처리 될 수 1,2- 접근한다. 그러나, 약간의 간 전이의 이질성에 대해 알려져 있으며, 개별 전이성 콜로니의 발달을 평가 할 수있는 동물 모델이 필요하다. 여기서는 정량적 간에서 개별적인 종양 클론의 개발을 시각화하고 성장 동역학 및 정착 효율을 추정하는 능력을 제공 간 전이의 고급 모델을 제시한다. 우리는 안정적으로 루시 페라 제와 tdTomato 다른 성장 특성을 갖는으로 표시 HCT116 인간 대장 암 세포의 단일 클론 파생 상품의 패널을 생성합니다. 비장 절제술 다음 비장 주입,이 클론의 대부분의 간 전이를 생성 할 수 있지만, 다른 주파수의 정착 및 가변 성장률이다. 생체 내 이미징 SYSTE 사용m (IVIS)는, 그것을 시각화 생체 발광 및 생체 형광 이미징 전이 현상을 정량화 할 수있다. 또한, 확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT)는 생체 내에서 간 전이의 3 차원 분포를 제공한다. 수확 간의 전 생체 내 형광 이미징은 개인 간 전이성 식민지의 정량적 측정을 제공, 간 식민지의 주파수의 평가와 성장 속도론을 허용 전이. 모델 임상 관찰 간전이 비슷하기 때문에, 간 전이와 연관된 유전자를 검출하기위한 간 전이성 질환 전위 융제 또는 보조제 치료를 시험하는 양상이 될 수있다.

Introduction

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차 대장 암 (CRC)에서 간 전이 환자는 예후가 불량 특징으로한다. 12 % - 5 간전 (단계 IV)을 가진 환자가 단지 8의 5 년 생존율이 동안 88 % 3,4 - 기본 nonmetastatic CRC에 대한 5 년 생존율 (단계는 I - III) (75)으로 추정 6. 그러나, 전이성 환자는 전이 및 다른 재발 시간의 서로 다른 숫자를 제시, 이종 그룹을 나타냅니다. 임상 관찰과 (지역 성장 속도에 비례) 단일 전이의 크기 (식민지 능력 또는 식민지의 주파수에 비례 할 수 있음) 전이의 수는 독립적 인 예후 인자 1,7가 있음을 나타냅니다. 성장 능력과 전파 및 간 미세 환경에서 생존 능력 : 즉, 간 식민지화 전이성 클론의 성공은 두 가지 특성에 의존한다.

디자인캡처 크게 간 전이 생물학에 대한 우리의 이해를 향상시키고 잠재적 인 치료 접근 방법의 설계를위한 효과적인 도구를 제공 할 수 있습니다 전이성 클론의 특성을 정량화의 기능이 성공적으로 임상 모델. 실험 간전 모델 이전 8,9보고되었지만, 이들 중 어느 정량적 캡처 생체와 생체 외 모두 개별 전이성 클론의 특성을 설명하는 기능을 제공했다.

여기, 우리는 다른 간 식민지의 효율성과 성장 특성을 가진 종양 클론의 생성을 포함하는 간 전이의 새로운 고급 모델을 제시한다. 우리는 전이성 용량 본질적인 차이가 모노클로 날 세포주의 생성과 루시페라아제 및 tdTomato 형광 단백질 암세포 이중 표지의 조합을 채용. 이 실험 모델에서, 데이터의 개발 것을 나타간 전이는 식민지 주파수의 용어 및 임상 관찰과 일치 배가 시간 (TD)으로 설명 될 수있다. 이 모델의 정량적 특성은 약물 발견 및 진단 목적으로 쉽게 채용 할 수있다.

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Protocol

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모든 동물의 절차는 시카고 대학 (프로토콜 # 72213-09)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 무균 조건 하에서 수행 하였다.

1. 준비

  1. 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100mg / ml 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) : 500 HCT116 종양 세포의 배양을위한 배지의 용액을 만든다.
  2. 20 분 동안 251 ° F에서 4 수술 타월, 거즈, 두 개의 작은 Adson 픽업, 바늘 구동부 위 두 쌍 작은 클램프 3 microclips - 악기 3 등 비장 주입 모델에 사용되는 오토 클레이브 .
  3. , 마우스에 대한 수술 후 마취를 준비 비장 주입 다음 피하 투여 할 수 있습니다. 마우스 당 0.9 생리 식염수 500 μL에 부 프레 노르 핀의 4 μg의 - 2 희석.
  4. 복강 내 주사 지속 시간에 대한 반디 루시페린의 150 μg의 / 150 μL의 분취 량을 준비생물 발광 분석을 보내고. -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호합니다.

루시 페라 제 / tdTomato 표지 단일 클론 셀 라인 10, 11를의 2 세대

  1. 해동 HCT116 인간 대장 암 세포를 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신을 가진 DMEM에서 293FT 인간 배아 신장 세포를 유지한다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 문화를 유지한다.
  2. 높은 역가의 렌티 바이러스를 생성합니다.
    1. 12 × 106 293FT 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 완전 DMEM 18 ㎖ (cDMEM)에서 15cm 세포 배양 접시에서 통로 (3) 및 (10) 사이에서 세포, 1 % 비 필수 아미노산 - D 1 플레이트 (10) . 37 ° C에서 품어 5 % CO 2.
    2. 이 D에서 다음 형질 감염 용액을 사용하여 세포를 형질 감염 :
      1. 각각의 접시를 들어, 다음을 사용하십시오 루시 페라 제 (Luc2) 및 tdTomato 삽입 pFUG의 렌티 바이러스 벡터의 37.5 μg의의 DNA 혼합물멸균 H 2 O의 1062 μL의 총에 재현 탁 (11) (시카고 대학에서 박사 제프리 그린의 선물), pCMVΔ8.74 25 μg의, 그리고 pMD2.G의 12.5 μg의를 구성 2 M CaCl2를 188 μL를 추가합니다.
      2. 추가 1250 배 헤 페스 완충 식염수 (HBS, 50mM의 헤 페스, 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 180 mM의 염화나트륨, pH를 7.12)를 DNA / CaCl2를 용액에 한 번에 한 방울의 μL 관통 기포 취입하면서 피펫으로 솔루션입니다.
      3. 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하고 25 μM의 최종 농도를 확인하기 위해 RT cDMEM 클로로퀸 및 15.5 mL를 첨가.
    3. 293FT 세포의 각 접시에 미디어를 기음과 형질 전환 솔루션으로 교체합니다. 도금 세포가 쉽게시키다로, 천천히 형질 용액 16 mL를 넣고.
    4. D 3 일 후 8 - 다시, 타키 16 시간의 형질 감염 용액을 제거하고, 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 한번 세포를 씻어NG는 셀을 제거하지 않도록주의. 10 mM의 헤 페스 신선한 cDMEM 18 mL로 미디어를 교체합니다.
      참고 천천히 요리 이동 형질 감염 용액을 흡인하고 세포 빠지지 않도록 플레이트의 측벽을 통해 미디어를 추가한다.
    5. D (4)에 형질 감염 시점으로부터 48 시간에, 세포를 빠지지 않도록 천천히 피펫으로 흡인하여 접시에서 매체를 수집한다. 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에 수집 된 미디어가 큰 세포 찌꺼기를 침전한다.
    6. 사용하여 바이러스 상층 액을 필터 0.45 μm의 저 단백질 결합 50,000 XG, 4 ° C에서 2 시간 동안 SW-28 로터를 사용하여 필터 플라스크와 원심 분리기. 원심 분리 완료 후 즉시 상등액을 경사 분리하고 와이퍼와 상기 튜브의 내부를 건조.
    7. 1 % FBS로 감소 세럼 중간 (RSM)의 50 μL의 바이러스 성 펠렛을 재현 탁. 분취 량은 나중에 사용하기 (바이러스 주)에 대한 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 렌티 바이러스를 형질 도입와 HCT116 세포로 ES는 tdTomato 양성 클론의 패널을 생성합니다.
    1. 바이러스 감염 전 1 1 × 105 웰 플레이트 (24) (D)의 밀도에 HCT116 세포 접시.
    2. 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 8 μg의 / ML의 폴리 브렌과 : (100 희석 1) (cRSM) RSM의 4 mL에 (2.2.7)에서 재 부유 바이러스의 40 μL를 희석.
    3. 감염의 날, DPBS 한 번 세포를 세척 한 다음 각 웰에 단계 2.3.2에서 희석 바이러스의 250 μL를 추가합니다. 각 웰에 cDMEM의 1 mL를 넣고 다음 37 ° C에서 4 시간 5 % CO 2 품어하고; 72 시간 - 48 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 %.
    4. 0.05 % 트립신 1 ㎖ 및 0.53 mM의 EDTA로 세포를 재현 탁하고 트립신 중화 cDMEM 1 mL를 넣어. 4 분 동안 300 XG에 microcentrifuge 관 및 펠릿에 세포를 전송합니다. 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS) 플러스 2 % FBS 1 mL에 펠릿 배를 씻으십시오.
    5. 단계 2.3.4에서 펠렛을 재현 탁1 × 106 세포 / ㎖에서 단일 세포 현탁액 FACS 완충액 (2 % FBCS 및 PBS 2 mM의 EDTA)와.
    6. 정렬 PE 양성 세포 게이팅 셀 소터를 사용 tdTomato 양성 HCT116 세포 (여기 / 방출 : 585분의 556 ㎚). 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포 (도 1A)을 생성하는 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 cm 접시에 수집 된 세포를 성장한다.
    7. 0.05 % 트립신 8 mL의 3 0.53 mM의 EDTA와 2.3.6에서 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포를 재현 탁 - 5 분 ​​후 트립신을 중화 8 mL의 cDMEM의 추가합니다.
      1. 4 분 동안 300 XG에 50 ML의 튜브 및 펠릿에 세포를 전송합니다. 상층 액을 제거하고 cDMEM (그림 1B) 200 μL 당 1 셀에 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포를 희석.
    8. 5 % CO 2, 37 ° C (그림 1C)에서 96 웰 플레이트에 잘 당 하나의 셀 (희석 200 μL)를 플레이트.
    9. 5 % CO 2, 37 ℃에서 플라스크에서 개별 단일 클론 성장. (그림 1D).

세포 수의 함수로서 형광 신호 강도 3. 교정

  1. 10 3 0의 밀도 지금 HCT116-L2T이라 형질 HCT116 세포를 플레이트 (2) × 104 3 × 105, × 104 (5), 7 × 104, × 104 9 10 5 세포 / 웰의 각 밀도 삼중의 96 웰 플레이트.
  2. 배양 5 시간 후, IVIS (10)를 사용하여 형광 강도를 tdTomato 정량화.
    1. 소프트웨어를 시작하려면 바탕 화면의 이미지 소프트웨어 아이콘을 클릭합니다. 이미징 시스템을 초기화하기 위해 "초기화"버튼을 클릭합니다. (몇 분 정도 소요) 초기화가 완료되면, "형광", "사초"노출 시간, "중간"비닝 (binning), "2"F / 정지를 선택, "535"여기 필터,와 "580"방출 필터.
    2. 이미징 스테이션의 96 웰 플레이트를 놓고 촬영을 시작합니다 "획득"을 클릭합니다. 이미지가 획득 한 후, 도구 팔레트에서 "ROI 도구"버튼을 클릭 슬릿 아이콘 12 × 8을 선택합니다.
    3. 96 웰 플레이트의 이미지 신호의 영역을 커버하고 측정 탭을 클릭하여 12 × 8 슬릿을 만듭니다. 평방 cm 당 스테 라디안 당의 당 광자 단위로 투자 수익 (ROI) 측정 테이블과 창을 관찰 (광자 / S / SR / cm 2).
  3. 셀의 개수 및 신호 강도를 나타내는 함수 (Y 축)과 동일한 인수 (X 축)와 산점도를 구축. 형광 강도의 단위에 대응하는 세포의 양을 계산 (도 2) (10), 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 회귀 곡선을 계산한다.

간 전이 4. 동물 모델

  1. HCT116-L2T 셀 (70)에 도달하면- 80 % 컨 플루는 비장 주입 약 1 시간 전을 준비합니다. 3 0.53 mM의 EDTA 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 해리 - 5 분 ​​후 cDMEM 동량로 중화. 응집을 방지하기 위해 철저하게 피펫해야합니다.
  2. 자동 세포 계수기로 세포를 계산합니다.
  3. 2 × 106 세포 / 100 μL - 1.2의 농도로 1X DPBS에서 세포를 재현 탁. 피펫과 응집을 방지하기 위해 철저하게 세포를 재현 탁해야합니다.
  4. 때때로 튜브를 재현 탁, 사출까지 얼음에 세포를 유지합니다.
  5. 생쥐를 마취에 앞서, 단계 13에 기재된 프레 놀핀 혼합물의 500 μL를 주입하여 피하로 수술 전 마취 루스 유체를 제공한다. 통증 (감소 이동성, 구부리고 키, 신랑 실패, 처리 발성)의 징후가 해결 될 때까지 하루에 두 번 추가 프레 노르 핀 혼합물의 동일한 용량을 관리 할 수 ​​있습니다.
  6. 6 ~ 8 주 마취마취 실에서 산소의 2 % 이소 플루 란과 올드 여성 무 흉선 누드 마우스. 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 비장 주입에 대한 개별 코 콘 각 마취 마우스를 전송합니다. 절개에 앞서, 각 마우스는 무균 수술 드레이프로 피복되어야한다.
  7. 누드 마우스의 왼쪽 측면에 피부를 통해 외부에서 보이는 보라색 영역으로 비장을 확인합니다. 미세 절제 가위를 사용하여, 바로 비장 위의 피부 상에 8mm 왼쪽 측면 절개를합니다.
    1. 다음으로, 복부 벽에 들어 올려 작은 절개를합니다. 내부 장기를 절개 부위로부터 멀리 이동되도록 복강 내로 공기를 허용한다. 약 5 mm의 복벽 절개를 크게한다.
    2. 부드럽게 면봉으로 절개 주위에 압력을 적용하여 비장을 노출. 필요한 경우, 췌장의 지방 부드럽게 사람이 될 수있다비장을 손상하지 않도록 노출에 도움이 ipulated.
  8. 천천히 노출 비장의 끝으로 27 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 세포의 100 μL를 주입. 여분 간 종양을 방지하기 위해, 60 초 - 30 이상에 걸쳐서 천천히 주입한다.
  9. 종래 주입 세포 현탁액의 유출을 방지하기 위해, 사출의 끝에서 바늘을 제거하는 비장에 microclip 배치.
  10. 5 분 동안 장소에 microclip를 남겨주세요.
  11. 주 사후 5 분은 지혈을위한 휴대용 소작 장치를 사용하여 비장 절제술을 수행한다. 전방 측면에서 시작되는 지라 폐문을 해부하다. 대형 선박을 해부하면, 과도한 출혈을 방지하기 위해 소작을 이용하여, 인접하는 지방 조직과 혈관의 전방 측 미리 응집.
    참고 : 지혈하는 방법 :가, 소작 직접 출혈 지점을 응고 3 출혈 지점에 압력을가 - 5 분, 또는 5-0 실크 넥타이 출혈 지점을 봉합-결찰. 두 개의 층에 각 마우스의 측면 절개를 닫습니다. 첫째, 하나의 가로 스티치에서 5-0 흡수 꼰 봉합 (예를 들어, vicryl)와 복벽을 닫습니다. 다음에, 하나의 수평 스티치 다시 4-0 흡수성 필라멘트 봉합사 (예 prolene의)을 사용하여 피부를 닫는다.
  12. 모든 절차 사이의 무균 상태를 유지하기 위해 70 % 이소프로판올을 분사하여 모든 악기를 청소합니다.
    참고 : 그들이 마취에서 깨어있는 동안 동물이 따뜻하게되어 있는지 확인합니다. 그들은 외래되고 정상적인 활동으로 돌아갈 때까지 수술 후 모든 쥐를 모니터링합니다. 5 분 - 일반적으로, 회복 시간은 약 3이다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.

생체 발광 생물 이미징 5.

  1. 에 이미지를 수행주 단위로 측정하고 시간이 지남에 따라 생물 발광의 변화를 정량화한다.
  2. 마취 챔버에 마우스를 놓고 산소의 2 % 이소 플루 란으로 그들을 마취. 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  3. 다음으로, 복강 단계 1.4에서 반딧불 루시페린 preprepared 150 μL 각 마우스를 주입.
  4. 개별 코 콘 이소 플루 란을 투여와 함께 IVIS에서 마우스를 놓습니다. 인접 마우스에 신호를 최소화하기 위해 사이에 스페이서와 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 다섯 마우스의 최대 한번에 이미징 될 수있다.
  5. 측정 및 생물 발광 강도를 루시페린 주사 후 3 분을 분석 할 수 있습니다.
    1. 단계 3.2.1에 설명 된대로 IVIS 초기화 후, "발광", "일초"노출 시간, 및 "중간"비닝 (binning)을 선택한다.
    2. imagin을 시작합니다 "취득"버튼을 클릭지. 루시페린 주입 후 일정한 시간 (3 분)에서 각각의 영상을 수행해야합니다.
    3. 이미지가 획득 한 후, 이미지 창 및 도구 팔레트가 나타납니다. "ROI 도구"를 클릭하고 "1", "2", "3", "4"또는 "5"원 아이콘에서 이미지화 마우스의 수에 대응.
    4. ,이자 (로아)의 영역을 정의 마우스의 복강에 발광 신호의 신호 영역에 동그라미를 한 다음 복사 효율의 임의의 단위로 투자 수익 (ROI)의 "측정"을 클릭합니다 ((광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안) / (μW / cm 2)). 배경의 추가 투자 수익 (ROI) 원을 가지고 있는지 확인하십시오.
  6. 사주 포스트 분사 이전 동물의 희생에서 개별 종양 식민지의 생물 발광 강도의 실시간 3D 재구성을 사용하여 종양 부담과 분포를 평가하기 위해 IVIS를 사용하여 확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT)를 수행합니다. 쥐를 마취 단계 5.2.4에 기술 된 바와 같이, 루시페린을 주입. DLIT 한번에 한 마우스에 대해 수행된다.
  7. 단계 3.2.1에 설명 된대로 IVIS를 초기화 한 후, "이미지 마법사", "생물 발광"을 선택하고 "다음"을 클릭합니다. "DLIT"를 선택하고 "다음"을 클릭합니다. "반딧불"프로브를 선택하고 "다음"을 클릭합니다. "마우스"이미지 제목, "자동"노출 매개 변수,보기의 "C-13 cm"필드 및 "0.5 cm"주제 높이를 선택하고 "다음"을 클릭합니다. 영상을 시작합니다 "획득"버튼을 클릭합니다.
  8. 이미지가 획득 한 후, "DLIT 3D 재건"탭을 선택하고 "분석"탭과 3D 복원 영상을 생성하기 위해 "재구성"을 클릭합니다.
  9. "도구"와 "3D 애니메이션"을 클릭합니다. 3 차원 애니메이션 창에서 "Y 축에 회전 CCW"를 선택합니다. .mov 인 형식 파일에 "레코드"와 "저장"을 클릭합니다.

6. 예 생체 형광 영상

  1. 비장 주사 다음 육주 - 마취, 또는 4에서 제도적 지침에 따라 동안 자궁 경부 전위로 마우스를 희생.
  2. 간을 수확. 오른쪽 측면에 왼쪽에서 수평 절개를합니다. 픽업과 칼 모양의 프로세스를 잡아, 낫 모양, 간장 정맥과 하대 정맥을 해부하다.
    1. hepatoduodenal 인대를 해부하면서 꼬리가 로브를 손상하지 않도록주의하면서 오른쪽 간신 인대의 hepatoduodenal 인대, 그리고 왼쪽 간신 인대를 해부하다. 이 형광도 표시됩니다으로 간을 수확 한 후, 담낭을 제거합니다. 본 추가 여분 간 종양의 기록합니다.
  3. 본 거시적 숫자 및 간 종양의 크기의 노트를 가지고, 그리고 DPBS에 수확 간 놓습니다.
    참고 : 종양은 육안으로 거시적으로 볼 수 있습니다흰색으로 종양 (대표 예를 들어,도 4 참조).
  4. 이전 이미징 시트 배치에, 각각의 간을 부드럽게 종이 타월에 모래 바닥으로 물기를 제거합니다.
  5. IVIS를 사용하여 각 종양 식민지에서 형광 강도를 측정한다.
    1. "형광", "사초"노출 시간, "중간"비닝 (binning), "2"F / 정지, "535"여기 필터 및 "580"방출 필터를 선택합니다. 영상을 시작합니다 "획득"버튼을 클릭합니다.
    2. 영상을 획득 한 후, 화상 창 도구 팔레트를 찾아. "ROI 도구"를 클릭하고 원 아이콘에서 "1"을 선택합니다. ((방사 효율의 임의의 단위로 투자 수익 (ROI)의 "측정"을 클릭 한 다음 동그라미 이미지에 개별 종양 식민지의 신호 영역의 ROI를 정의하고 광자 / S / cm 2) / 스테 라디안 / (μW / cm 2) ). 배경의 추가 투자 수익 (ROI) 원을 가지고 있는지 확인하십시오.
    3. 이 구형으로 가정하여 총 종양 볼륨을 계산합니다. 종양의 부피 = 4 ×의 π의 XR 3분의 3 (R = 반지름). splenically 주입 된 세포의 수로 나눈 간 종양의 수와 암 콜로니 형성 세포 (FC)의 비율을 계산한다.
    4. 단계 3.3에서 선형 근사에서 식민지 당 총 세포 수 (=의 X)를 계산합니다. TD (날) (28) / Y.을 같이 = Y = X (2) 상기 TD 로그로 세포 분열 (= Y)의 개수를 계산

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Representative Results

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이 실험의 목표는. 생체 전이성 종양 부담 직렬 정량화하고 식민 주파수 간 전이 현상의 성장 동역학의 추정의 가능성과 일관된 쉽게 재현 동물 모델을 확립 하였다 2-6도 전설로, 크리에이티브 커먼즈 CC-BY 라이센스 (10)에 따라 이전 출판물에서 제공됩니다.

더블 표지 종양 세포 단일 클론의 생성

첫째, 발광 및 형광 표지 된 모노클로 날 세포주의 패널은 서로 다른 전이 능력을 생성 하였다. 부모의 HCT116의 대장 암 세포에서 성공 발광의 형질 (Luc2) 및 형광 (tdTomato) 단백질에 이어, 16 번 표지 단일 클론은 부모의 HCT1을 희석하여 생성 된1 세포 / 96 웰 플레이트에 200 μL에 16 L2T 세포 (도 1) 10. 시험관 형광 HCT116-L2T의 발광 후 생체 내 전에서의 종양 세포의 수를 추정하기 위해 셀의 증가량을 이용하여 정량 하였다 (그림 2) 10 간 종양 영상을 생체 내.

차동 간 식민지와 클론으로 전이 개발

이어서, 간 전이를 생성하기 이전에 생성 된 16 개의 개별 HCT116-L2T 클론 intrasplenically 마우스에 주사 하였다; 비장 절제술 후 수행 하였다. 간전의 개발은 생쥐를 희생 후 생체 형광 촬상이어서 주간 생체 내 생물 발광 이미징에 의해 모니터링 하였다. 생성 된 단일 클론 16 가운데 우리 인해 D에 P1, P2, O1 및 O2로 지정된 클론을 선택한ifferent는 간에서 식민지 성장 능력을 관찰했다. 클론 O1과 O2는 "oligometastatic"클론을 대표하는 잠재적으로 제한 전이성 질환의 표현형을 recapitulating, 작은 종양 부담을했다. 클론 P1 및 P2는 또한 polymetastatic 질환 칭한다 널리 보급을 나타내는 큰 종양 부담이 있었다. 생물 발광은 P1 및 P2 마우스 (6.7 × 10 6 ± 4.7 × 106 3.6 × 10 6 ± 2.5 × 10 6 포톤 / s / cm 2 / 스테 라디안)이 O1 및 O2 쥐와 비교하여 (2.0 × 높았다 10 5 ± 1.3 × 105 1.7 × 10 5 ± 9.1 × 10 4 광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안) 비장 주입 (그림 3A, B) 10 후 삼주. 비장 주입 후 사주에 간의 생체 형광의 정량은 P1과 P2 간 높은 fluores를 한 것으로 보여O1과 O2 간 (그림 3C)와 비교 %의 강도. 전 생체 형광 영상에서 종양의 분포는 거시적 인 연구 결과 (그림 3C, D) (10)와 일치했다.

개별 클론의 식민지와 성장 속도론

숫자 및 거시적 시각 종양의 크기를 계산하고 각각의 간에서 측정 하였다. 또한, 생체 형광 영상은 각 monoclone (그림 4) (10)에 대한 각각의 종양 식민지에 이루어졌다. 10; P1 종양의 총 수는 O2 (도 5A, B, P <0.001), P2, O1 및 O2에 비해 종양의 크기가 P1, O1보다 P2 컸다 동안 높은, 그리고. O1 및 O2에 비해 그러나, P1 및 P2의 간 총 종양 체적은 크다 (도 5C) 5 - - 각각 P1 및 O1에 6-5, 6.0 × 10-6 ± 2.3 × 10를 다른 클론 (FC = 8.2 × 10에 비해 따라서, P1은 간을 식민지화하는 향상된 능력을 가지고 있었다 p <0.001;도 5d) 10. P2 클론 O1 및 O2와 같은 간 정착 유사한 기능을 가지고 있지만, 생성 된 종양의 크기는 다른 클론보다 컸다. 암 콜로니의 TD 및 세포 분열 횟수 당 세포의 총 수는 이전 세대를 교정을 사용하여 데이터로부터 계산할 수있다(- G도 2 및도 5e) (10)의 형광 강도와 세포 수 사이의 관계로부터 erated. 이 O1과 O2 (p <0.05)와 유사한 TD 있었다하더라도 거시적 육안으로 볼 때, 간에서 많은 작은 종양을 생성 P1은, 큰 된 Fc 있었다. 육안 큰 종양 제한된 수의 생성 P2는 유사한 된 Fc 있지만 O1과 O2 (p <0.05)에 비해 짧은 TD 있었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 FC 및 TD가 전이 가능성에 기여하는 두 가지 주요 변수가 있음을 나타냅니다.

간에서 전이성 종양의 3 차원 분포는 DLIT (그림 6) (10)에 의해 증명되었다. 이러한 영상 기술을 이용하여, 개인 간 전이성 콜로니의 생물 발광 검출 및 측정에 의한 전이 시공간 동적 거동을 모니터링 할 수있다.

데이터는 표준 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 분석 한 결과 생성, 에러 바는 평균 ± 표준 편차로 입증되었다. 피어슨의 상관 계수 파라미터 간의 연관성을 평가 하였다. P 값은 통계적으로 유의 한 것으로 간주 p <0.05,이 꼬리 학생의 t- 시험을 사용하여 평가 하였다.

그림 1
그림 1 :. 레이블 HCT116 세포의 단일 클론의 패널의 세대 (A) 루시퍼와 tdTomato으로 표시 부모 HCT116 세포를 성장. (B) 1 셀 / 200 μL에 부모 HCT116 세포를 희석. (C) 플레이트를 96 웰 플레이트에 희석을 200 μL. (D) monoclo 성장96 웰 플레이트의 각 웰에서 NES. (E)의 간 전이를 생성하는 마우스에 intrasplenically 단일 클론을 주입한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 : 형광 강도들을 의한 세포의 수의 평가 (A)를 96 웰 플레이트에서 세포 triplicated 다른 개수의 발광 이미지.. (B) 셀의 개수와 발광 (R = 0.99, p <0.0001)의 상관 관계. 스케일 바는 발광 강도 (광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안)를 나타냅니다. (C) 96 웰 플레이트에 세포 triplicated 상이한 수의 형광 이미지. 우리 강도535 nm의 여기 및 580 nm의 방출과 방사 효율로 취득 다시. (D) 셀의 개수 및 형광 (R = 0.99, p <0.0001)의 상관 관계. 스케일 바는 방사 효율의 임의의 단위로 형광 강도 ((광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안) / (μW / cm 2))를 나타냅니다. 허가 (10) 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 선정 클론의 간의 생물 발광 및 E X 생체 형광 (A) 대표 생물 발광 이미지.. 스케일 바는 발광 INT를 나타냅니다ensity (광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안). P1 및 P2 3 주, 1 - - O1과 O2 4 주 (B) 생물 발광는 1 주간 측정 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현 하였다. (C) 대표 생체 간의 형광 이미지. 강도는 535 nm의 여기 및 580 nm의 방출과 방사 효율로 취득 하였다. 스케일 바는 방사 효율의 임의의 단위로 형광 강도 ((광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안) / (μW / cm 2))를 나타냅니다. (D) 육안 간 화상 (흰색 화살표 작은 종양을 나타냄). P1과 P2 : polymetastatic 클론, O1과 O2 : oligometastatic 클론. 허가 (10) 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 4 :. 개인 간 식민지의 형광 세기들의 정량화 왼쪽의 이미지를 대표 거시적 결과 및 오른쪽에있는 이미지입니다 각 클론의 형광 강도입니다. 형광 강도는 535 nm의 여기 및 580 nm의 방출과 방사 효율로 취득 하였다. P1과 P2 : polymetastatic 클론, O1과 O2 : oligometastatic 클론. 허가 (10) 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 :. 식민지화 능력과 성장 속도론의 정량적 평가 ( (B) 각각의 종양의 거시적 크기 간 총 종양 체적을 계산 (C), (D)을 FC (종양 콜로니 형성 세포 식민지화 분획), (E)의 총 세포 수 식민지 당 (F) (TD) 시간을 두 배로, 각 클론의 세포 분열의 (G) 번호입니다. P1과 P2 : polymetastatic 클론, O1과 O2 : oligometastatic 클론. 데이터는 오차 막대가 표시 된 모든 그림 패널 평균 ± 표준 편차로 표현 하였다. 허가 (10) 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : Quantificati확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT). (A) 3D 오버 헤드보기를 사용하여 개별 종양 식민지의 생물 발광의에. 스케일 바는 방사 효율의 임의의 단위로 형광 강도를 나타냅니다. (B) 코로나 섹션. (C) 시상 섹션을 참조하십시오. (D) Transaxial 섹션. (E) 간 육안 이미지입니다. 간 (F) 전 생체 내 형광 이미지입니다. 허가 (10) 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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현재 보고서에 기재된 동물 모델은 두 가지 방식에 기초한다. 우선, 정착 및 간에서 증식 다른 성향과 전이성 클론을 관찰 할 수있는 기능을 보장하기 위해 높은 이종 모노클로 날 세포주 패널 오히려 설정된 분획 암 세포주 12,13보다 설립되었다. 전이 현상에 대한 단일 클론 방식은 최근의 게놈 데이터 (14)에 의해 정당화되고, 성공적 전이성 10,15,16 프로세스를 모델링 이전에 사용되었다. 둘째, 루시 페라 제 및 tdTomato 마커에 의해 부모 세포주의 이중 라벨은 전이성 성장 생체 내생체 외 모두의 향상된 분석을 제공하기 위해 설립되었습니다. 발광 및 형광 표식 상세한 해부 검사 간 colonizatio의 주파수 또는 효과로 간주 전이성 종양의 양 둘 다의 전위 부량 (허용N) 및 개별 식민지의 크기입니다. 후자 용이 단계 2에 기재된 간단한 보정 절차를 사용하여 셀의 실제 개수로 변환이 10 4 10도 될 수있다. 이 데이터를 사용하면, 간에서 각 노드에 대한 전이 TD를 추정하고, 각 분사 초기 monoclone (도 5) 10 간 전이의 성장 동역학을 평가하는 것이 가능하다.

세 가지 대장 전이성 표현형은 P1, P2, 및 O1 / O2로 지정이 실험 시스템에서 관찰되었다. 각 전이 복제에 대한 식민지 및 지역 성장 속도의 주파수의 데이터를 비교할 때 이러한 전이성 표현형은 달랐다. 제 전이성 표현형, P1은, 간장에 걸쳐 많은 작은 전이 종양에 대응 간이지만 비교적 낮은 로컬 성장률 정착하는 향상된 능력을 보여 주었다. 제 전이성 표현형 P2 있었다정착 낮은 주파수하지만 대형 이차 종양의 비교적 적은 수의 결과 상당히 높은 로컬 성장률. 마지막으로, 세 번째 전이성 표현형, O1과 O2는 식민지 느린 지역 성장률의 낮은 주파수를 모두 보여 주었다. 이 세 번째 전이성 표현형 임상 oligometastatic 간 질환 (도 3, 10, 5 내지 10)의 표현으로 간주 될 수있다. 또한, 유전자 발현 분석은 이들 클론을 발현 패턴 10 식별 상당한 차이를 비교. O1 및 O2 클론 P1을 비교할 때, 예를 들면, 염증성 반응과 인터페론 시그널링에 관여하는 유전자의 일부를 포함하여 756 차등 발현 유전자가 있었다. 이 연구뿐만 아니라 다른 종양의 성장과 생존 (21, 22)의 핵심 역할을 수행하는 이들 유전자를 내포하고있다. O1 및 O2에 P2를 비교할 때, 또한, 차동 expresse 461 있었다ERK1 / 2 신호를 통해 매개되는 세포의 성장과 증식에 중요한 유전자를 포함하는 부분 집합 D 유전자.

이 실험 모델에 의해 생성 된 전이성 표현형의 다양성은 전이성 이질성의 관찰 된 임상 표현과 일치한다. 예를 들면, 간 전이의 크기 (성장성에 관련된 파라미터) 및 번호 (정착 능력에 관한 파라미터) 원격 전이 독립적 인 위험 인자 인 것으로 밝혀졌다. 향상된 성장성 또는 정착 능력이, P1 및 P2에서 관찰 된 특성은 이러한 데이터와 일치한다. 또한, 정위 본체 무선 치료 (SBRT) 또는 외과 적 절제 폐전 투여군 최근 관찰은 종양의 수와 전체 결정하는 중요한 요소 무병 결과 (17, 18)와 같은 진보의 속도를 모두 가리키는. 따라서, 식민과 성장 능력에 보인다원거리 사이트 (19, 20)으로 전이 된 클론의 개발을 결정하는 가장 중요한 요소 중 일. 전이성 클론의 이들 특성에 기초 실험 모델은, 전이 현상의 메커니즘을 이해하는데 유용한 도구를 제공 할뿐만 아니라 간 전이성 질환의 치료를위한 새로운 치료 방법을 테스트하기위한 수단을 제공 할 수있다.

자발적 전이를 생성 할 수있는 소성을 모델에 적합하지만, 쉽게 재현 일관된 자발적 모델 소수가 남아있다. intracecal 주입 또는 주사를 이용하여 모델을 설명 하였지만, 그들은 흡수 및 전이 형성 23-26의 가변 속도를 보여 주었다. 다른 방법들 간 전이를 생성 intrasplenic 또는 intraportal 주사 자궁외 주입 방식을 이용하고있다. 주입의 전체 기술은 동일하지만, 여기에 제시된 모델 언더에 민감한 방법을 제공한다순환 종양 세포 (CTC)의 단계부터, 전이 현상의 메커니즘 tanding. 감도하고 방법의 재현성이 전이 과정의 역 동성을 추적하는 생물 발광 및 형광 촬상 모두를 허용하는 세포주 이중 표지에 의해 결정된다. 발광 및 형광 데이터로부터 전이 짐을 정량화하는 능력으로 인해,이를 체계적으로 측정하여 시간에 따른 전이의 성장 동역학을 추적 할 수있다. 예컨대, 초음파 기반 이미징 대안 적 방법이 사용되었지만 잠재적 증가 유저 간 27 가변성,이 양식은 훨씬 더 사용자 의존한다. 또한, 모노클로 날 세포주 패널을 발생시킴으로써, 우리는 더 나은 모델 위해 임상에서 본 전이성 질환의 변화를 재현 별개 전이성 표현형을 제공 할 수있다.

이 실험 기술을 마스터하는 동안,특히 생체 마우스 모델 (4 단계 참조)에 대한 intrasplenic 주입은 수정이 필요할 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 비장의 불충분 주입 불량한 결과를 초래할 수 있으므로 참고로 비장 주입을 수행하는 모델의 가장 중요한 부분이다. microclip의 부적절한 배치로 인한 주입, 또는 누설하는 동안 세포의 누설, 간 전이 및 / 또는 여분 간 종양 또는 복막 carcinomatoses 상당한 양의 낮은 숫자의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 인접 조직에 세포 성장의 혈관 외 유출로 이어질 수 intrasplenic 압력의 증가를 방지하기 위해, 적어도 한 프로토콜에 설명을 위해 천천히 종양 세포를 주입하는 것이 중요 비장 절제술의 그루터기 주위에 여분 간 종양.

마지막으로, 단계 4.3, 1.2 비장 주입 (주어진 셀의 범위가 - 2 × 10 6 </ SUP> 세포). 이 범위의 목적은이 기술의 개별 운영을 설명한다. 그것은 주입하는 세포의 최적의 수를 보정하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 너무 적은 세포가 주입되면 간전 지속적 발전하지 않으며, 너무 많은 세포를 주입하는 경우, 포털 정맥 폐색 동물의 조기 사망에 이르는 발생할 수있다. 최적의 수를 찾기 위해이 모델을 시작할 때 초기에 종양 세포의 여러 가지 다른 농도를 시도하는 신중한 될 수있다.

제시된 모델 중 하나 함정 그것이 면역 결핍 누드 마우스를 이종 이식 접근 방식을 기반으로 활용된다는 점이다. 제안 된 하나의 대안 방법은 쥐의 대장 세포주 MC38의 단일 클론 파생 상품의 유사한 패널의 세대, 루시 페라 제 및 tdTomato와 이중 표지 또는 EGFP 단백질. 이들 클론이어서 숙주 면역 글로불린과 현상 간전의 상호 작용을 캡쳐하기 위해 동계 동물 모델에서 사용될 수있다네브라스카 시스템.

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Acknowledgments

우리는 Luc2-tdTomato 플라스미드와 HCT116 세포주의 도움 씨 애니 Solanki (동물 자원 센터) 쥐 관리, 박사 라라 레오니 박사 제프리 L. 그린 (시카고 대학)에 감사드립니다 DLIT와. 형광 및 발광 강도의 정량화는 IVIS 스펙트럼에 시카고 대학 (퍼킨 엘머, 홉 킨톤, MA)에 통합 작은 동물 영상 연구 자원에서 수행되었다. 이 작품은 암 연구를위한 버지니아와 DK 루드비히 기금에 의해 지원되었다, 폐 암 연구 재단 (LCRF), 전립선 암 재단 (PCF) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA014599). 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

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References

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고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성
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Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).More

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