Summary
הכתבה הבאה מספקת טכניקה קלה, לשחזור כדי ליצור מודל עכבר קיימא ביעילות של מחסור בתאי גזע limbal (LSCD). במודל חיה זו שימושית בבדיקת והשוואת יעילותם של טיפולים למחלות תאי גזע limbal.
Abstract
מחסור בתאי גזע limbal (LSCD) היא מצב של תקלה או אובדן של תאי גזע אפיתל limbal, שלאחריו אפיתל הקרנית מוחלף לחמית. חולים סובלים מפגמים קרניים חוזרים, כאבים, דלקות, ואובדן הראייה.
בעבר, מודל Murine של LSCD תואר ולעומת שני מודלים אחרים. המטרה הייתה לייצר מודל עכבר עקבי של LSCD ששני מחק את הפנוטיפ בבני אדם ובבעלי נמשך מספיק זמן כדי לעשות את זה ניתן ללמוד בפתופיזיולוגיה המחלה ולהעריך טיפולים חדשים. כאן, הטכניקה מתוארת בפירוט רב יותר.
כלי ממונע עם בר מסתובב תוכנן כדי להסיר את הטבעות החלודות מפני השטח של הקרנית או להחליק מיטת pterygium בחולים. זהו מכשיר מתאים כדי ליצור את מודל LSCD הרצוי. זהו כולים זמינים, קלים לשימוש במחט דקה זה עושה את זה מתאים לעבודה על עיניים קטנות, כמובעכברים. המריחה שלו מונעת טראומה מיותרת לעין וזה לא לגרום פציעות לא רצויות, כמו שקורה לעתים קרובות עם מודלי פציעה כימית. בניגוד מגרד בוטה, הוא מסיר את האפיתל עם קרום המרתף. בפרוטוקול זה, באזור לימבלית היה משופשף פעמים, ולאחר מכן האפיתל של הקרנית כולה ומהוקצע לימבוס כדי לימבוס. כדי למנוע פציעה stroma, טיפול נלקח לא להבריש את פני הקרנית פעם האפיתל היה כבר הוסרו.
Introduction
אפיתל הקרנית נדרשים בכדי לשמור על בהירות ושלמות של הקרנית. זה מתחדש כל הזמן לאורך כל החיים על ידי תאי גזע אפיתל המתגוררים לימבוס-אזור צר בצומת של הקרנית ואת לחמית. עצמי לחידוש אלה תאי גזע limbal לשחק תפקיד מכריע התחדשות אפיתל הקרנית, הוא בדרך כלל ואחרי פציעה. דלדול חלקי או מלא של תאי גזע אלה יגרום ארוזיות בקרנית חוזרת, כאב, הצטלקות קרנית נאווסקולריזציה, מראה של תאי גביע, אם אינו מטופל, עיוורון קרני. מצב זה ידוע בתור חסר בתאי גזע limbal (LSCD) ויכול להיות אידיופטית; תוֹרַשְׁתִי; או נרכש עקב פציעות כימיות או תרמית, עדשות מגע לטווח ארוכות ללבוש, וכרוני דלקת 1-6.
מחקר על LSCD דורש מודל בעל חיים מתאים לו שלא רק מחקה את המחלה בבני אדם, אך ניתן לשחזור ובת קיימא, עם לפחותהר של פגיעה במבנים קרניים של עין אחרות. מודל זה יש צורך להעריך טיפולים ולהבהיר את מנגנוני המחלה ברמות מולקולרית תאית. כפי שתואר קודם לכן 1, עם השימוש של בר מסתובב, אפשר בקלות לפתח מודל עכבר של LSCD כי תכונות היתרונות הנ"ל נמשך לפחות שלושה חודשים. מטרת מחקר זה היא להציג מודל עכבר פשוט, לשחזור, ובר-קיימא של LSCD.
נהמתם מסתובבת הוא כלי שימושי זה שווה מסיר האפיתל מבלי לפצוע את stroma הבסיסית 1. זה כבר נעשה שימוש כדי לגרום לשחיקה קרנית מרכזית 7, 8 במחקרי ריפוי פצע. הטכניקה-המובאת כאן ליצור LSCD בעכבר טרם דווחה בעבר. בעבר הציג שיטות של גירוד האפיתל עם תוצאה מרית בוטה במדי פחות פציעה-במיוחד בבית לימבוס-ו פנוטיפ 1 משתנה יותר, 9, עם o שיקום יותררגיל ו קרני אפיתל 1. בניגוד המגרד הבוטה, הזמזום מסתובב מסיר את הקרום במרתף אפיתל כמו גם 7, 8, 10. שיטות דיווח אחרות לניתק תאי גזע לערב את השימוש בכימיקלים, כגון סודיום הידרוקסיד, n-heptanol, ו בנזלקוניום כלוריד, אשר לא רק יכול לגרום לפגיעה בלתי רצויה למבני עין בסיסיים, אלא גם עלול להוביל לדלקת משמעותית עכירות בקרנית לאחר או מטפלזיה קשקשית אפיתל 11-15. נהמתם מסתובבת אינה משויכת סיבוכים חמורים אלה. בניתוח הסרת האפיתל לימבלית, לבד או עם השימוש בכימיקלים 10, 11, 16, הוא יותר קשה לביצוע הוא לא האפשרות הטובה ביותר בחיות בעיניים קטנות epithelia לימבלית דק (כמו עכברים). בנוסף, באופן מפתיע, limbectomy עדיין עשוי להשאיר חלק האפיתל לימבלית מאחורי 10.
הטכניקה המתוארת להלן תגרום LSCD עם נאווסקולריזציהד conjunctivalization המחקה את הצגת LSCD המלא בחולים ונמשך לפחות 1 שלושה חודשים. היא מתאימה למי שואף ללמוד LSCD או פתופיזיולוגיה ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וטיפולים פוטנציאל בעכברים. ואולי, עם כמה שינויים, הליך זה יכול להתבצע אצל חולדות או ארנבות 10. כמו הבר מסתובב ביעילות מסיר את האפיתל, זה יכול להיות מנוצל בכל מחקר הנוגע שחיקה אפיתל קרנית / פציעה ובכל טיפול קשור או מחקרים בביולוגיה מולקולריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניתוחים שבוצעו על בעלי חיים לציית האגודה למחקר בדוחות חזון עיניים לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון. ארבע עשרה ארבע עד שישה חודשים בן זכר / נקבה C57BL / 6J סוג בר שימשו: עשר עכברים עבור דגם פציעה וארבעה כחיות מלאה (קרניות unwounded).
1. הכנת בעלי חיים
- להרדים עכבר עם זריקה intraperitoneal של 100 מ"ג / ק"ג קטמין תערובת 5 מ"ג / ק"ג xylazine. לאחר ההרדמה נקטה השפעה, לצבוט את בוהן כדי לאשר את עומק ההרדמה; החיה לא צריכה להגיב.
- בדוק את העין תחת מנורת סדק לפני ביצוע הניסויים כדי לוודא עדר כל פגיעה בקרנית קודמת.
- להחדיר טיפת hydrochloride tetracaine 1% אל מעל העין. לאחר 60 - 90 שניות, לבדוק את רפלקס הקרנית כדי לאשר את עדר התחושה. 0.5% hydrochloride Proparacaine יכול לשמש במקום.
- כאשר אובדן התחושה קרנית הואמסוימים, במקום ירידה של 5% povidone יוד על העין ועל השיער סביב העין בעדינות. תמחק את הירידה לאחר 1 דקות או למרוח אותו על השיער סביב העין כדי למנוע את השיער מלהתערב עם קצה הכלי.
2. כלי ליטוש האפיתל של הקרנית
- יש להשתמש בכפפות כירורגית גלימה. הכן את הכלים הנדרשים: גרגור מסתובב סטרילית פינצטה סטרילית. עבור שליטה טובה יותר, להשתמש בפינצטה מכופף. מניחים את הכלים על גיליון סטרילי במהלך ההליך.
- באמצעות פינצטה הכפוף, לייצב את העין על ידי גרירה של העפעפיים מצד האף בעדינות proptosing העין. הימנע משימוש יותר מדי לחץ.
- תחת מיקרוסקופ כירורגי, לגלח 360 ° מסביב לאזור לימבלית פעמיים באמצעות בר מסתובב סטרילי. לך סביב לימבוס עם מהירות של 5 - 6 שניות לכל סיבוב.
הערה: יש הבר מהירות אחת קבועה. עם זאת, עבור זה כדי לסובב במהירות הוקמה, "אגוז הסוף" יש להדק לחלוטין. - הסר את אפיתל הקרנית כולה מן לימבוס כדי לימבוס עם בר מסתובב. לקבלת תוצאות טובות יותר, להזיז את הכלי בצורה מעגלית והחזק אותו במקצת במקביל פני הקרנית לעבוד עם הצד הלטרלי של קצהו. יש להיזהר שלא לפגוע stroma ידי לא מחדש צחצוח באזורים שבהם האפיתל כבר הוסר. אין ליישם את כל לחץ על העין. נקה את קצה המברשת כנדרש.
- להחדיר טיפת המלח שנאגר פוספט סטרילי על הקרנית ואת למחות כל גיליונות אפיתל מנותקים עם רקמות לניקוי רהיטים רכות.
- לגלח את האפיתל הנותר, אם בכלל.
- שים לב זנב העכבר במהלך הניתוח.
הערה: אם כל תנועה מתרחשת, את עומק ההרדמה דהה וכתב הזרקה נוספת נדרשת. שליש עד שני שלישים של נפח המוזרק העיקרי צריכה להספיק. אל יתר החיה עם תרופות ההרדמה. - לעקר את כל הכלים לפני השימוש בהם על עין נוספת.
3. אשר הסרת אפיתל שלמה
- החל ירידה של 1 מ"ג / נתרן והעמסת מ"ל על הקרנית. נקו את הקרנית לאחר 30 שניות ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ עם פילטר כחול קובלט לאמת הסרה מלאה של האפיתל.
הערה: אזורים קרניים עם מומים אפיתל הם דמיינו בירוק.
4. הודעת הפעולה Care
- שים את החיה על שמיכת חימום ולשמור אותו במקום בטוח (למשל, בתוך הכלוב שלה) תוך תחת התאוששות. אין להשאיר חית מחוסר הכרה בחברה אלה בהכרה.
- החל 1% משחת עיניים אריתרומיצין. זה גם ימנע יובש בעיניים. המשך יישום ביומון אנטיביוטי במשך שבוע.
- להזריק 0.1 מ"ג / ק"ג עצירות תת עורי לאחר ההליך ושוב לאחר 12 שעות. המשך הזריקה פעמיים ביום למשך יומיים.
- שים את חית 30 - 45 דקות, עד להחלמה מלאה מן ההרדמה.
הערה: תנועה קלה של שרירי הנשימה על פני שטח הגחון מציינת בריאות חיה בזמן תחת התאוששות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתוך חודש לאחר ביצוע טכניקה זו, 100% של הקרניות שפותחו נאווסקולריזציה שטחית (איור 1 א. תמונות צולמו במצלמת מחוברת מנורת סדק תחת שדה בהיר מסנן הכחול קובלט). ב 18/20 (90%) של העיניים, נאווסקולריזציה מעורב פני הקרנית כולה (איור 1 א). ב 2/20 (10%), נאווסקולריזציה נצפתה בשלושה מארבעה רביעים קרניים, אבל זה עדיין הגיע למרכז הקרני.
כדי לאמת את התפתחות LSCD, immunostaining הר שלם בוצעה 1. שלב זה אינו חלק מן הפרוטוקול ניתן לשנות בהתאם מטרות ואינטרסים. שלוש וריאציות נחשבו כאינדיקטורים LSCD: בהעדר cytokeratin (CK) 12, חוט להט ביניים ספציפי לתאי האפיתל של הקרנית נורמלי 17, 18; מראה של CK8, סמן epithelia פשוט
רגילה, קרניות וללא כל פגע המפורש CK12-סמן ספציפי של תאי אפיתל הקרניים הבוגרים 17, 18 -throughout פני הקרנית, אך הם נטולים כל CK8 או וגביע תאים (MUC5AC) מצד הקרנית של דגימות ההר השלמות (איור 1B) . בהשוואה בעין בלתי מזוינת, ביטוי CK12 הוא נעדר כמעט על injur y קרניות מודל, תוך שהם משמעותיים להראות מכתים חיובי עבור CK8 ואת גביע תאים (איור 1B). תצפיות אלו מצביעות על התפתחות LSCD.
אם מעוניינים בכימות תוצאות immunostaining, השתמש Image-J לכמת בנפרד 20 צפיפויות immunostaining על התמונות המקוריות, ללא שינוי שנקטה מיקרוסקופ תחת אותן הגדרות. בקצרה, לבחור את החלק הקרני של מדגם ההר השלם, למדוד את הצפיפות ואזור משולבים עבור אזור זה, ולחשב את צפיפות תיקן עבור הרקע 20. יחס CK12 לצפיפויות CK8 הוצגו בעבר על מספר גדול יותר של דגימות 1. היחס המופחת בהשוואה לקבוצת ביקורת (קרניות נורמליות) ואת המראה של תאי גביע על פני הקרנית להדגים את התפתחות LSCD.
658 / 54658fig1.jpg "/>
איור 1: הפנוטיפ קרני לאחר יצירת LSCD בעכברים. בדיקה במנורת סדק מראה שכל קרניות לפתח מידה מסוימת של נאווסקולריזציה בחודש אחד (א ', בר סולם: 0.5 מ"מ). קרנית נורמלית מבטא CK12 בכל רחבי הקרניים אך הוא נטול כל CK8 או תאי גביע (MUC5AC). CK12 תיאור במודל LSCD, בעוד CK8 ואת גביע תאים להופיע על הקרנית (B, סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר טכניקה לשחזור ופשוט יחסית ליצור מודל עכבר של LSCD. ישנם כמה היבטים חשובים של מודל זה כי ראוי לציין. ראשית, מודלים בניגוד המשתמשות בכימיקלים 11, 12, הפציעה כרוכה בעיקר האפיתל פני השטח (ו קרום במרתף), עם ניזק מינימאלי stroma הקרני הבסיסי או למבנים תוך עיניים אחרות. לפיכך, יש דלקת מוגבלת בלבד וצלקות, אשר שניהם יכולים לסבך את ההליך ולעשות את זה יותר קשה להעריך את התוצאה הסופית של כל התערבויות שמטרתן תאי גזע limbal. מחקר אחרון מעניין ידי ואח Li. 10, אשר משווה את השימוש בר מסתובב עם שילובים שונים של טיפולים כירורגיים וכימיים, גם מצאו את הבר להיות בטוח ויעיל יותר ביצירת LSCD בארנבונים. שנית, המודל נראה יציב לפחות עד שלושה חודשים 1. יצירת מודל זה כרוך בשימושהזמזום מסתובב, מכשיר מוכר לרופאים שעובדים עם הקרנית, כמו גם לאלה שעושים מחקרים ופציעתם עכבר. יתרונו על פני בעזרת מרית בוטה הוא כי הפגיעה היא יותר אחידה 1 לשחזור.
כדי להיטיב להשמיד את תאי הגזע לימבלית, באזור לימבלית טופלה פעמיים. בהתבסס על ניסיון בעבודה על עיני עכבר, טיפול של יותר משני סיבובים לעתים קרובות מגרד לי כלי דם לימבלית וגורם לדימום. במקרה הטכניקה משמשת בבעלי חיים אחרים, צעד זה עשוי להיות שונה בהתאם לעובי אפיתל הקרנית. במחקר זה, כלי ממונע עם טיפ בר 0.5 מ"מ נוצל; טיפים ברים בצורות וגדלים אחרים זמינים גם וניתן להשתמש בו במקום, בהתאם למפרט קרני על גודל עין. Li et al. 10 דיווח על בר 2.5 המ"מ מתאים לשמש להסיר ארנב קרני בעקביות epithelia לימבלית.
כדי להשיג את אופטימליepithelia מכך, לימבלית ו הקרני גולח בצורה מעגלית והצד לרוחב של הבר היה בשימוש. כדי למנוע שיער בעלי חיים מלהתערב עם קצה הכלי, הירידה povidone- יוד נפרשה על השיער סביב העין, במקום להיות ומחה. הכלי לא צריך להיות מופעל באופן סטטי במקום אחד, מאחר והדבר עלול לגרום ניקוב. טיפול לימבוס בקצב מאוד איטי יכול לגרום לדימום; במהירות של כמעט 6 שניות לכל סיבוב מתאים עין עכבר C57BL / 6J. זה קריטי כדי למנוע מחדש צחצוח stroma החשוף, כמו זה יהיה לגרום יותר דלקות opacification stroma. לחץ אין להחיל את העין תוך abrading האפיתל. לאחר ההליך, הקרנית הייתה מוכתמת צבע פלואורסצנטי לוודא הסרת האפיתל להשלים. חשוב כדי למנוע יובש בעיניים במהלך ההתאוששות מן החי. מגבלות הן כי טכניקה זו לא ניתן להסיר 100% של תאי גזע. כמו כן במידה מסוימת למפעיל תלוי דורש תרגול לתת שיתוףתוצאות nsistent.
כאשר לומדים את הפנוטיפ אפיתל הקרני, כל מכתים ההר הוא הדרך הטובה ביותר להעריך את סיכויי מודל זה. זאת, משום שהיא מאפשרת האפיתל של הקרנית כולה להיבדק בבת אחת, ואילו חתכים ינתנו מידע רק על כל מקטע מסוים.
טכניקה לשליטה זה יכול לגרום LSCD בעכברים, וכנראה גם חיות אחרות. הוא מספק מודל מתאים של LSCD ללמוד טיפולים חדשניים ולגלות היבטים רחבים יותר של הפתופיזיולוגיה המחלה. עם כמה שינויים, זה יכול להיות שימושי בלימוד ריפוי פצע בקרנית, אנגיוגנזה, lymphangiogenesis גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים רות Zelkha, MS, על עזרתם הנדיבה שלה בתחום ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי פרס תכנית קליני פיתוח מדען K12EY021475 לי, להעניק R01 EY024349-01A1 כדי ARD, EY01792 מענק הליבה של העין הלאומית, NIH, וכן מענק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון. ARD הוא הנמען של פרס פיתוח קריירה של מחקר כדי למנוע עיוורון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
