Summary
Het volgende artikel biedt een eenvoudige, reproduceerbare techniek om effectief een duurzame muismodel van limbale stamcellen deficiëntie (LSCD). Dit diermodel is bruikbaar bij het testen en vergelijken van de werkzaamheid van behandelingen voor limbale stamcellen ziekten.
Abstract
Limbale stamcellen deficiëntie (LSCD) is een staat van een storing of verlies van limbale epitheliale stamcellen, waarna de hoornvliesepitheel wordt vervangen door bindvlies. Patiënten die lijden aan terugkerende afwijkingen aan de cornea, pijn, ontsteking, en het verlies van het gezichtsvermogen.
Voorheen, een muizenmodel van LSCD beschreven en vergeleken met twee andere modellen. Het doel was om een consistente muismodel van LSCD dat zowel bootst het fenotype bij mensen en duurt lang genoeg om het mogelijk de ziekte pathofysiologie bestuderen en nieuwe behandelingen te evalueren produceren. Hier is de techniek gedetailleerder beschreven.
Een gemotoriseerde werktuig met een roterende frees is ontworpen om de roest ringen van het corneale oppervlak te verwijderen of om de pterygium bed glad patiënten. Het is een geschikte inrichting om het gewenste LSCD model te maken. Het is een direct beschikbaar, eenvoudig te gebruiken tool met een fijne tip dat het geschikt is voor het werken op kleine ogen maakt, zoalsin muizen. De toepassing voorkomt onnodige trauma aan het oog en het niet leidt tot ongewenste verwondingen, zoals vaak het geval is bij chemische verwonding modellen. In tegenstelling tot een botte schraper, verwijdert het epitheel van de basale membraan. In dit protocol werd het limbale gebied tweemaal afgesleten, en vervolgens werd het gehele hoornvliesepitheel geschoren van limbus tot limbus. Om stroma letsel te voorkomen, werd verzorgd het hoornvlies niet te poetsen wanneer het epitheel was al verwijderd.
Introduction
Het hoornvliesepitheel is vereist om de duidelijkheid en integriteit van de cornea te behouden. Het voortdurend wordt ververst gedurende het hele leven van de epitheliale stamcellen die in de limbus-een smalle zone op de kruising van het hoornvlies en het bindvlies. Deze zelf-vernieuwing van limbale stamcellen spelen een cruciale rol in het regenereren van het hoornvliesepitheel, zowel normaal en na een blessure. Gedeeltelijke of volledige uitputting van stamcellen resulteert in cornea-erosie, pijn, corneale littekenvorming en neovascularisatie uiterlijk van slijmbekercellen en indien onbehandeld, corneale blindheid. Deze aandoening staat bekend als limbale stamcellen deficiëntie (LSCD) en kan idiopathische worden; erfelijke; of verworven als gevolg van chemische of thermische verwondingen, op lange termijn contactlenzen dragen, en chronische ontsteking 1-6.
Onderzoek naar LSCD is een geschikte diermodel dat niet alleen bootst de ziekte bij mensen, maar reproduceerbaar en duurzaam met de minst eenmount van letsel aan andere hoornvlies en oculaire structuren. Dit model is noodzakelijk om behandelingen te beoordelen en de mechanismen ziekte op moleculaire en cellulaire niveaus verduidelijken. 1 als hiervoor beschreven, met behulp van een roterende frees, kan men gemakkelijk ontwikkelen een muismodel van LSCD dat de bovengenoemde voordelen biedt en blijft gedurende ten minste drie maanden. Het doel van deze studie is om een eenvoudige, reproduceerbare en duurzame muismodel van LSCD presenteren.
De roterende braam is een handige tool die gelijkmatig verwijdert het epitheel zonder verwonden de onderliggende stroma 1. Het is gebruikt om centrale corneale erosie 7, 8 in wondgenezing studies induceren. Het hierbij gepresenteerde techniek LSCD creëren een muis is niet eerder gerapporteerd. Eerder geïntroduceerde methoden schrapen het epitheel met een stompe spatel resulteren in een minder uniform letsel-vooral de limbus-en een variabel fenotype 1, 9, meer uitgevoerde restauratief normale hoornvliesepitheel 1. In tegenstelling tot de stompe schraper, de roterende frees verwijdert het epitheliale basismembraan en 7, 8, 10. Andere gerapporteerde methoden om stamcellen te scheiden omvatten het gebruik van chemische stoffen, zoals natriumhydroxide, n-heptanol en benzalkoniumchloride, die niet alleen ongewenste schade kunnen veroorzaken aan de onderliggende oogstructuren, maar ook kan leiden tot significante ontsteking en daaropvolgende corneale troebelingen of epitheliale squameuze metaplasie 11-15. De roterende braam wordt niet geassocieerd met deze ernstige complicaties. Het chirurgisch verwijderen van de limbale epitheel, alleen of met het gebruik van chemicaliën 10, 11, 16, is moeilijk uit te voeren en is niet de beste optie bij dieren met kleine ogen en een dunne limbale epitheel (zoals muizen). Bovendien, verrassend, limbectomy kan nog steeds laat een aantal van de limbale epitheel achter 10.
De hieronder beschreven techniek leidt tot een LSCD met neovascularisatied conjunctivalization dat de presentatie van de volledige LSCD bij patiënten nabootst en duurt ten minste drie maanden 1. Het is geschikt voor mensen die willen LSCD of wondgenezing pathofysiologie, immunologie en mogelijke behandelingen in muizen te bestuderen. Eventueel met enkele wijzigingen, deze procedure kan worden uitgevoerd bij ratten of konijnen 10. Aangezien de roterende braam efficiënt het epitheel verwijderd, kan worden gebruikt in elk onderzoek over corneale epitheel abrasie / verwonding en verwante behandeling of moleculaire biologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures uitgevoerd op dieren aan de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde verklaringen voor het gebruik van dieren in de visie onderzoek. Veertien van vier tot zes maanden oude mannelijke / vrouwelijke C57BL / 6J wild-type muizen werden gebruikt: tien muizen voor de schade model en vier als controle dieren (verwonde hoornvlies).
1. Dierlijke Voorbereiding
- Verdoven een muis met een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine mengsel. Na de narcose in werking is getreden, knijpen de teen aan de narcose diepte te bevestigen; het dier niet reageert.
- Inspecteer het ooglid een spleetlamp voor het uitvoeren van de experimenten de afwezigheid van een eerdere cornealetsel verifiëren.
- Druppelen een druppel 1% tetracaïne waterstofchloride op het oog. Na 60-90 seconden, het testen van de cornea reflex om de afwezigheid van de sensatie te bevestigen. Proparacaïne hydrochloride 0,5% kan worden gebruikt.
- Wanneer het verlies van cornea sensatiebepaalde, plaats voorzichtig een daling van 5% povidonjood op het oog en het haar rond de ogen. Veeg de daling na 1 min of verspreid het op het haar rond het oog om te voorkomen dat het haar uit te bemoeien met de penpunt.
2. Schurend het hoornvliesepitheel
- Draag chirurgische handschoenen en een jurk. Bereid de benodigde hulpmiddelen: een steriel roterende braam en een paar steriele pincet. Voor een betere controle, gebruik gebogen pincet. Plaats het gereedschap op een steriele plaat tijdens de procedure.
- Met behulp van de gebogen pincet, stabiliseren het oog door grijpen de deksels van de nasale kant en voorzichtig proptosing het oog. Vermijd het gebruik van te veel druk.
- Onder een chirurgische microscoop, scheren 360 ° rond de limbale gebied twee keer met behulp van de steriele roterende braam. Ga rond de limbus met een snelheid van 5-6 sec per ronde.
NB: De braam heeft een vaste snelheid. Echter, voor te roteren met de vastgestelde snelheid, het "einde moer" worden volledig vastgedraaid. - Verwijder de hele hoornvliesepitheel van limbus tot limbus met de roterende braam. Voor betere resultaten, verplaats het gereedschap in een circulaire mode en houd hem enigszins parallel aan het oppervlak van de cornea te werken met de zijkant van haar tip. Zorg ervoor het stroma door niet opnieuw het poetsen van de gebieden waar het epitheel is al verwijderd niet te verwonden. Gebruik geen druk op het oog niet van toepassing. Reinig de brush tip zoals vereist.
- Druppelen een druppel steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing op het hoornvlies en veeg eventueel vrijstaande epitheelvellen met een zacht schoonmaakdoekje.
- Scheer de resterende epithelium, indien aanwezig.
- Besteed aandacht aan de staart van de muis tijdens de operatie.
LET OP: Als een beweging zich voordoet, heeft de narcose diepte verschoten en verdere injectie nodig is. Een derde tot tweederde van de primaire geïnjecteerde volume voldoende. Heeft het dier met het verdovingsmiddel medicatie overdosis. - Steriliseer alle instrumenten voordat u ze op een andere oog.
3. Bevestig Compleet Epitheliale Removal
- Breng een druppel van 1 mg / ml fluoresceïne sodium op het hoornvlies. Reinig het hoornvlies na 30 sec en onderzoek onder een microscoop met een kobaltblauw filter om de volledige verwijdering van het epitheel te controleren.
LET OP: Cornea gebieden met epitheliale gebreken worden gevisualiseerd in groen.
4. Post-Onderhoudstoets
- Leg het dier op een verwarming deken en bewaar deze op een veilige plaats (bijvoorbeeld in zijn kooi), terwijl in het kader van herstel. Heeft een onbewuste dier niet te houden in het gezelschap van bewuste degenen.
- Breng 1% erytromycine oogzalf. Dit zal ook voorkomen droge ogen. Ga door met de applicatie het antibioticum dagelijks voor een week.
- Injecteer 0,1 mg / kg subcutaan buprenorfine na de procedure en opnieuw na 12 uur. Verdere injectie tweemaal per dag gedurende twee dagen.
- Observeer het dier voor 30 - 45 min, tot volledig herstel van anesthesie.
NOTITIE: Lichte beweging van de ademhalingsspieren van de ventrale oppervlak aan dierlijk welzijn terwijl onder herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Binnen een maand na het uitvoeren van deze techniek, 100% van de cornea ontwikkelde oppervlakkige neovascularisatie (Figuur 1A. Er werden foto's genomen met een camera verbonden met een spleetlamp onder helderveld en kobalt blauw filter). In 18/20 (90%) van de ogen, neovascularisatie betrokken het gehele hoornvlies (Figuur 1A). In 2/20 (10%), werd neovascularisatie waargenomen in drie van de vier kwadranten cornea, maar toch bereikte het corneale centrum.
Om de ontwikkeling van LSCD te valideren, werd ganse berg immunokleuring uitgevoerd 1. Deze stap maakt geen deel uit van het protocol en kan worden aangepast afhankelijk van doelen en belangen. Drie varianten werden beschouwd als indicatoren van LSCD: geen cytokeratine (CK) 12, een tussenliggende filamenten specifiek voor normale corneale epitheelcellen 17, 18; verschijning van CK8, een eenvoudige epitheel marker
Normale, niet-beschadigde hoornvlies express ck12-specifieke marker van rijpe corneale epitheelcellen 17, 18 -throughout het hoornvlies, maar zijn verstoken van elke CK8 of slijmbekercellen (MUC5AC) op het hoornvlies deel van de ganse berg monsters (Figuur 1B) . In vergelijking met normale ogen, ck12 uitdrukking is bijna afwezig injur y model hoornvliezen, terwijl ze aanzienlijk tonen positieve kleuring voor CK8 en slijmbekercellen (Figuur 1B). Deze waarnemingen geven aan de ontwikkeling van LSCD.
Indien u interesse hebt in het kwantificeren van de immunokleuring resultaten gebruikt u Image-J afzonderlijk te kwantificeren 20 immunokleuring dichtheden op de originele, ongewijzigde foto's van de microscoop op grond van dezelfde instellingen. In het kort, selecteer het hoornvlies deel van de hele berg monster, het meten van de geïntegreerde dichtheid en ruimte voor die regio, en het berekenen van de gecorrigeerde dichtheid voor de achtergrond 20. De verhouding van ck12 tot CK8 dichtheden werden eerder gepresenteerd op een groter aantal monsters 1. De verlaagde verhouding in vergelijking met controles (normale cornea) en het verschijnen van slijmbekercellen op het hoornvlies tonen de ontwikkeling van LSCD.
658 / 54658fig1.jpg "/>
Figuur 1: Cornea fenotype na het maken LSCD in Muizen. Spleetlamponderzoek onderzoek blijkt dat alle hoornvliezen ontwikkelen een zekere mate van neovascularisatie met een maand (A, Schaal bar: 0,5 mm). Een normale cornea uitdrukt ck12 over het hoornvlies, maar is verstoken van elke CK8 of slijmbekercellen (MUC5AC). Ck12 afwezig is in de LSCD model, terwijl CK8 en slijmbekercellen op het hoornvlies (B, Schaal bar: 200 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een reproduceerbare en betrekkelijk eenvoudige techniek om een muismodel van LSCD creëren. Er zijn een aantal belangrijke aspecten van dit model dat het vermelden waard zijn. Ten eerste, in tegenstelling modellen die chemicaliën 11, 12 gebruikt, de schade betreft hoofdzakelijk de oppervlakte-epitheel (en basaalmembraan), met minimale schade aan de onderliggende hoornvliesstroma of andere intraoculaire structuren. Er is dus slechts beperkte ontsteking en littekenvorming, die beide de procedure compliceren en maken het moeilijker om de uitkomst van elke interventies gericht op het limbale stamcellen beoordelen. Een interessante recente studie van Li et al. 10, die het gebruik van de roterende frees met verschillende combinaties van chirurgische en chemische behandelingen vergelijkt, vond ook de braam veiliger en effectiever maken LSCD in konijnen. Ten tweede, het model lijkt stabiel te zijn gedurende ten minste drie maanden tot 1. Maken dit model omvat het gebruik vande roterende frees, een instrument dat bekend voor artsen die met de cornea, alsmede die muis verwonding studies doen. Het voordeel ten opzichte van het gebruik van een botte spatel is dat de schade is meer uniform en reproduceerbaar 1.
Beter vernietigen limbale stamcellen, werd de limbale gebied tweemaal behandeld. Op basis van ervaring op muis ogen, de behandeling van meer dan twee patronen abrades vaak limbale bloedvaten en veroorzaakt bloeden. Indien deze techniek wordt toegepast op andere dieren, kan deze stap worden aangepast afhankelijk van het corneale epitheel dikte. In deze studie, een gemotoriseerde tool met een 0,5-mm braam tip werd benut; braam tips in andere vormen en maten zijn ook beschikbaar en kan in plaats daarvan worden gebruikt, afhankelijk van het hoornvlies van het bestek en op het oog grootte. Li et al. 10 meldde de 2,5-mm braam geschikt om consequent te verwijderen konijn hoornvlies en limbale epitheel te zijn.
Om het optimale te verkrijgenDaardoor limbale en cornea epitheel werden geschoren in een circulaire mode en de laterale zijde van de braam werd gebruikt. Om te voorkomen dat het dier haar interfereren met de penpunt, werd de povidonjood druppel verspreid op het haar rond het oog, in plaats van geveegd. Het gereedschap mag niet statisch worden gebruikt in één plaats omdat deze perforatie veroorzaken. Het behandelen van de limbus in een zeer traag tempo kan leiden tot bloeden; een snelheid van bijna 6 seconden per ronde geschikt om C57BL / 6J muizen oog. Het is cruciaal om opnieuw borstelen van de kale stroma te voorkomen, omdat dit meer ontsteking en stroma opacificatie zal leiden. Druk mag niet worden toegepast op het oog terwijl schurende het epitheel. Na de behandeling werd de cornea gekleurd met fluoresceïne kleurstof zorgen volledig epitheliale verwijdering. Het is belangrijk om droge ogen te voorkomen tijdens herstel dier. Beperkingen zijn dat deze techniek niet kan verwijderen 100% van de stamcellen. Het is ook enigszins afhankelijk van de operator en vereist oefening om de samenwerking te gevennsistent resultaten.
Bij het bestuderen van de cornea epitheel fenotype, ganse berg kleuring is de beste manier om de uitkomst van dit model te evalueren. Dit is omdat het de hele hoornvliesepitheel tegelijkertijd worden geëvalueerd, terwijl doorsneden alleen informatie over elke bepaalde sectie zou geven.
Deze techniek kan bestuurbare LSCD bij de muis, en waarschijnlijk andere dieren. Het een geschikt model LSCD om nieuwe behandelingen te bestuderen en bredere aspecten van de ziekte pathofysiologie ontdekken. Met enige aanpassingen, kan het nuttig zijn bij het bestuderen van het hoornvlies wondgenezing, angiogenese en lymfangiogenese ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken Ruth Zelkha, MS, voor haar genereuze hulp in de beeldvorming. Dit onderzoek werd gesteund door Clinical Development Program Scientist Award K12EY021475 MIJ verlenen R01 EY024349-01A1 om ARD, kern subsidie EY01792 van de National Eye Institute, NIH, en een onbeperkte subsidie van Onderzoek ter voorkoming van Blindheid. ARD is de ontvanger van een Career Development Award van Onderzoek ter voorkoming van Blindheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
