Summary
L'article suivant fournit, une technique reproductible facile de créer efficacement un modèle de souris durable de la carence en cellules souches limbiques (LSCD). Ce modèle animal est utile pour tester et comparer l'efficacité des traitements pour les maladies de cellules souches limbiques.
Abstract
carence en cellules souches limbiques (LSCD) est un état de dysfonctionnement ou de perte de cellules souches épithéliales limbiques, après quoi l'épithélium cornéen est remplacé par conjonctive. Les patients souffrent de défauts récurrents de la cornée, la douleur, l'inflammation et la perte de vision.
Auparavant, un modèle murin de LSCD a été décrite et comparée aux deux autres modèles. L'objectif était de produire un modèle de souris cohérente de LSCD que les deux imite le phénotype chez l'homme et dure assez longtemps pour permettre d'étudier la physiopathologie de la maladie et d'évaluer de nouveaux traitements. Ici, la technique est décrite plus en détail.
Un outil motorisé avec une fraise rotative a été conçu pour enlever les anneaux de rouille de la surface de la cornée ou de lisser le lit de ptérygion chez les patients. Il est un dispositif approprié pour créer le modèle de LSCD souhaité. Il est un outil facile à utiliser facilement disponibles avec une pointe fine qui le rend approprié pour travailler sur de petits yeux, commechez la souris. Son application empêche les traumatismes inutiles à l'œil et il ne donne pas lieu à des blessures non désirées, comme cela est souvent le cas avec les modèles de lésion chimique. Par opposition à un grattoir émoussé, il élimine l'épithélium de la membrane basale. Dans ce protocole, la zone limbique a été abrasée deux fois, puis l'ensemble de l'épithélium cornéen a été rasée de limbe à limbe. Pour éviter les blessures de stroma, on a pris soin de ne pas brosser la surface de la cornée, une fois l'épithélium a déjà été supprimé.
Introduction
L'épithélium cornéen est nécessaire pour maintenir la clarté et l'intégrité de la cornée. Il est sans cesse renouvelée tout au long de la vie par les cellules souches épithéliales résidant dans la-un limbe zone étroite à la jonction de la cornée et la conjonctive. Ces cellules souches limbiques auto-renouvellement jouent un rôle crucial dans la régénération de l'épithélium cornéen, à la fois normalement et après une blessure. déplétion partielle ou complète de ces cellules souches se traduira par des érosions cornéennes récurrentes, la douleur, la cicatrisation de la cornée et de la néovascularisation, l'apparition de cellules caliciformes, et l'absence de traitement, la cécité cornéenne. Cette condition est connue comme la déficience limbique de cellules souches (LSCD) et peut être idiopathique; héréditaire; ou acquis en raison de blessures chimiques ou thermiques, des lentilles de contact à long terme portent, et l' inflammation chronique 1-6.
La recherche sur LSCD nécessite un modèle animal approprié qui, non seulement imite la maladie chez les humains, mais est reproductible et durable, avec le moinsmontage de blessures à d'autres structures cornéennes et oculaires. Ce modèle est nécessaire pour évaluer les traitements et de clarifier les mécanismes de la maladie au niveau moléculaire et cellulaire. 1 comme décrit précédemment, avec l'utilisation d'une fraise rotative, on peut aisément développer un modèle murin de LSCD qui présente les avantages précités et persiste pendant au moins trois mois. Le but de cette étude est de présenter un modèle simple, reproductible et durable souris LSCD.
La fraise rotative est un outil pratique qui élimine uniformément l'épithélium sans blesser le stroma sous - jacent 1. Il a été utilisé pour induire une érosion de la cornée centrale 7, 8 dans les études de cicatrisation des plaies. La technique de la présente-présenté pour créer LSCD dans une souris n'a pas été signalée auparavant. Auparavant introduit des méthodes de grattage de l'épithélium avec un résultat de spatule contondant dans un moins uniforme blessure particulièrement au niveau du limbe et un phénotype plus variable 1, 9, avec plus de restauration of épithélium de la cornée normale 1. A la différence du racleur émoussé, la fraise rotative retire la membrane basale epitheliale et 7, 8, 10. D'autres méthodes rapportées pour sectionner les cellules souches comprennent l'utilisation de produits chimiques tels que l'hydroxyde de sodium, le n-heptanol et le chlorure de benzalkonium, qui non seulement peut induire des lésions indésirables aux structures de l'œil sous-jacentes, mais peut aussi conduire à une inflammation significative et opacification de la cornée postérieure ou épithéliale métaplasie squameuse 11-15. La fraise rotative est pas associée à ces complications graves. Enlever chirurgicalement l'épithélium limbique, seul ou avec l'utilisation de produits chimiques 10, 11, 16, est plus difficile à réaliser et est pas la meilleure option chez les animaux avec de petits yeux et un épithéliums limbique mince (comme des souris). En outre, de manière surprenante, limbectomy peut encore laisser une partie de l'épithélium limbique derrière 10.
La technique décrite ci-dessous se traduira par LSCD avec néovascularisation uned conjunctivalization qui imite la présentation LSCD complète chez les patients et dure pendant au moins trois mois 1. Il est adapté pour ceux qui visent à étudier LSCD ou physiopathologie de la cicatrisation des plaies, l'immunologie et les traitements potentiels chez la souris. Éventuellement, avec quelques modifications, cette procédure peut être effectuée chez des rats ou des lapins 10. Comme fraise rotative élimine efficacement l'épithélium, il peut être utilisé dans toute recherche se rapportant à l'épithélium de la cornée à l'abrasion / blessures et dans tous les traitements liés ou des études de biologie moléculaire.
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Protocol
Toutes les procédures effectuées sur les animaux sont conformes à l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie déclarations pour l'utilisation des animaux dans la recherche de vision. Quatorze de quatre à / / 6J mâles de six mois vieilles femelles C57BL sauvages de type ont été utilisés: dix souris pour le modèle de lésion et quatre comme animaux témoins (cornées non blessés).
1. Préparation d'un animal
- Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de kétamine et / kg de xylazine mélange de 5 mg. Après l'anesthésie a pris effet, pincer la pointe pour confirmer la profondeur de l'anesthésie; l'animal ne doit pas réagir.
- Inspecter l'œil sous une lampe à fente avant d'effectuer les expériences afin de vérifier l'absence de toute lésion de la cornée précédente.
- Instiller une goutte de 1% de chlorhydrate de tétracaïne sur l'oeil. Après 60-90 secondes, tester le réflexe cornéen pour confirmer l'absence de sensation. Proparacaine chlorhydrate de 0,5% peut être utilisé à la place.
- Lorsque la perte de sensibilité cornéenne estcertains, placez doucement une goutte de 5% de povidone-iode sur l'oeil et sur les cheveux autour de l'oeil. Essuyer la goutte après 1 min ou l'étaler sur les cheveux autour de l'œil pour empêcher les cheveux d'interférer avec la pointe de l'outil.
2. abraser l'épithélium cornéen
- Porter des gants chirurgicaux et une robe. Préparer les outils nécessaires: une fraise rotative stérile et une paire de pinces stériles. Pour un meilleur contrôle, utiliser des pinces courbées. Placez les outils sur une feuille stérile pendant la procédure.
- À l'aide des pinces courbées, stabiliser l'œil en saisissant les couvercles du côté nasal et proptosing doucement l'œil. Évitez d'utiliser trop de pression.
- Sous un microscope chirurgical, raser 360 ° autour de la zone limbique deux fois en utilisant la fraise rotative stérile. Faites le tour du limbe avec une vitesse de 5-6 secondes par tour.
NOTE: Le trépan a une vitesse fixe. Cependant, pour le faire tourner à la vitesse établie, le "écrou de fin" doit être complètement serré. - Enlever l'ensemble de l'épithélium cornéen limbique à limbe avec la meule en rotation. Pour de meilleurs résultats, déplacer l'outil de façon circulaire et maintenez-le peu parallèle à la surface de la cornée à travailler avec le côté latéral de la pointe. Prenez soin de ne pas blesser le stroma en ne re-brossant les zones où l'épithélium a déjà été supprimé. Ne pas appliquer de pression sur l'œil. Nettoyez la pointe du pinceau, au besoin.
- Instiller une goutte de solution saline tamponnée au phosphate stérile sur la cornée et essuyer les feuilles épithéliales détachées avec un tissu de nettoyage doux.
- Raser l'épithélium restant, le cas échéant.
- Faites attention à la queue de la souris pendant la chirurgie.
NOTE: Si un mouvement se produit, la profondeur de l'anesthésie a disparu et injection supplémentaire est nécessaire. Un tiers à deux tiers du volume injecté primaire devrait être suffisante. Ne pas surdoser l'animal avec le médicament anesthésique. - Stériliser tous les outils avant de les utiliser sur un autre œil.
3. Confirmer complète Retrait épithéliale
- Appliquer une goutte de 1 mg / ml de fluorescéine sodique sur la cornée. Nettoyer la cornée après 30 secondes et l'examiner sous un microscope avec un filtre bleu de cobalt pour vérifier le retrait complet de l'épithélium.
REMARQUE: Les zones cornéennes avec des défauts épithéliales sont visualisés en vert.
4. Post-opération de soins
- Mettez l'animal sur une couverture chauffante et le garder dans un endroit sûr (par exemple, dans sa cage) , tandis que dans la récupération. Ne pas garder un animal inconscient en compagnie de ceux conscients.
- Appliquer 1% érythromycine pommade ophtalmique. Cela permettra également de prévenir la sécheresse oculaire. Poursuivre l'application du quotidien antibiotique pendant une semaine.
- Injecter 0,1 mg / kg par voie sous-cutanée buprénorphine après la procédure et à nouveau après 12 heures. Continuer l'injection deux fois par jour pendant deux jours.
- Observez l'animal pour 30 - 45 min, jusqu'à la récupération complète de l'anesthésie.
REMARQUE: Mouvement doux des muscles respiratoires sur la surface ventrale indique le bien-être des animaux tandis que sous la récupération.
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Representative Results
Moins d' un mois après avoir effectué cette technique, 100% des cornées a développé une néovascularisation superficielle (figure 1A. Les photos ont été prises avec un appareil connecté à une lampe à fente sous un champ lumineux et filtre bleu de cobalt). Dans 18/20 (90%) des yeux, la néovascularisation impliquait la totalité de la surface de la cornée (figure 1A). Dans 2/20 (10%), la néovascularisation a été observée dans trois des quatre quarts de cercle de la cornée, mais elle atteint toujours le centre de la cornée.
Pour valider le développement de LSCD, toute immunocoloration montage a été effectué 1. Cette étape ne fait pas partie du protocole et peut être modifié en fonction des objectifs et des intérêts. Trois variantes ont été considérées comme des indicateurs de LSCD: absence de cytokératine (CK) 12, un filament intermédiaire spécifique à des cellules normales de l' épithélium cornéen 17, 18; apparition de CK8, un marqueur de épithéliums simples
, Les cornées normales indemnes express CK12-un marqueur spécifique des cellules épithéliales cornéennes matures 17, 18 -throughout la surface de la cornée, mais elles sont dépourvues de CK8 ou Goblet cellules (MUC5AC) sur la partie de la cornée de l'ensemble des échantillons de montage (figure 1B) . En comparaison avec les yeux normaux, l'expression de CK12 est presque absent sur injur cornées modèle y, alors qu'ils montrent de manière significative coloration positive pour CK8 et caliciformes cellules (figure 1B). Ces observations indiquent le développement de LSCD.
Si vous êtes intéressé à quantifier les résultats d'immunocoloration, utilisez Image-J pour quantifier séparément 20 densités immunocoloration sur les images non modifiées originales prises par le microscope dans les mêmes paramètres. En bref, sélectionnez la partie de la cornée de l'ensemble de l' échantillon de montage, mesurer la densité intégrée et la superficie de cette région, et de calculer la densité corrigée pour le fond 20. Le rapport entre les densités CK8 CK12 a été précédemment présentée sur un plus grand nombre d'échantillons 1. Le ratio réduit par rapport aux témoins (les cornées normales) et l'apparition de cellules caliciformes de la surface de la cornée montrent le développement de LSCD.
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Figure 1: Phénotype cornéenne après la création d' LSCD chez la souris. Examen de la lampe à fente montre que tous les cornées développent un certain degré de néovascularisation d'un mois (A, Barre d'échelle: 0,5 mm). Une cornée normale exprime CK12 toute la cornée, mais est dépourvue de CK8 ou cellules caliciformes (MUC5AC). CK12 est absent dans le modèle de LSCD, tandis que CK8 et les cellules caliciformes apparaissent sur la cornée (B, Barre d' échelle: 200 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cet article décrit une technique reproductible et relativement simple pour créer un modèle de souris de LSCD. Il y a plusieurs aspects importants de ce modèle qui méritent d'être soulignées. Premièrement, les modèles à la différence qui utilisent des produits chimiques 11, 12, la blessure implique principalement l'épithélium de surface (et membrane basale), avec un minimum de dommages à l'stroma cornéen sous - jacente ou à d' autres structures intraoculaires. Ainsi, il n'y a que l'inflammation et la cicatrisation limitée, les deux qui peut compliquer la procédure et la rendre plus difficile d'évaluer le résultat de toutes les interventions visant à les cellules souches limbiques. Une récente étude intéressante par Li et al. 10, qui compare l'utilisation de la fraise rotative avec différentes combinaisons de traitements chirurgicaux et chimiques a également constaté la bavure d'être plus sûrs et plus efficaces pour créer LSCD chez le lapin. D' autre part, le modèle semble être stable pendant au moins trois mois à 1. La création de ce modèle implique l'utilisation d'la fraise rotative, un instrument qui est familier pour les cliniciens qui travaillent avec la cornée, ainsi que pour ceux qui font des études blessantes de la souris. Son avantage par rapport à l' aide d' une spatule émoussée est que la blessure est plus uniforme et reproductible 1.
Pour mieux détruire les cellules souches limbiques, la zone limbique a été traité deux fois. Sur la base de l'expérience de travail sur les yeux de souris, le traitement de plus de deux tours abrase souvent des vaisseaux sanguins limbiques et provoque des saignements. Dans le cas où la technique est utilisée dans d'autres animaux, cette étape peut être modifiée en fonction de l'épaisseur de l'épithélium de la cornée. Dans cette étude, un outil motorisé avec une pointe de trépan de 0,5 mm a été utilisé; conseils trépan dans d'autres formes et tailles sont également disponibles et peuvent être utilisés à la place, selon les spécifications de la cornée et de la taille des yeux. Li et al. 10 ont rapporté 2,5 mm ronce être approprié pour éliminer systématiquement le lapin cornéenne et épithéliums limbique.
Pour obtenir la valeur optimaleRésultat, épithéliums de la cornée et limbiques ont été rasées de manière circulaire et le côté latéral de la meule a été utilisé. Pour éviter les poils des animaux d'interférer avec la pointe de l'outil, la chute de povidone-iode a été étalé sur les cheveux autour de l'œil, au lieu d'être rayé. L'outil ne doit pas être utilisé statiquement dans un seul endroit, car cela peut provoquer une perforation. Traiter le limbe à un rythme très lent peut entraîner des saignements; une vitesse de près de 6 sec par tour est adapté pour un oeil de la souris C57BL / 6J. Il est essentiel pour éviter la ré-brossant le stroma nue, car cela va induire plus d'inflammation et de stroma opacification. La pression ne doit pas être appliqué à l'oeil tout abraser l'épithélium. Après la procédure, la cornée a été colorée avec de la fluorescéine colorant pour en assurer l'élimination complète de l'épithélium. Il est important de prévenir le dessèchement de l'oeil lors de la récupération des animaux. Les limitations sont que cette technique ne peut pas supprimer 100% des cellules souches. Il est également peu dépendante de l'opérateur et nécessite la pratique de donner coRésultats nsistent.
Lors de l'étude du phénotype de l'épithélium cornéen, toute coloration de montage est la meilleure façon d'évaluer les résultats de ce modèle. En effet, il permet à l'ensemble de l'épithélium cornéen à évaluer à la fois, alors que des sections ne donneraient des informations sur chaque section particulière.
Cette technique contrôlable peut induire LSCD chez la souris, et probablement dans d'autres animaux. Il fournit un modèle de LSCD approprié pour étudier de nouveaux traitements et de découvrir des aspects plus larges de la physiopathologie de la maladie. Avec quelques modifications, il peut être utile dans l'étude de la plaie cicatrisation de la cornée, l'angiogenèse et la lymphangiogenèse aussi.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient Ruth Zelkha, MS, pour sa généreuse assistance en imagerie. Cette recherche a été soutenue par le Programme de développement scientifique clinique K12EY021475 Award ME, accorder R01 EY024349-01A1 à ARD, noyau subvention EY01792 du National Eye Institute, NIH, et une subvention sans restriction de recherche visant à prévenir la cécité. ARD est le récipiendaire d'une bourse de développement de carrière de la recherche pour prévenir la cécité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
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