Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
פיתוח חומרים ביולוגיים גדל באופן משמעותי את פוטנציאל שיגור תרופות למגוון של סוגי תאים ורקמות, כולל β-תאי הלבלב. בנוסף, חלקיקים ביולוגיים, הידרוג, ופיגומים גם מספקים הזדמנות ייחודית לניהול מתמשך, משלוח סמים לשליטה על בטא תאים בתרבית ו במודלי רקמה מושתלות. טכנולוגיות אלו מאפשרות בחקר גורמי התפשטות β-cell המועמד באמצעות איי שלמים ומערכת רלוונטית translationally. יתר על כן, בקביעה האפקטיבית ואת הכדאיות של גורמי מועמד בהמרצת ההתרבות β-cell במערכת תרבות היא קריטית לפני לנוע קדימה מודלי in vivo. בזאת, אנו מתארים שיטת שיתוף תרבות איי עכבר שלמים עם מתחם מתכלה של עניין (COI) פולי -loaded (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) (PLGA) microspheres לצורך הערכת ההשפעות של שנגרם o שחרור באתרוגורמים mitogenic f על התפשטות β-cell. טכניקה זו מתארת בפירוט כיצד ליצור microspheres PLGA המכיל מטען רצוי באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרי. בעוד הטכניקה המתוארת משתמשת גורם הגדילה רקמת החיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF) כדוגמה, מגוון רחב של COI יכול לשמש בקלות. בנוסף, שיטה זו מנצלת 96-גם צלחות כדי למזער את כמות ריאגנטים צורך להעריך התפשטות β-cell. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות כדי להשתמש בביו-חומרים אלטרנטיביים אופייני תא אנדוקריניות אחרות כגון הישרדות תא ומצב בידול.
β-תאי לבלב הם התאים היחידים המייצר אינסולין בגוף הם קריטיים לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז בדם. בעוד אנשים בריאים הם בעלי מסת β-cell מספיק ולתפקד להסדיר דם גלוקוז כראוי, אנשים עם סוכרת מתאפיינים המוני β-cell מספיק ו / או פונקציה 1,2. הוצע כי גרימת התפשטות β-cell יכול בסופו של דבר להגדיל β-cell המוני ולשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בחולי סוכרת 3. עם זאת, הערכה ואימות של תרכובות שגשוג פוטנציאל β-תא איי שלמים הכרחי לפני ניתן לפתח טיפולים יעילים. השתלת איי אדם cadaveric לתוך אנשים עם סוכרת משחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בדם במשך זמן מה, אבל זמינויות ההצלחה של הליך ניסיוני זה הפריעו מחסור איי אדם זמינים להשתלה ועל ידי מוות בטא תא ומאחור האייםאה השתלת 4. אפילו עם גילוי הגורמים לגרום הכפל של תאים מייצרי אינסולין, אתגר גדול עדיין קיים במתן הגורמים הללו לאתרים רלוונטיים in vivo. אסטרטגיה אחת למסירה מקומית מתמשכת של תרכובות שגשוג β-cell היא פולי (לקטית-שיתוף גליקולית) חומצה (PLGA). יש PLGA היסטוריה של שימוש ב FDA אישר מוצרים משלוח סמים בשל בטיחות גבוהה, פריקות ביולוגית, קינטיקה שחרור המורחבת 5. באופן ספציפי, PLGA הוא קופולימר של lactide ו glycolide הזה מבזה באמצעות הידרוליזה עם מים או in vivo או בתרבות לחומצה לקטית וחומצה גליקולית, אשר מתרחשים מטבוליטים באופן טבעי בגוף. מתחם התרופה הכמוס יכול להשתחרר הסביבה על ידי שתי דיפוזיה ו / או מנגנוני שחרור מבוקר שפלים. Encapsulation של COI מספק הגנה מפני השפלה אנזימטי, שיפור הזמינות הביולוגית של מגיב לעומת unencapsulaטד COI 5. אנו ממליצים microspheres PLGA ניתן להשתמש כדי לנהל תרכובות המועמד איים שלמים בתרבות, ובסופו של דבר in vivo. בדיקת יעילותם של PLGA לנהל mitogens β-cell כדי איי vivo לשעבר היא קריטית לפני פרוטוקולי השתלת נחקרות.
נכון לעכשיו, אין טכניקה למדוד התפשטות β-cell בבעלי חיים. ניסויים להעריך את האפקטיביות של תרכובות שגשוג פוטנציאל in vivo ולכן יש לתת לכלב של תרכובות אלה לחיות חיים, עם דיסקציה עוקבות ועיבוד של pancreata עבור immunolabeling. פרוטוקולים כאלה הם יקרים ומייגעים, ודורשים המתחם להיות מערכתיים, ללא כל ערובה לכך שהם יגיעו האי. לעומת זאת, כמה הנציח קווי β-cell זמינים לחקר תאים מייצרי אינסולין בתרבות, אבל שורות תאים אלה חסרים את הארכיטקטורה איון environment נמצא אורגניזמים חיים 6. קווי β-cell הונצח גם מאופיינים כבעלי מידה רבה יותר של שכפול מ β-תאי אנדוגני in vivo, ובכך סיבכה ניתוח של תרכובות המשרים התפשטות. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשתמשת איים שלמים מבודדים עכברים בוגרים. בניגוד קווי β-cell, איים שלמים שומרים על ארכיטקטורת איון נורמלית. כמו כן, בניגוד הניסויים שנערכו in vivo, מתן תרכובות שגשוג ישירות איים שלמים תרבותיים מפחית באופן משמעותי את כמות ריאגנטים כי יש צורך למדוד במדויק התפשטות β-cell.
המחקר הנוכחי מנצל PLGA כדי לנהל COI, בדוגמה זו, גורם הגדילה רקמת חיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF). השיטה המתוארת כאן מקנה יתרון משמעותי על פני הממשל של מתחם גלם האי בתרבית שכן היא מאפשרת שחרור מתמשך של מתחם לתוך התקשורת דואר. יש לציין, assay זה יכול להיות שונה כדי לנהל מגוון רחב של חלבונים ונוגדנים מעניינים איים שלמים. השפעות על סוגי תאים אנדוקריניות אחרות, כולל תאי α, ניתן לנתח גם.
המחקר של התפשטות β-cell בתרבות נפגע בדרך כלל על ידי מספר קשיים. ראשית, קווי β-cell הנציח מאופיינים לתארים גבוהים של התפשטות ממה נמצא β-תאי אנדוגני איים חי. בנוסף, שורות התאים הנציחו אלה חסרות את הארכיטקטורה הנורמלית חיונית לתפקוד β-תא נורמלי. שתי עובדות אלו מקשות על מנת לקב…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |