Abstract
Le développement de biomatériaux a augmenté de manière significative le potentiel de délivrance de médicament ciblant une variété de types de cellules et de tissus, y compris les cellules ß pancréatiques. En outre, biomatériaux particules, hydrogels et échafauds fournissent également une occasion unique pour administrer soutenue, l'administration de médicaments commandable pour ß-cellules en culture et dans des modèles de tissus transplantés. Ces technologies permettent l'étude des facteurs de prolifération des cellules β candidat en utilisant des îlots intacts et un système de translation correspondant. En outre, la détermination de l'efficacité et la faisabilité des facteurs candidats pour stimuler la prolifération des cellules β dans un système de culture est essentielle avant de passer à des modèles in vivo. Nous décrivons ici une méthode de co-culture des îlots de souris intactes avec un composé biodégradable d'intérêt (COI) de poly chargé en (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) microsphères dans le but d'évaluer les effets de durable in situ la libération oLes facteurs mitogenes f sur la prolifération des cellules β. Cette technique décrit en détail comment générer des microsphères de PLGA contenant un chargement souhaité en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce. Bien que la technique décrite utilise le facteur humain recombinant conjonctifs de croissance du tissu conjonctif (rhCTGF) à titre d'exemple, une grande variété de conflits d'intérêts pourrait facilement être utilisé. En outre, ce procédé utilise des plaques à 96 puits pour réduire au minimum la quantité de réactifs nécessaires pour évaluer la prolifération des cellules β. Ce protocole peut être facilement adaptée à l'utilisation de biomatériaux et d'autres caractéristiques alternatives de cellules endocrines telles que la survie cellulaire et l'état de différenciation.
Introduction
les cellules ß pancréatiques sont les seules cellules productrices d'insuline dans le corps et sont essentiels pour maintenir l'homéostasie du glucose sanguin. Bien que les individus en bonne santé ont une masse β-cellulaire suffisante et fonctionnent pour réguler correctement la glycémie, les personnes atteintes de diabète sont caractérisées par la masse β-cellulaire insuffisante et / ou de la fonction 1,2. Il a été proposé que l' induction de la prolifération des cellules β peut finalement augmenter la masse β-cellulaire et de rétablir l' homéostase du glucose chez les personnes atteintes de diabète 3. Toutefois, l'évaluation et la validation des β-cellulaires composés prolifératives potentiels dans les îlots intacts est nécessaire avant des traitements efficaces peuvent être développées. La transplantation d'îlots humains cadavériques dans les individus atteints de diabète restaure le sang homéostasie du glucose pendant un certain temps, mais la disponibilité et le succès de cette procédure expérimentale est entravée par un manque d'îlots humains disponibles pour la transplantation et par la mort des cellules ß dans les îlots arrièreer greffe 4. Même avec la découverte de facteurs qui induisent la multiplication des cellules productrices d'insuline, un défi majeur existe encore dans la prestation de ces facteurs à des sites pertinents in vivo. Une stratégie pour une délivrance locale prolongée de composés β-proliférative cellulaire est l'acide poly (lactique-co-glycolique) (PLGA). PLGA a une histoire d'utilisation dans la FDA a approuvé des produits d'administration de médicaments en raison de son haut niveau de sécurité, la biodégradabilité et la cinétique de libération prolongée 5. Plus précisément, le PLGA est un copolymère de lactide et de glycolide qui se dégrade par hydrolyse avec de l' eau , soit in vivo ou dans une culture en acide lactique et acide glycolique, qui sont des métabolites présents naturellement dans l'organisme. Le composé de médicament encapsulé peut être libéré dans l'environnement à la fois par diffusion et / ou des mécanismes de libération dégradation contrôlée. Encapsulage de CI procure une protection contre la dégradation enzymatique, à améliorer la biodisponibilité du réactif par rapport à unencapsulated COI 5. Nous suggérons que les microsphères de PLGA peuvent être utilisées pour administrer les composés candidats à des îlots intacts dans la culture, et finalement in vivo. Tester l'efficacité de PLGA pour administrer des mitogenes de cellules β d'îlots ex vivo est essentiel avant que les protocoles de transplantation sont explorées.
À l'heure actuelle, il n'y a pas de technique pour mesurer la prolifération des cellules β chez les animaux vivants. Des expériences visant à évaluer l' efficacité des composés prolifératives potentiels in vivo nécessitent donc l' administration de ces composés aux animaux vivants, à la dissection ultérieure et le traitement des pancreata pour immunomarquage. Ces protocoles sont coûteux et laborieux, et exigent le composé à être administrés par voie systémique, sans aucune garantie qu'ils atteindront les îlots. A l'inverse, plusieurs lignées cellulaires immortalisées-β sont disponibles pour l'étude des cellules productrices d'insuline dans la culture, mais ces lignées cellulaires manquent de l'architecture de l'îlot et environment trouvée dans les organismes vivants 6. Β-lignes cellulaires immortalisées sont également caractérisés comme ayant un degré beaucoup plus élevé de la réplication de cellules ß endogène in vivo, ce qui complique l' analyse des composés qui induisent la prolifération. Dans cette étude, nous décrivons un protocole qui utilise des îlots intacts isolés à partir de souris adultes. Contrairement aux lignes β-cellulaires, îlots intacts conservent l'architecture d'îlots normal. De même, contrairement aux expériences menées in vivo, l' administration des composés prolifératifs directement à îlots intacts de culture réduit de manière significative la quantité de réactifs nécessaire pour mesurer avec précision la prolifération des cellules β.
L'étude actuelle utilise PLGA pour administrer un conflit d'intérêts, dans cet exemple, le facteur de croissance du tissu humain recombinant (rhCTGF). La méthode décrite ici confère un avantage significatif sur l'administration du composé brut à des îlots de culture, car elle permet une libération continue du composé dans emédias électroniques. En particulier, ce test peut être modifié pour administrer une grande variété de protéines et d'anticorps d'intérêt pour les îlots intacts. Effets sur d'autres types de cellules endocrines, y compris les cellules alpha, peuvent également être analysées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées et effectuées en conformité avec le Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels Vanderbilt.
1. Étiquetage COI avec fluorophore (Facultatif)
- Choisir un colorant fluorescent qui réagira avec une amine primaire libre (par exemple, une protéine), tels que des esters de succinimidyle ou des dérivés de la fluorescéine, pour visualiser le fret microsphère. Dissoudre un excès molaire 8x (par rapport aux moles de conflits d'intérêts) de fluorophores dans 200 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Remettre en suspension 50 mg de CDA jusqu'à un volume final de 800 ul dans une solution de véhicule (concentration finale de 62,5 ng / ul). La solution de véhicule variera en fonction de la source de conflits d'intérêts.
REMARQUE: Les solutions de véhicules typiques comprennent une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou du DMSO. - Ajouter toute la solution fluorophore / DMSO de l'étape 1.1 et resuspendre le COI. Vortex nuit à 4 ° C. En variante, vortexer le mélange réactionnel à la température ambiante(TA) pendant 4 h.
- Après la réaction de marquage, éliminer l'excès de fluorophore en utilisant une colonne de dessalage.
- Égoutter tampon de stockage de la colonne de dessalage et rincer avec 16 ml d'eau déminéralisée. Jetez tous les flux à travers.
- Ajouter la communauté d'intérêt marqué par fluorescence à la colonne de dessalage. Eluer avec 1,2 ml d'eau déminéralisée et de recueillir l'écoulement à travers.
- l'étape d'élution, une répétition de quatre fois supplémentaires, chaque fois que l'ajout de 1,2 ml d'eau déminéralisée et on collecte l'écoulement à travers un échantillon séparé.
- Geler tous les flux collectés à travers des échantillons à -80 ° C et lyophilisé selon les instructions du fabricant pour 24 heures.
2. COI chargé Microsphère Préparation par l'eau d' eau dans l'huile dans l'émulsion de solvant d' évaporation Méthode
- Ajouter 1 mg de marquage fluorescent CI 100 pi d'eau déminéralisée pour former la première phase aqueuse (W1).
- Dissoudre 65 mg de poly (aci lactique-co-glycoliqued) (50:50 lactide: glycolide, poids moléculaire 54.000 - 69.000) dans 750 ul de dichlorométhane dans un tube à centrifuger. Ultrasonicate pendant 10 - 30 s (à 160 W) pour dissoudre complètement le PLGA. Ceci constitue la phase huileuse (O).
- Ajouter la totalité de la phase W1 générée à l'étape 2.1 vers la phase S d'une manière goutte à goutte. Emulsionner en utilisant un homogénéisateur à main à 20.000 tours par minute pendant 30 secondes pour former la phase W1 / O.
- Ajouter la totalité de la phase d'entrée / sortie W1 d'une manière goutte à goutte à 15 ml d'un mélange 1% (poids / volume) aqueuse de poly (alcool vinylique) (PVA) et émulsionner à l'aide d'un homogénéisateur à main à 20 000 tpm pendant 30 secondes .
- Transférer la totalité de l'émulsion générée à l'étape 2.4 à 200 ml d'un ballon à fond rond et sous un vide de Hg 635 mm en utilisant un évaporateur rotatif pendant 1 heure pour éliminer le solvant et produire la phase aqueuse.
- Aliquote de 1 ml de la phase aqueuse générée à l'étape 2.5 à quatorze des microtubes. Centrifuger la solution aqueuse dans des tubes à centrifuger à 7500xg pendant 8 min.
Remarque: Lors de cette étape, les microsphères sont présentes dans la solution aqueuse restante et on concentre à la partie inférieure du microtube. - enlever soigneusement 900 ul d'une solution aqueuse à partir des microtubes avec une micropipette, de pipetage de manière à ne pas perturber les microsphères sur le fond du tube à centrifuger.
- Laver les microsphères d'excès PVA en ajoutant 1 ml d'eau déminéralisée à chaque tube de microcentrifugeuse. Centrifuger à 7500 g pendant 8 min, puis à nouveau retirer avec soin 900 ul d'une solution aqueuse à partir des microtubes avec une micropipette, pipetage de manière à ne pas perturber les microsphères sur le fond du tube à centrifuger.
NOTE: La 100 solution aqueuse ul restante contient les microsphères produites.
- Laver les microsphères d'excès PVA en ajoutant 1 ml d'eau déminéralisée à chaque tube de microcentrifugeuse. Centrifuger à 7500 g pendant 8 min, puis à nouveau retirer avec soin 900 ul d'une solution aqueuse à partir des microtubes avec une micropipette, pipetage de manière à ne pas perturber les microsphères sur le fond du tube à centrifuger.
- Congeler la solution aqueuse de microsphère générée à l'étape 2.7 à -80 ° C.
- lyophiliser les microsphères en utilisant un lyophilisateur selon fabricantinstructions et conserver à -20 ° C.
REMARQUE: mesurer l' efficacité du chargement du CI en dissolvant totalement microsphères de PLGA et la détermination de la concentration en protéine par rapport à une courbe standard de la protéine libre 7. - Comme témoin négatif, générer un lot de microsphères "blanc" (ci-après sous forme de microsphères de contrôle).
REMARQUE: La production de microsphères de contrôle est identique à la génération de microsphères hydrophiles CI chargées, sans ajout de conflits d'intérêts 800 ul de la solution de véhicule à l'étape 1.2. particules de contrôle du match en concentration massique de PLGA par rapport à des microsphères de PLGA COI-chargées pour le dosage de mitogène β-cellulaire.
3. Préparation de l'Islet Milieux de culture et médias pré-test
- Préparer 200 ml de milieu pour la culture des îlots de souris intactes: milieu RPMI 1640 supplémenté avec du glucose 11 mM, du sérum de cheval à 10%, 100 U / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine (appelé ci-après estlaisser les milieux de culture).
NOTE 1: A la différence de sérum bovin fœtal (FBS), du sérum de cheval n'a pas lactogène placentaire, un inducteur de la prolifération des cellules β, qui confond l'analyse dans le test de prolifération.
NOTE 2: Comme les microsphères de PLGA ne sont pas stérilisés avant l'utilisation, l'ajout d'antibiotiques pour les milieux de culture est essentielle pour éviter la contamination microbiologique. - Retirer 25 ml d'îlots milieux de culture avec une pipette électronique et dans un tube conique de 50 ml. Supplément de 25 ml de milieux de culture des îlots dans le 50 ml tube conique avec une concentration finale de 0,2 mM EGTA pour générer les médias pré-test.
REMARQUE: L'ajout d'EGTA desserre légèrement contacts cellule-cellule des îlots sans modifier l'architecture des îlots. Cela permet d'assurer la COI peut atteindre les cellules internes de l'îlot et aide à prévenir la nécrose de l'îlot central.
4. Ensemencement de Intact Islets Souris
- Isoler îlots intacts d'une souche pré-sélectionnée, le sexe, age, et le génotype de souris après une digestion de collagénase de routine du 8,9 du pancréas. Piscine îlots ensemble à partir comme des échantillons.
- Aliquoter 40 îlots dans un puits d'une plaque à 96 puits de culture de tissu dans 200 ul de milieu de culture des îlots. Visuellement îlots taille-match par puits (une évaluation précise de l'îlot d'équivalence (IEQ) entre les échantillons ne sont pas nécessaires). Remplir les puits vides immédiatement adjacents à des puits avec des îlots avec 200 pi d'eau stérile pour fournir un tampon d'évaporation. Culture d' îlots dans les médias durant la nuit à 37 ° C sous une atmosphère de 95% d' air et 5% de CO 2.
5. Re-suspension de COI-chargés et Microsphères contrôle PLGA
- Après la récupération des îlots du jour au lendemain, remettre les microsphères en ajoutant un support pré-test à une aliquote de lyophilisés microsphères de PLGA COI chargées de telle sorte que la concentration finale du COI dans le tube à centrifuger est de 10 ng / pl (la quantité de COI présent dans une quantité donnée de les micros générésPhérès a été déterminée à l'étape 2.9). Soniquer les microsphères COI-chargées remises en suspension dans un bain d'eau glacée pendant 10 min à 160 W avec 10 sec impulsions longues à 4 ° C.
- contrôle de Resuspendre microsphères de PLGA en ajoutant le même volume de milieu de pré-test pour une masse égale de contrôle lyophilisé microsphères de PLGA. Soniquer les remises en suspension des microsphères de contrôle PLGA dans un bain d'eau glacée pendant 10 min à 160 W avec 10 sec impulsions longues à 4 ° C.
- Visuellement confirment les microsphères sont dispersées par pipetage 2 pi de microsphères remises en suspension entre deux lamelles de verre. Visualisez les microsphères en utilisant un objectif 40X sur un épifluorescence ou fond clair microscope.
- Si agrégation significative de microsphères est encore visible, sonication dans un bain d'eau glacée pendant 10 min supplémentaires à 160 W avec 10 sec impulsions longues à 4 ° C et répéter la visualisation des microsphères remises en suspension.
6. Traitement des Ilots avec COI-chargées ou contrôle PLGA Microsphères </ P>
- Pour chaque puits à traiter avec des microsphères chargées COI, préparer des milieux d'essai en diluant la 10 ng / ul des microsphères COI remis en suspension avec un support pré-essai à un volume final de 100 pl et une concentration finale prédéterminée.
REMARQUE: La concentration finale optimale de la protéine variera pour chaque CI utilisée pour cet essai. Idéalement, une gamme de concentrations finales sont testées. - Pour chaque puits à être utilisé en tant que témoin, préparer des milieux d'essai de contrôle par dilution remis en suspension les microsphères de PLGA de commande générées à l'étape 5.2 avec le même volume de dilution pour diluer les microsphères chargées CI à l'étape 6.1.
NOTE: Islets traités avec les médias d'essai de contrôle servira de témoin négatif pour permettre la détection de tout effet les microsphères vides peuvent avoir sur les résultats expérimentaux. - enlever soigneusement 100 ul de milieu de culture d'îlots de chaque puits avec une micropipette de sorte qu'aucun îlots sont délogés des puits. Ajouter délicatement 100 μl de milieu d'essai ou 100 pi de milieu d'essai témoin à chaque puits.
- Incuber îlots à 37 ° C sous une atmosphère de 95% d' air et 5% de CO 2 pendant trois jours.
7. Dispersion Islets quel sur Microscope Slides
- Après trois jours, utiliser une micropipette pour enlever soigneusement et jeter les médias d'essai de tous les puits afin de ne pas déloger les îlots. Ajouter délicatement 200 ul de PBS à des îlots pour les laver des médias d'essai. Retirez délicatement et jeter PBS avec une micropipette et laver délicatement îlots à nouveau avec un 200 pi supplémentaires PBS.
- Retirer et jeter PBS avec une micropipette et ajouter 100 ul de 0,025% de trypsine, solution 2 mM EDTA. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Pipet îlots dans la solution de trypsine-EDTA monter et descendre toutes les 2 min jusqu'à ce que les îlots sont confirmées visuellement pour être dispersés dans des cellules individuelles (à noter que certains petits amas de cellules peuvent encore être présentes) à l'aide d'un microscope optique. Transférer la totalité du volume de chaque puits individuelly dans des tubes de microcentrifugation labeled-.
- Ajouter 400 ul de milieu de culture d'îlots à chaque microtube pour arrêter la cellule de dissociation induite par la trypsine.
- Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 100 x g à 4 ° C pour sédimenter les cellules des îlots au fond des tubes de microcentrifugation.
- Retirez délicatement le surnageant à l'aide d'une micropipette, et remettre le culot dans 200 milieux de culture d'îlots ul frais.
- L'utilisation d'un cyto-centrifugeuse, centrifugeuse dissociée îlots à 140 xg pendant 3 min sur des lames de microscope chargées.
- Air slides sec à la température ambiante pendant 10 min, puis dessiner une boîte autour des îlots dissociées avec un marqueur hydrophobe.
- Fixer les cellules avec 75 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) à température ambiante pendant 10 min. Retirer 4% PFA et laver en douceur les cellules dans 75 ul de PBS deux fois. Après lavage, on perméabiliser les cellules avec 75 pi de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min. Ensuite, laver les cellules avec 75 pi de PBS.
Attention: PFA est connu pour être allergéniques, cancérigènes et toxiques. 8. immunofluorescence Étiquetage des dissociées Islets pour l'insuline et la prolifération des cellules Marker, Ki67 - Préparer une chambre humide en plaçant deux serviettes en papier mouillées dans le fond d'une boîte de glissement capacité de microscope 100 coulissant.
- Placer les lames plates vers le bas (cellules vers le haut) dans la chambre humide. Préparer des échantillons pour l'étiquetage par l'aspiration du PBS à partir de l'étape de lavage précédente à l'aide d'une micropipette et en ajoutant 75 pi de solution de blocage (5% normal d'âne sérum (PDN) dans du PBS) dans chaque glissière pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps aux spécimens. Incuber les lames dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante.
- Solution doucement blocage aspirât à l'aide d'une micropipette et d'ajouter 75 ul de solution d'anticorps primaire contenant de Guinée porc anticorps anti-Ki67 anti-insuline et de lapin, dilué à 1 pg / ml dans 5% PDN dans du PBS. Incubation à température ambiante pendant 1 heure.
REMARQUE: Les autres marqueurs de prolifération cellulaire comprennent la prolifération cellulaire antigène nucléaire (PCNA) et phosphohistone H3 (PH3), - Aspirer doucement la solution d'anticorps primaire à l'aide d'une micropipette et rincer les cellules avec 75 pi de PBS. Aspirer PBS en utilisant une micro-pipette et rincer les cellules à deux reprises, chaque fois avec 75 ul de PBS. Incuber chaque échantillon avec 75 ul de l'anti-cochon Guinée Cy5 et un anticorps secondaire anti-lapin de l'anticorps secondaire Cy3 dilué à 2 pg / ml dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante.
NOTE: Ne pas utiliser des anticorps secondaires marqués avec le même ou spectralement chevauchement fluorophore qui a déjà été utilisé pour marquer les microsphères. - une solution d'anticorps secondaire aspirât à l'aide d'une micropipette et incuber dans 75 ul de 300 nM DAPI dans du PBS pendant 3 min à température ambiante. Aspirer DAPI en utilisant une micropipette et rincer à l'eau désionisée pendant 5 min.
- Aspirer doucement l'eau à partir d'échantillons à l'aide d'une micropipette. Repérer une goutte (environ 100 pi) de solution de montage à séchage rapide contenant antifade réactif sur une lamelle de verre. Inversez le côté microscope de l'échantillon de glisser vers le bas, onto la solution de montage. Appuyez doucement sur la lamelle contre la diapositive à l'aide d'une pointe de pipette pour éliminer les bulles et essuyer l'excès de liquide avec un tissu de nettoyage doux. Laisser sécher les lamelles nuit à TA.
- Utilisez un microscope à épifluorescence avec un appareil photo ci-jointe pour l'acquisition d'images. Pour chaque fluorophore, déterminer le temps optimal d'exposition (typiquement 20 msec pour DAPI, 40 - 80 msec pour l'insuline, et 250 msec pour Ki67). Assurez paramètres d'acquisition d'image sont égales pour tous les échantillons.
- Pour chaque échantillon, comptez manuellement 3.000 cellules productrices d'insuline positive et de ceux compter combien sont aussi Ki67 positifs. Comptez seulement les cellules productrices d'insuline positives qui ont un noyau bien défini et clairement visible. Calculer le pourcentage de prolifération des cellules ß pour chaque échantillon en divisant le nombre de cellules Ki67-positives / insuline-positif par le nombre total de cellules productrices d'insuline positive et en multipliant par 100.
- Après déterminer le pourcentage de prolifération des cellules ß pour chaque échantillon, déterminer si une différence statistiquement significative dans la prolifération des cellules β existe entre le contrôle et les échantillons expérimentaux en analysant les résultats d'une ANOVA à sens unique en utilisant le logiciel statistique disponible dans le commerce.
Acquisition et analyse 9. image
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 est une représentation visuelle des microsphères produites en utilisant le protocole ci - dessus. Le protocole décrit ici, on obtient des microsphères chargées rhCTGF de différentes tailles. La plus grande partie des microsphères est compris entre 1 et 10 um de diamètre, bien que certaines microsphères peuvent être plus grandes (figure 2). Si cela est souhaité, la taille de la microsphère peut être réglé et optimisé en fonction des paramètres de fabrication tels que la vitesse d'homogénéisation et le temps, la concentration en agent tensio - actif utilisé et les volumes relatifs de chaque phase eau / huile / eau 10.
Après la dispersion des îlots intacts traités avec des microsphères de PLGA et immunomarquage ultérieure, il est fréquent de voir des régions de l'échantillon dépourvu de tout marquage entre les cellules (figure 3). Alors que la plupart des microsphères qui sont encore intactes après la période de traitement de culture sontenlevés pendant les étapes de lavage, certains demeurent après que les îlots sont filées sur les lames de microscope. Ces microsphères causent les structures de trous comme visualisées lors de l'imagerie. Ces microsphères résiduelles ne sont généralement pas interférer avec la quantification ultérieure.
Après l'exposition, le pourcentage de cellules positives Ki67 / insuline positive peut être quantifié en comptant manuellement le nombre total de cellules marquées, soit en utilisant une analyse d'image logicielle. Précédemment, nous avons démontré que conjonctifs facteur humain de croissance du tissu recombinant (rhCTGF) peut stimuler la prolifération des cellules de souris β dans les îlots intacts ex vivo 11. En utilisant le protocole mentionné ci-dessus, nous avons généré des microsphères de PLGA contenant rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Traiter îlots intacts avec des microsphères rhCTGF-PLGA pendant 3 jours a entraîné une augmentation similaire de la prolifération β-cellulaire comme indiqué précédemment avec la protéine brute, ce qui démontre que la protéine n'a pas lo tilisez toute fonctionnalité lors de la génération de la microsphère (figure 4).
Figure 1. La représentation visuelle du PLGA Microsphères En incorporant un colorant fluorescent dans le protocole de fabrication, les microsphères de PLGA peut être visualisé en utilisant un microscope à épifluorescence. La barre d'échelle représente 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Distribution de la taille des microsphères de PLGA Bien que la distribution de la taille peut varier, la plupart des microsphères sera inférieure à 10 um de diamètre.Arget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Visualisation immunofluorescence de Dispersed proliférantes cellules ß Dispersés îlots sont immunomarquées pour le marqueur Ki67 (rouge) et de l' insuline (vert) pour marquer la prolifération des cellules proliférantes ß. Nuclei sont étiquetés avec DAPI (bleu). Les flèches indiquent les cellules Ki67-positives / insuline positive. Les astérisques (*) indiquent des microsphères non dégradées. La barre d'échelle représente 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Quantification et analyse des β-cell Proprolifération. ilots traité avec différentes quantités de microsphères rhCTGF-PLGA. Le nombre de cellules positives Ki67 / insuline positif a été compté manuellement à partir de tous les échantillons, exprimée en pourcentage du nombre total de cellules ß d'insuline positive. L'axe des X correspond à la concentration finale de rhCTGF présent dans chaque traitement. La signification statistique a été déterminée en utilisant un ANOVA à une voie suivie par le test de comparaison multiple de Tukey. La signification statistique a été fixé à p ≤ 0,05. Les barres d'erreur représentent l' erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'étude de la prolifération β-cellulaire dans la culture est généralement entravée par plusieurs difficultés. Tout d'abord, les lignées cellulaires immortalisées-β sont caractérisés par des degrés de prolifération que ce qu'on trouve dans les cellules ß des îlots endogènes vivants supérieurs. En outre, ces lignées cellulaires immortalisées manquent de l'architecture normale critique pour la fonction β-cellulaire normale. Ces deux faits font qu'il est difficile de déterminer si les résultats obtenus en utilisant des lignées de cellules immortalisées β sera vrai lors des tests in vivo ou dans des îlots entiers. Notre protocole est décrit, qui utilise des îlots de souris intactes fraîchement isolées, évite ces problèmes que l'architecture d'îlots est maintenue et la prolifération des cellules β est comparable à celui observé in vivo.
Une préoccupation importante lors de la culture des îlots intacts est la possibilité que les cellules dans le coeur des îlots seront soumis à la nécrose induite par l'hypoxie ou ne seront pas exposés à rhCTGF. Pour cette raison, une finaleconcentration de mM EGTA 0,1 est ajouté aux médias pour desserrer contacts cellule-cellule sans perturber l'architecture d'îlots. Nous avons précédemment publié que l'addition d'EGTA seul peut augmenter la prolifération des cellules β, vraisemblablement en raison d' un meilleur accès des nutriments et des mitogenes dans le milieu au noyau de l' îlot 12. L'augmentation de la prolifération des cellules β , en réponse à l' EGTA pourrait également être dû à la diminution du contact cellule-cellule elle - même 13,14. Les milieux décrits dans ce protocole est également complété par sérum de cheval à la place du sérum plus traditionnel bovin fœtal. Cette substitution est réalisée grâce à la présence de lactogène placentaire dans du sérum de veau fœtal, ce qui peut stimuler la prolifération des cellules β lui-même, ce qui peut compliquer l'analyse dans le test de prolifération.
Détermination de la toxicité relative des microsphères de PLGA (avec ou sans COI) aux cellules d'îlots peut être évaluée par une analyse par immunofluorescence de markers de la mort cellulaire ou lésions de l' ADN, y compris TUNEL ou γ-H2AX 15,16. Bien que l'ajout de microsphères de PLGA n'a pas montré d'effets néfastes évidents îlots ex vivo, les utilisateurs doivent être conscients des effets des microsphères peuvent avoir sur l' analyse d'images. Comme le montre la figure 3 et mentionné dans la section des résultats, les microsphères non dégradées peuvent être apparentes comme des taches sombres dans les images immunofluorescence, avec plus de microsphères apparaissant lorsque des concentrations croissantes sont utilisées.
Il convient de noter que le protocole décrit a été adapté pour fonctionner avec des îlots isolés de souris. En tant que tel, il est difficile de savoir si des conditions identiques vont travailler avec des îlots récoltés à partir d'organismes alternatifs, tels que le rat et l'homme. Notamment, les îlots récoltés à partir de différents organismes ont souvent des conditions de culture optimales et les degrés de prolifération β-cellulaire 17,18 différents.
De nombreux biomatières sont potentiellement disponibles pour administrer rhCTGF d'îlots isolés, y compris le poly (uréthane-thiocétal) et le poly (sulfure de propylène) 19. Nous avons choisi de mettre l'accent sur PLGA en raison de plusieurs qualités remarquables qu'il possède. Tout d'abord, PLGA est un réactif relativement abordable et les microsphères peut être généré avec un équipement standard (centrifugeuse, homogénéisateur, lyophilisateur) disponible dans la plupart des institutions de recherche. PLGA est un polymère synthétique qui a un précédent destiné à être utilisé avec succès dans des dispositifs approuvés par la FDA en raison de sa biocompatibilité, la biodégradabilité, et sa capacité à moduler les taux de libération composé 20. PLGA se dégrade par hydrolyse en présence d'eau, libérant son chargement dans le procédé. La composition chimique des particules de PLGA peuvent être adaptées de telle sorte qu'un composé est libéré in vivo au cours de la période de plusieurs semaines. PLGA a également été utilisé dans des essais précliniques sur les animaux et les thérapies cliniques humains pour administrer localement des composés à divers organes et tissues 21,22. D'autres polymères hydrophobes peuvent également être utilisés dans la production de microsphères biodégradables. Ces polymères peuvent réagir à des stimuli environnementaux spécifiques, tels que le pH, la température et la présence d'espèces réactives de l' oxygène 23,24. Ainsi, les chercheurs doivent examiner avec soin qui biomatériau est le plus approprié pour leurs études.
Tout chercheur utilisant PLGA, ou d' autres biomatériaux, pour étudier β-prolifération des cellules ex vivo doivent être conscients des différences potentielles entre les effets de la encapsulé COI par rapport à encapsulé COI. Par exemple, la fourniture de rhCTGF par le PLGA peut changer le degré de synchronisation et de β-induction de la prolifération cellulaire par rapport au traitement avec la protéine non encapsulée. Les études en cours dans notre laboratoire sont en train d'examiner ces différences de potentiel.
L'analyse de la prolifération des cellules β des îlots de Langerhans en culture est un modèle puissant pour l'identification et moianalyse chanistic de mitogenes β-cellules. En utilisant l'essai décrit ici, nous montrons une méthode relativement rapide et rentable pour l'administration d'un COI à îlots cultivés isolés avec un véhicule d'administration à libération prolongée. Ce test devrait être applicable à presque tous les conflits d' intérêts d'intérêt, et notre choix de se concentrer sur CTGF est purement basée sur sa capacité précédemment publié pour stimuler la prolifération β-cellulaire in vivo et ex vivo 11. En outre, ce test peut valider l'efficacité et la sécurité de l'utilisation de PLGA comme méthode de livraison avant de passer à des modèles où les îlots sont transplantées dans les organismes vivants. Dans l'ensemble, le protocole décrit fournit une nouvelle façon d'administrer les composés à îlots cultivés avec un impact plus large sur la mesure de la sécurité des PLGA aux tissus transplantables.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
