Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
De ontwikkeling van biomaterialen aanzienlijk vergroot de kans op doelgerichte geneesmiddelafgifte om een verscheidenheid aan cel- en weefseltypes, zoals de pancreas β-cellen. Daarnaast biomateriaal deeltjes, hydrogels, en steigers bieden ook een unieke gelegenheid om te dienen duurzame, controleerbare drug delivery om ß-cellen in de cultuur en in het getransplanteerde weefsel modellen. Deze technologieën kunnen de studie van proliferatie kandidaat-β-cel factoren met behulp van intacte eilandjes en een translationeel relevant systeem. Bovendien bepalen van de effectiviteit en haalbaarheid van kandidaat factoren voor het stimuleren van proliferatie β-cellen in een kweeksysteem kritisch voordat ze verder in vivo modellen. Hierin beschrijven we een werkwijze voor co-kweek intacte eilandjes muis met biologisch afbreekbare verbinding van belang (COI) -geladen poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microsferen voor de beoordeling van de effecten van aanhoudende afgifte in situ of mitogene factoren β-celproliferatie. Deze techniek beschrijft in detail hoe PLGA microsferen die een gewenste lading met behulp van commercieel verkrijgbare reagentia te genereren. Hoewel de beschreven techniek maakt gebruik van recombinant humaan Bindweefsel groeifactor (rhCTGF) als voorbeeld, kan een grote verscheidenheid aan COI onmiddellijk kunnen worden gebruikt. Bovendien is deze werkwijze gebruikt 96-well platen de hoeveelheid reagentia die nodig zijn om proliferatie β-cellen te beoordelen minimaliseren. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere biomaterialen en andere endocrine celeigenschappen zoals celoverleving en differentiatie status gebruiken.
Pancreatische β-cellen zijn de enige insulineproducerende cellen in het lichaam en is essentieel voor bloedglucose homeostase. Terwijl gezonde individuen voldoende β-celmassa en functionaliteit, om goed te reguleren bloedglucose, zijn individuen met diabetes gekenmerkt door onvoldoende β-celmassa en / of functie 1,2. Het is voorgesteld dat het induceren van proliferatie β-cel kan uiteindelijk stijgen β-celmassa en herstellen glucose homeostase bij patiënten met diabetes 3. Echter, beoordeling en validatie van mogelijke β-celproliferatieve verbindingen intacte eilandjes noodzakelijk voor effectieve therapieën kunnen worden ontwikkeld. Transplantatie van postmortale menselijke eilandjes in personen met diabetes herstelt bloedglucose homeostase enige tijd, maar de beschikbaarheid en het succes van deze experimentele procedure wordt gehinderd door een gebrek aan menselijke eilandjes voor transplantatie en ß-celdood in de eilandjes achtersteer transplantatie 4. Zelfs met de ontdekking van factoren die vermenigvuldiging van insulineproducerende cellen induceren een belangrijke uitdaging bestaat nog verwezenlijken van deze factoren relevante sites in vivo. Een strategie voor duurzame lokale afgifte van β-celproliferatieve verbindingen poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA). PLGA heeft een gebruiksgeschiedenis in FDA goedgekeurde geneesmiddel levering producten vanwege de hoge veiligheid, biologische afbreekbaarheid en afgiftekinetiek verlengde 5. Specifiek PLGA is een copolymeer van lactide en glycolide dat afbreekt door hydrolyse met water, hetzij in vivo of in kweek in melkzuur en glycolzuur, zijn natuurlijk voorkomende metabolieten in het lichaam. De ingekapselde geneesmiddel verbinding kan worden vrijgegeven in de omgeving van zowel diffusie en / of afbraak gecontroleerde afgiftemechanismen. Inkapseling van COI beschermt tegen enzymatische degradatie, verbetering van de biobeschikbaarheid van het reagens ten opzichte unencapsulated COI 5. Wij stellen voor dat PLGA microsferen kunnen worden gebruikt om kandidaat-verbindingen intacte eilandjes dienen in cultuur, en uiteindelijk in vivo. Het testen van de werkzaamheid van PLGA tot β-cel mitogenen toedienen aan eilandjes ex vivo kritisch voor transplantatie protocol worden onderzocht.
Momenteel is er geen techniek om proliferatie β-cellen in levende dieren te meten. Experimenten om de effectiviteit van mogelijke proliferatieve verbindingen in vivo te beoordelen vereisen daarom toediening van deze verbindingen levende dieren, met daaropvolgend dissectie en verwerking van pancreata voor immunokleuring. Dergelijke protocollen zijn duur en arbeidsintensief en vereisen de verbinding systemisch worden toegediend, zonder garantie dat de eilandjes bereiken. Omgekeerd verschillende β-geïmmortaliseerde cellijnen beschikbaar voor de studie van insulineproducerende cellen in kweek, maar deze cellijnen missen het eilandje architectuur en environment gevonden in levende organismen 6. Β-geïmmortaliseerde cellijnen worden ook gekenmerkt door een opvallend hoger dan replicatie endogene β-cellen in vivo, waardoor complicerende analyse van verbindingen die proliferatie induceren. In deze studie beschrijven we een protocol dat intacte eilandjes geïsoleerd uit volwassen muizen gebruikt. In tegenstelling tot de β-cellijnen, intact eilandjes behouden normale eilandje architectuur. Ook in tegenstelling tot experimenten in vivo toediening proliferatieve verbindingen direct gekweekte intacte eilandjes vermindert de hoeveelheid reagentia die nodig zijn om nauwkeurig proliferatie β-cel.
De huidige studie gebruikt PLGA een COI beheren, in dit voorbeeld, recombinante humane bindweefselgroeifactor (rhCTGF). De hier beschreven methode geeft een aanzienlijk voordeel ten opzichte van de toediening van ruwe verbinding gekweekte eilandjes omdat het zorgt voor een continue afgifte van de verbinding in the media. Met name kan deze test worden aangepast aan een grote verscheidenheid aan eiwitten en antilichamen van belang intacte eilandjes dienen. Endocrine effecten op andere celtypen, waaronder α-cellen kunnen worden geanalyseerd.
De studie van β-celproliferatie in kweek wordt gewoonlijk afgeremd door een aantal moeilijkheden. Eerst worden geïmmortaliseerde β-cellijnen gekarakteriseerd door een hogere graad van proliferatie dan wat in endogene β-cellen in levende eilandjes. Bovendien zijn deze geïmmortaliseerde cellijnen missen de normale architectuur essentieel voor normale β-celfunctie. Deze twee feiten maken het moeilijk om te bepalen of de resultaten verkregen met β-geïmmortaliseerde cellijnen opgaan wanneer getest in vivo of…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |