Vedvarende administration af β-celle mitogener til intakt Mouse Islets<em> Ex vivo</em> Brug Bionedbrydelig poly (mælke-co-glycolsyre) mikrosfærer
Summary
Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.
Abstract
Udviklingen af biomaterialer steget betydeligt potentiale til målrettet lægemiddelafgivelse til en række celle- og vævstyper, herunder de pankreatiske p-celler. Desuden biomateriale partikler, hydrogeler og stilladser også giver en unik mulighed for at administrere vedholdende, at kontrollerbar drug delivery p-celler i kultur og transplanterede væv modeller. Disse teknologier gør det muligt at studere kandidat β-celle spredning faktorer ved hjælp af intakte holme og et translationelt relevant system. Desuden bestemme effektivitet og gennemførlighed af kandidat faktorer for at stimulere β-celle proliferation i en kultur-system er kritisk inden vi går videre til in vivo modeller. Heri beskriver vi en metode til at co-kultur intakte mus holme med biologisk nedbrydelig forbindelse af interesse (COI) -loaded poly (mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) mikrokugler med henblik på at vurdere virkningerne af vedvarende in situ frigivelse of mitogene faktorer på β-celleproliferation. Denne teknik beskriver i detaljer, hvordan man kan generere PLGA mikrokugler indeholdende et ønsket last ved anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser. Mens den beskrevne teknik anvender rekombinant humant Bindevæv vækstfaktor (rhCTGF) som et eksempel, kan en lang række COI let anvendes. Desuden er denne fremgangsmåde anvender plader med 96 brønde for at minimere mængden af reagenser nødvendige for at vurdere β-celleproliferation. Denne protokol kan let tilpasses til at anvende alternative biomaterialer og andre endokrine celle karakteristika såsom celleoverlevelse og differentiering status.
Introduction
Pankreatiske p-celler er de eneste insulinproducerende celler i kroppen og er afgørende for at opretholde blodglukose homøostase. Mens sunde individer har tilstrækkelig β-cellemasse og funktion til korrekt regulere blodsukker, er individer med diabetes er karakteriseret ved utilstrækkelig β-cellemasse og / eller funktion 1,2. Det er blevet foreslået, at inducere β-celleproliferation i sidste ende kan øge β-cellemassen og genoprette glucosehomøostase hos personer med diabetes 3. Men er nødvendige evaluering og validering af potentielle β-celle-proliferative forbindelser i intakte holme, før der kan udvikles effektive behandlinger. Transplantation af kadaver humane øer i personer med diabetes genskaber blodsukker homøostase i nogen tid, men tilgængeligheden og succes denne eksperimentelle procedure hindres af mangel på humane øer til rådighed til transplantation og ved p-celledød i øerne agteris transplantation 4. Selv med opdagelsen af faktorer, der inducerer opformering af insulinproducerende celler, findes en stor udfordring stadig i afgivelse af disse faktorer til relevante steder in vivo. En strategi for vedvarende lokal levering af β-celle-proliferative forbindelser er poly (mælke-co-glycol) syre (PLGA). PLGA har en historie af brug i FDA godkendte drug delivery produkter på grund af sin høje sikkerhed, bionedbrydelighed, og release kinetik udvidede 5. Specifikt PLGA er en copolymer af lactid og glycolid, der nedbrydes ved hydrolyse med vand enten in vivo eller i kultur til mælkesyre og glycolsyre, som er naturligt forekommende metabolitter i kroppen. Det indkapslede lægemiddelforbindelse kan frigives i det omgivende miljø ved både diffusion og / eller mekanismer nedbrydnings–kontrolleret frigivelse. Indkapsling af COI giver beskyttelse mod enzymatisk nedbrydning, at forbedre biotilgængeligheden af reagenset i forhold til unencapsulaTed COI 5. Vi foreslår, at PLGA-mikrosfærer kan anvendes til at administrere kandidatforbindelser til intakte øer i kultur, og i sidste ende in vivo. Test af effektiviteten af PLGA at administrere β-celle mitogener til holme ex vivo er kritisk inden transplantation protokoller udforskes.
I øjeblikket er der ingen teknik til at måle β-celleproliferation i levende dyr. Forsøg på at vurdere effektiviteten af potentielle proliferative forbindelser in vivo derfor behøve administration af disse forbindelser til levende dyr, med efterfølgende dissektion og behandling af pancreas for immunolabeling. Sådanne protokoller er dyre og arbejdskrævende, og kræver forbindelsen skal indgives systemisk, uden nogen garanti for, at de vil nå øerne. Omvendt flere immortaliserede β-cellelinier er tilgængelige til undersøgelse af insulin-producerende celler i kultur, men disse cellelinier mangler ø-arkitektur og milt findes i levende organismer 6. Immortaliserede β-cellelinier også kendetegnet ved at have en meget højere grad af replikation end endogene p-celler in vivo, hvilket komplicerer analysen af forbindelser, der inducerer proliferation. I denne undersøgelse beskriver vi en protokol, som anvender intakte øer isoleret fra voksne mus. I modsætning β-cellelinier, intakte øer bevarer normal ø-arkitektur. Ligeledes i modsætning til eksperimenter udført in vivo, der administrerer proliferative forbindelser direkte til dyrkede intakte øer signifikant reducerer mængden af reagenser, som er nødvendige for præcist at måle β-celleproliferation.
Den aktuelle undersøgelse anvender PLGA at indgive en COI, i dette eksempel, rekombinant human Connective Tissue Growth Factor (rhCTGF). Den her beskrevne fremgangsmåde giver en betydelig fordel i forhold til administration af rå forbindelse til dyrkede øer da det giver mulighed for en kontinuerlig frigivelse af forbindelse i the medier. Især kan dette assay modificeres til at administrere en lang række proteiner og antistoffer af interesse for intakte øer. Virkninger på andre endokrine celletyper, herunder a-celler, kan også analyseres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet af β-celleproliferation i kultur typisk hæmmet af adskillige vanskeligheder. Først immortaliserede β-cellelinjer kendetegnet ved højere grader af proliferation end hvad der er fundet i endogene p-celler i levende øer. Derudover disse immortaliserede cellelinjer mangler den normale arkitektur er kritisk for normal β-cellefunktion. Disse to fakta gør det vanskeligt at afgøre, om resultater opnået ved anvendelse af immortaliserede β-cellelinjer vil være tilfældet, når det afprøves in vivo el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.
Materials
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105°C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
