Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact doi: 10.3791/54664 Published: November 5, 2016

Abstract

פיתוח חומרים ביולוגיים גדל באופן משמעותי את פוטנציאל שיגור תרופות למגוון של סוגי תאים ורקמות, כולל β-תאי הלבלב. בנוסף, חלקיקים ביולוגיים, הידרוג, ופיגומים גם מספקים הזדמנות ייחודית לניהול מתמשך, משלוח סמים לשליטה על בטא תאים בתרבית ו במודלי רקמה מושתלות. טכנולוגיות אלו מאפשרות בחקר גורמי התפשטות β-cell המועמד באמצעות איי שלמים ומערכת רלוונטית translationally. יתר על כן, בקביעה האפקטיבית ואת הכדאיות של גורמי מועמד בהמרצת ההתרבות β-cell במערכת תרבות היא קריטית לפני לנוע קדימה מודלי in vivo. בזאת, אנו מתארים שיטת שיתוף תרבות איי עכבר שלמים עם מתחם מתכלה של עניין (COI) פולי -loaded (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) (PLGA) microspheres לצורך הערכת ההשפעות של שנגרם o שחרור באתרוגורמים mitogenic f על התפשטות β-cell. טכניקה זו מתארת ​​בפירוט כיצד ליצור microspheres PLGA המכיל מטען רצוי באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרי. בעוד הטכניקה המתוארת משתמשת גורם הגדילה רקמת החיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF) כדוגמה, מגוון רחב של COI יכול לשמש בקלות. בנוסף, שיטה זו מנצלת 96-גם צלחות כדי למזער את כמות ריאגנטים צורך להעריך התפשטות β-cell. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות כדי להשתמש בביו-חומרים אלטרנטיביים אופייני תא אנדוקריניות אחרות כגון הישרדות תא ומצב בידול.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

β-תאי לבלב הם התאים היחידים המייצר אינסולין בגוף הם קריטיים לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז בדם. בעוד אנשים בריאים הם בעלי מסת β-cell מספיק ולתפקד להסדיר דם גלוקוז כראוי, אנשים עם סוכרת מתאפיינים המוני β-cell מספיק ו / או פונקציה 1,2. הוצע כי גרימת התפשטות β-cell יכול בסופו של דבר להגדיל β-cell המוני ולשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בחולי סוכרת 3. עם זאת, הערכה ואימות של תרכובות שגשוג פוטנציאל β-תא איי שלמים הכרחי לפני ניתן לפתח טיפולים יעילים. השתלת איי אדם cadaveric לתוך אנשים עם סוכרת משחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בדם במשך זמן מה, אבל זמינויות ההצלחה של הליך ניסיוני זה הפריעו מחסור איי אדם זמינים להשתלה ועל ידי מוות בטא תא ומאחור האייםאה השתלת 4. אפילו עם גילוי הגורמים לגרום הכפל של תאים מייצרי אינסולין, אתגר גדול עדיין קיים במתן הגורמים הללו לאתרים רלוונטיים in vivo. אסטרטגיה אחת למסירה מקומית מתמשכת של תרכובות שגשוג β-cell היא פולי (לקטית-שיתוף גליקולית) חומצה (PLGA). יש PLGA היסטוריה של שימוש ב FDA אישר מוצרים משלוח סמים בשל בטיחות גבוהה, פריקות ביולוגית, קינטיקה שחרור המורחבת 5. באופן ספציפי, PLGA הוא קופולימר של lactide ו glycolide הזה מבזה באמצעות הידרוליזה עם מים או in vivo או בתרבות לחומצה לקטית וחומצה גליקולית, אשר מתרחשים מטבוליטים באופן טבעי בגוף. מתחם התרופה הכמוס יכול להשתחרר הסביבה על ידי שתי דיפוזיה ו / או מנגנוני שחרור מבוקר שפלים. Encapsulation של COI מספק הגנה מפני השפלה אנזימטי, שיפור הזמינות הביולוגית של מגיב לעומת unencapsulaטד COI 5. אנו ממליצים microspheres PLGA ניתן להשתמש כדי לנהל תרכובות המועמד איים שלמים בתרבות, ובסופו של דבר in vivo. בדיקת יעילותם של PLGA לנהל mitogens β-cell כדי איי vivo לשעבר היא קריטית לפני פרוטוקולי השתלת נחקרות.

נכון לעכשיו, אין טכניקה למדוד התפשטות β-cell בבעלי חיים. ניסויים להעריך את האפקטיביות של תרכובות שגשוג פוטנציאל in vivo ולכן יש לתת לכלב של תרכובות אלה לחיות חיים, עם דיסקציה עוקבות ועיבוד של pancreata עבור immunolabeling. פרוטוקולים כאלה הם יקרים ומייגעים, ודורשים המתחם להיות מערכתיים, ללא כל ערובה לכך שהם יגיעו האי. לעומת זאת, כמה הנציח קווי β-cell זמינים לחקר תאים מייצרי אינסולין בתרבות, אבל שורות תאים אלה חסרים את הארכיטקטורה איון environment נמצא אורגניזמים חיים 6. קווי β-cell הונצח גם מאופיינים כבעלי מידה רבה יותר של שכפול מ β-תאי אנדוגני in vivo, ובכך סיבכה ניתוח של תרכובות המשרים התפשטות. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשתמשת איים שלמים מבודדים עכברים בוגרים. בניגוד קווי β-cell, איים שלמים שומרים על ארכיטקטורת איון נורמלית. כמו כן, בניגוד הניסויים שנערכו in vivo, מתן תרכובות שגשוג ישירות איים שלמים תרבותיים מפחית באופן משמעותי את כמות ריאגנטים כי יש צורך למדוד במדויק התפשטות β-cell.

המחקר הנוכחי מנצל PLGA כדי לנהל COI, בדוגמה זו, גורם הגדילה רקמת חיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF). השיטה המתוארת כאן מקנה יתרון משמעותי על פני הממשל של מתחם גלם האי בתרבית שכן היא מאפשרת שחרור מתמשך של מתחם לתוך התקשורת דואר. יש לציין, assay זה יכול להיות שונה כדי לנהל מגוון רחב של חלבונים ונוגדנים מעניינים איים שלמים. השפעות על סוגי תאים אנדוקריניות אחרות, כולל תאי α, ניתן לנתח גם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם הטיפול בבעלי החיים המוסדי ונדרבילט ועדת השימוש.

1. תיוג COI עם Fluorophore (אופציונלי)

  1. בחר צבע פלואורסצנטי כי יגיב עם אמין ראשוני חינם (למשל, על חלבון), כגון אסטרים succinimidyl או נגזר והעמסה, לדמיין מטען microsphere. ממיסים עודף 8x טוחנת (יחסית שומות של COI) של fluorophore לתוך 200 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO).
  2. Resuspend 50 מ"ג של COI עד לנפח סופי של 800 μl בתמיסת רכב (ריכוז סופי של 62.5 ng / μl). פתרון הרכב ישתנה בהתאם למקור של יוקר המחיה.
    הערה: פתרונות הרכב אופייניים כוללים בופר פוספט (PBS) או DMSO.
  3. להוסיף את כל הפתרון fluorophore / DMSO משלב 1.1 ו resuspend COI. וורטקס לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, מערבולת תערובת התגובה בטמפרטורת חדר(RT) עבור 4 שעות.
  4. בעקבות תגובת התיוג, להסיר fluorophore העודף באמצעות טור desalting.
    1. מסננים למאגר אחסון מעמודה desalting ולשטוף עם 16 מ"ל של מים ללא יונים. מחק את כל הזרימה דרך.
    2. מוסיפים את COI שכותרתו fluorescently לעמודה desalting. Elute עם 1.2 מ"ל מים ללא יונים לאסוף את הזרימה דרך.
    3. צעד elution לחזור על ארבע פעמים נוספות, ובכל פעם הוספת 1.2 מ"ל של מים ללא יונים ואיסוף את הזרימה דרך כמדגם נפרד.
    4. להקפיא את כל הזרימה שנאספה באמצעות דגימות ב -80 מעלות צלזיוס, Lyophilize פי הוראות היצרן למשך 24 שעות.

2. COI טעון הכנת Microsphere באמצעות מים ב-שמן-ב-המים אמולסיה מרככים אידוי השיטה

  1. הוסף 1 מ"ג של שכותרתו fluorescently COI 100 μl של מים ללא יונים כדי ליצור את שלב המים הראשון (W1).
  2. ממיסים 65 מ"ג של פולי (לקטית-שיתוף גליקולית ACIד) (50:50 lactide: glycolide, משקל מולקולרי 54,000 - 69,000) ב 750 μl של dichloromethane בתוך שפופרת microcentrifuge. Ultrasonicate במשך 10 - 30 שניות (160 W) כדי לפזר את PLGA לחלוטין. זו יוצרת את שלב הנפט (O).
  3. הוסף את כל שלב W1 שנוצר בשלב 2.1 לשלב O באופן טיפה חכמה. ת חלב באמצעות homogenizer כף יד ב -20,000 סל"ד למשך 30 שניות כדי ליצור את שלב W1 / O.
  4. הוסיפו את כל השלב W1 / O באופן טיפה חכם עד 15 מ"ל של פתרון 1% (משקל / נפח) פולי מימית (ויניל אלכוהול) (PVA) ו ת חלב באמצעות homogenizer כף יד ב -20,000 סל"ד למשך 30 שניות .
  5. להעביר את כל התחליב שנוצר בשלב 2.4 ל -200 מ"ל בבקבוק מסביב לתחתית ובכפוף ואקום 635 מ"מ כספית באמצעות המאייד רוטרי 1 hr להסיר את הממס וליצור את השלב מימית.
  6. Aliquot 1 מיליליטר של השלב המימי שנוצר בשלב 2.5 עד ארבעה עשרה צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה הפתרון המימי בתוך צינורות microcentrifuge ב 7500XG במשך 8 דקות.
    הערה: בשלב זה, את microspheres נמצאים בתמיסה מימית הנותרים מרוכזים לתחתית הצינור microcentrifuge.
  7. מוציאים בזהירות 900 μl של בתמיסה מימית מן הצינורות microcentrifuge עם micropipette, pipetting כדי לא להפריע את microspheres על החלק התחתון של הצינור microcentrifuge.
    1. שטפו את microspheres של עודף PVA ידי הוספת 1 מ"ל deionized על צינור אחד microcentrifuge. צנטריפוגה ב 7500 XG במשך 8 דקות, ושוב להסיר בזהירות 900 μl של בתמיסה מימית מן הצינורות microcentrifuge עם micropipette, pipetting כדי לא להפריע את microspheres על החלק התחתון של הצינור microcentrifuge.
      הערה: בתמיסה מימית 100 μl הנותרים מכיל את microspheres שנוצר.
  8. להקפיא את פתרון microsphere המימי שנוצר בשלב 2.7 ב -80 מעלות צלזיוס.
  9. microspheres Lyophilize באמצעות lyophilizer פי יצרןהוראות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: התייעלות הטעינה של COI ידי המסת לחלוטין microspheres PLGA וקביעת ביחס חלבון ריכוז כדי עקומת סטנדרט של החלבון חינם 7.
  10. כביקורת שלילית, ליצור קבוצה של microspheres "ריק" (להלן המכונה microspheres שליטה).
    הערה: הדור של microspheres שליטה זהה לדור של microspheres COI טעון הידרופילי, ללא תוספת COI 800 μl של פתרון הרכב בשלב 1.2. חלקיקים שליטה התאמה בריכוז מסה יחסית PLGA כדי microspheres PLGA טעון COI עבור assay mitogen β-cell.

מדיה 3. הכנת איילט תרבות מדיה טרום assay

  1. הכן 200 מ"ל התקשורת לתרבות של איים עכבר ללא פגע: RPMI 1640 מדיה בתוספת 11 גלוקוז מ"מ, סרום סוס 10%, 100 U / G פניצילין מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (להלן המכונה הואנתן תקשורת ותרבות).
    הערה 1: בניגוד בסרום שור העובר (FBS), סרום סוס חסר השליה לקטוגן, גידול inducer של התפשטות β-cell, אשר מקעקעת ניתוח ב assay שגשוג.
    הערה 2: ככל microspheres PLGA אינו מעוקר לפני השימוש, התוספת של אנטיביוטיקה לתקשורת התרבות היא חיונית כדי למנוע זיהום מיקרוביולוגית.
  2. הסר 25 מ"ל של התקשורת בתרבות איון עם פיפטור ומקום אלקטרוניים צינור חרוטי 50 מ"ל. להשלים את 25 מ"ל של התקשורת בתרבות איון בצינור חרוטי 50 מ"ל עם ריכוז סופי של 0.2 מ"מ EGTA כדי ליצור את התקשורת מראש assay.
    הערה: התוספת של EGTA המעטה משחררת קשר תאי תאים בתוך האיים מבלי לשנות אדריכלות איון. החשבון זה יבטיח COI יכול להגיע התאים הפנימיים של האיון ומסייע למנוע נימק של האיון המרכזי.

4. Culturing של איי עכבר Intact

  1. לבודד איים שלמים מן זן שנבחר מראש, מין, agE, גנוטיפ של עכברים לאחר עיכול collagenase שגרתית של 8,9 הלבלב. ברכה יחד איים מן כמו דגימות.
  2. Aliquot 40 איים לתוך אחד טוב של צלחת בתרבית רקמה 96-היטב 200 μl של התקשורת בתרבות איון. איים בגודל התאמה ויזואלית לכל טוב (הערכה מדויקת של שקילות איון (IEQ) בין הדגימות אין צורך). מלאו בארות ריקות מייד בסמוך לבארות עם איים עם 200 מי μl סטרילי לספק חיץ אידוי. תרבות האי בתקשורת הלילה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת אווירה של אוויר 95% ו 5% CO 2.

5. מחדש השעיית COI טעון ובקרה PLGA מיקרוסכמות

  1. לאחר התאוששות איון לילה, microspheres גלולה ידי הוספת מדיה מראש assay כדי aliquot אחד microspheres PLGA COI טעון lyophilized כך הריכוז הסופי של COI בצינור microcentrifuge הוא 10 ng / μl (הסכום של ההווה COI ב כמות נתונה של micros שנוצרpheres נקבע שלב 2.9). Sonicate microspheres COI טעון resuspended באמבט מי קרח למשך 10 דקות ב 160 W עם 10 פעימות שניות ארוכות ב 4 ° C..
  2. microspheres מלא PLGA גלול ידי הוספת הנפח הזהה של תקשורת מראש assay אל מסה שווה של microspheres PLGA מלא lyophilized. Sonicate microspheres PLGA המלא המושעה באמבט מי קרח למשך 10 דקות ב 160 W עם 10 פעימות שניות ארוכות ב 4 ° C..
  3. ראייה לאשר microspheres מפוזרים על ידי pipetting 2 μl של microspheres resuspended בין שני coverslips זכוכית. דמיינו microspheres באמצעות המטרה 40X על מיקרוסקופ epifluorescence או brightfield.
  4. אם צבירה משמעותית של microspheres עדיין גלויה, sonicate באמבט מי קרח למשך 10 דקות נוספות ב 160 W עם 10 פעימות שניות ארוכות על 4 מעלות צלזיוס וחזור להדמיה של microspheres המושעה.

6. טיפול איי עם טעון COI או מיקרוסכמות בקרה PLGA </ P>

  1. עבור כל טוב להיות מטופלים עם microspheres הטעון COI, להכין תקשורת assay על ידי דילול 10 ng / μl של microspheres COI מושעה עם תקשורת מראש assay לנפח סופי של 100 μl וריכוז שנקבע מראש סופי.
    הערה: הריכוז הסופי האופטימלי של החלבון תשתנה עבור כל COI המשמש assay זה. באופן אידיאלי, מגוון של ריכוזי סופי נבדק.
  2. עבור כל טוב כדי לשמש כביקורת, להכין תקשורת assay מלאה על ידי דילול microspheres PLGA המלא המושעה שנוצר בשלב 5.2 עם אותו נפח הדילול נהג לדלל את microspheres הטעון COI בשלב 6.1.
    הערה: איים שטופלו תקשורת assay המלא ישמשו כביקורת שלילית כדי לאפשר זיהוי של מיעוט השפעתה של microspheres הריק אולי על תוצאות הניסוי.
  3. מוציאים בזהירות 100 μl של התקשורת בתרבות איון מכל טוב עם micropipette כזה שאף איים הם וחילצה מהבארות. בעדינות להוסיף 100 μl של תקשורת assay או 100 μl של תקשורת assay המלא כל טוב.
  4. דגירת איים ב 37 מעלות צלזיוס מתחת אווירה של CO באוויר 95% ו -5% 2 במשך שלושה ימים.

7. פיזור איי שלמים על שקופיות מיקרוסקופ

  1. אחרי שלושה ימים, להשתמש micropipette להסיר בזהירות וזורקים התקשורת assay מכל הבארות כדי שלא לעקור איים. בעדינות להוסיף 200 μl PBS כדי איים לשטוף אותם התקשורת assay. מוציאים בזהירות וזורקים PBS עם micropipette ולשטוף בעדינות איים שוב עם PBS 200 μl נוספים.
  2. הסר וזורקים PBS עם micropipette ולהוסיף 100 μl של טריפסין 0.025%, 2 פתרון EDTA מ"מ. לדגור על RT במשך 3 דקות. Pipet איים בפתרון טריפסין-EDTA למעלה ולמטה כל 2 דקות עד איים יאושרו חזותית להיות מפוזר לתוך תאים בודדים (שים לב שחלק גושים קטנים של תאים עשויים עדיין להיות נוכח) באמצעות מיקרוסקופ אור. מעביר את כל הנפח של כל טוב פרטly לתוך צינורות microcentrifuge labeled-.
  3. להוסיף 400 μl של התקשורת בתרבות איון על צינור אחד microcentrifuge לעצור את תא דיסוציאציה בתיווך טריפסין.
  4. צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות ב 100 XG ב 4 ° C. גלולות תאי איון לתחתית צינורות microcentrifuge.
  5. הוצא בעדינות supernatant באמצעות micropipette, ו resuspend גלולה ב 200 תקשורת טריה μl תרבות איון.
  6. באמצעות צנטריפוגות ציטומגלווירוס, צנטריפוגות ניתקה אי ב 140 XG במשך 3 דקות על גבי שקופיות מיקרוסקופ טעונות.
  7. שקופיות האוויר יבשות ב RT במשך 10 דקות, ולאחר מכן לצייר תיבה מסביב האי ניתק עם עט סימון הידרופובי.
  8. תקן תאים עם 75 μl paraformaldehyde% 4 (PFA) ב RT במשך 10 דקות. הסר PFA 4% לשטוף בעדינות תאים 75 μl PBS פעמיים. לאחר הכביסה, permeabilize תאים עם 75 μl 0.2% Triton X-100 ב PBS במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף תאים עם 75 μl PBS.
    זהירות: PFA ידוע להיות אלרגני, מסרטנים, ורעיל.
  9. 8. תיוג Immunofluorescence של האיים ניתקו עבור אינסולין ותא הפצת המרקר, Ki67

    1. הכן תא לח על ידי נחת שתי מגבות נייר רטובות בתחתית תיבת שקופיות מיקרוסקופ קיבולת 100 שקופיות.
    2. מקום מחליק שטוחים למטה (תאים הפונים כלפי מעלה) בתא לח. הכן דגימות עבור תיוג ידי aspirating את PBS לשטוף את השלב הקודם באמצעות micropipette והוסיף 75 μl של פתרון לחסימה (5% רגילים דונקי סרום (NDS) ב PBS) כל שקופית לחסום הלא ספציפי מחייב של נוגדני הדגימות. דגירת שקופיות בחסימת פתרון עבור שעה 1 ב RT.
    3. לשאוב בעדינות חסימת פתרון באמצעות micropipette ולהוסיף 75 μl של פתרון נוגדן ראשוני המכיל נוגדנים נגד אינסולין ארנב שפן ניסיונות אנטי Ki67, מדולל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 5% NDS ב PBS. לדגור על RT במשך שעה 1.
      הערה: סמנים אלטרנטיביים של התפשטות תאים כוללת מתרבים אנטיגן גרעין תא (PCNA) ו phosphohistone H3 (PH3),
    4. לשאוב בעדינות פתרון נוגדן ראשוני באמצעות micropipette ולשטוף את התאים עם 75 μl PBS. לשאוב PBS באמצעות micropipette ולשטוף תאים פעמיים נוספות, בכל פעם עם 75 μL PBS. דגירה כל דגימה עם 75 μl נוגדנים משני אנטי-גינאה חזיר Cy5 ו נוגדנים משני Cy3 נגד ארנב מדולל ל 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​חסימת פתרון עבור שעה 1 ב RT.
      הערה: אין להשתמש נוגדנים משני שכותרתו עם fluorophore זהה או חופפים ספקטרלית ששימש כבר לתייג את microspheres.
    5. פתרון נוגדנים משני לשאוב באמצעות micropipette דגירה 75 μl של 300 ננומטר DAPI ב PBS 3 דקות ב RT. לשאוב DAPI באמצעות micropipette ולשטוף במים deionized במשך 5 דקות.
    6. לשאוב בעדינות מים ממדגמים באמצעות micropipette. ספוט ירידה (בערך 100 μl) של פתרון גובר המתייבשים במהירות המכיל antifade מגיב על coverslip זכוכית. הפוך בצד מדגם שקופיות מיקרוסקופ למטה, on כדי הפתרון הגובר. לחץ בעדינות את coverslip נגד שקופיות באמצעות קצה pipet כדי להסיר בועות וימחה נוזל עודף עם רקמות לניקוי רהיטים רכים. אפשר coverslips לייבוש למשך הלילה ב RT.

    9. רכישת תמונה וניתוח

    1. שימוש במיקרוסקופ epifluorescence עם מצלמה מחוברת לרכישת התמונה. עבור כל fluorophore, לקבוע את זמן החשיפה האופטימלית (בדרך כלל 20 msec עבור DAPI, 40 - 80 msec עבור אינסולין, ו -250 msec עבור Ki67). ודא פרמטרי רכישת תמונה שווים עבור כל הדגימות.
    2. עבור כל דגימה, לספור ידנית 3,000 תאים חיובי אינסולין מאותם לספור כמה הם גם Ki67 חיובי. רק לספור תאי אינסולין חיובי שיש להם מוגדר היטב וברור גרעין גלוי. חישוב אחוזי מתרבים β-תאים עבור כל דגימה על ידי חלוקת מספר Ki67 חיובי / תאים חיובי אינסולין על ידי המספר הכולל של תאים מייצרי אינסולין חיובי הכפלה 100.
    3. לאחר דetermining האחוז מתרבה β-תאים עבור כל דגימה, ולקבוע אם הבדל מובהק סטטיסטי בהתרבות β-cell קיים בין מלא דגימות ניסוי על ידי ניתוח תוצאות עם ANOVA חד-כיווני באמצעות תוכנה סטטיסטית זמינה מסחרי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 הוא ייצוג חזותי של microspheres שנוצר באמצעות פרוטוקול לעיל. הפרוטוקול המתואר כאן תשואות microspheres הטעון rhCTGF בגדלים שונים. השבר הגדול של microspheres יהיה בין 1 ל -10 מיקרומטר קוטר, אם כי microspheres מסוים עשוי להיות גדול יותר (איור 2). אם ירצה, גודל microsphere יכול להיות מכוון אופטימיזציה על בסיס פרמטרי ייצור כגון מהירות המגון וזמן, ריכוז פעיל שטח בשימוש, ואמצעי אחסון יחסי של כל שלב מים / שמן / מים 10.

בעקבות פיזור איים שלמים שטופלו microspheres PLGA ו immunolabeling עוקבות, מקובל לראות אזורים של המדגם נטול כל תיוג בין תאים (איור 3). בעוד שרוב microspheres כי הם עדיין תמימים לאחר תקופת טיפול התרבות הםהוסר במהלך השלבים לשטוף, כמה יישארו לאחר האיים הם הסתחררו על שקופיות מיקרוסקופ. microspheres אלה גורמים מבנים דמויי חור דמיינו במהלך ההדמיה. microspheres שיורית אלו בדרך כלל אינו מפריע כימות שלאחר מכן.

לאחר הדמיה, אחוז Ki67 חיובי / תאי אינסולין חיובי ניתן לכמת באופן ידני על ידי ספירת המספר הכולל של תאים שכותרתו, או באמצעות ניתוח תמונת תוכנה. בעבר, היינו הוכיחו כי גורם הגדילה רקמת חיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF) יכול לעורר התפשטות β-cell עכבר איים שלמים vivo לשעבר 11. שימוש בפרוטוקול לעיל, אנו שנוצרנו microspheres PLGA המכיל rhCTGF (rhCTGF-PLGA). טיפול איים שלמים עם microspheres rhCTGF-PLGA במשך 3 ימים הביאה לעלייה דומה בהתרבות β-cell כפי שדווח בעבר עם חלבון גלם, הוכחת כי חלבון לא lo se כל הפונקציונליות במהלך הדור microsphere (איור 4).

איור 1
איור 1:. ייצוג חזותי של מיקרוסכמות PLGA ידי שילוב צבע פלואורסצנטי לתוך פרוטוקול ייצור, microspheres PLGA ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. התפלגות גודל של מיקרוסכמות PLGA למרות התפלגות גודל עשויה להשתנות, רוב microspheres יהיה פחות מ -10 מיקרומטר קוטר.arget = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. ויזואליזציה Immunofluorescent של מפוזרים מתרבים β-תאי איים מפוזרים הם immunolabeled לסמן התפשטות Ki67 (אדום) ואינסולין (ירוק) כדי לסמן מתרבים תאי β. גרעינים מסומנים עם DAPI (כחול). החצים מצביעים Ki67 חיובי / תאים חיובי אינסולין. כוכביות (*) מצביעים microspheres undegraded. סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: כימות וניתוח של פרו β-cellliferation. איי מטופלים עם כמויות שונות של microspheres rhCTGF-PLGA. מספר Ki67 חיובי / תאים חיובי אינסולין נספר באופן ידני מכל המדגמים ו מבוטא באחוזים של המספר הכולל של אינסולין חיובי β-תאי. ציר ה- X תואם את הריכוז הסופי של הווה rhCTGF בכל טיפול. מובהקות סטטיסטיות נקבעו באמצעות דרך אחת-ANOVA ואחריו מבחן ההשוואה הנפוץ של Tukey. מובהקות סטטיסטיות נקבעו בעמ ≤ 0.05. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המחקר של התפשטות β-cell בתרבות נפגע בדרך כלל על ידי מספר קשיים. ראשית, קווי β-cell הנציח מאופיינים לתארים גבוהים של התפשטות ממה נמצא β-תאי אנדוגני איים חי. בנוסף, שורות התאים הנציחו אלה חסרות את הארכיטקטורה הנורמלית חיונית לתפקוד β-תא נורמלי. שתי עובדות אלו מקשות על מנת לקבוע אם תוצאות שהתקבלו באמצעות קווי β-cell הנציחו יקיימו נכון כאשר נבדקו in vivo או איים שלמים. הפרוטוקול המתואר שלנו, אשר משתמש איי עכבר שלמים טרי מבודדים, עוקף בעיות אלה כמו ארכיטקטורת איון מתוחזק התפשטות β-cell דומה לזו מצאה in vivo.

דאגה משמעותית אחת כאשר culturing איים שלם היא האפשרות כי תאים בתוך ליבת האיון יעברו נימק נגרמת היפוקסיה או לא ייחשפו rhCTGF. מסיבה זו, סופיריכוז של 0.1 מ"מ EGTA מתווסף התקשורת כדי לשחרר את אנשי הקשר תאים תאים מבלי לשבש אדריכלות איון. פרסמנו בעבר כי תוספת של EGTA לבדו יכול להגדיל התפשטות β-cell, ככל הנראה בשל גישה מוגברת של חומרים מזינים mitogens בתקשורת עד היסוד איון 12. הגידול התפשטות β-cell בתגובה EGTA יכול להיות גם כתוצאה מירידה במגע תאים תאים עצמו 13,14. התקשורת המתוארת פרוטוקול זה הוא השלימה גם עם סרום סוס במקום בסרום שור העובר המסורתי יותר. החלפה זו נעשית בשל נוכחותם של לקטוגן שליה בסרום שור עובר, אשר יכול לעורר התפשטות תאי β מעצמו, פוטנציאל סיבוך הניתוח ב assay השגשוג.

קביעת הרעילות היחסית של microspheres PLGA (עם או בלי COI) אל התאים איון ניתן להעריך באמצעות ניתוח immunofluorescence של markers של מוות של תאים או נזק ל- DNA, כולל TUNEL או γ-H2AX 15,16. למרות התוספת של microspheres PLGA לא הראתה השפעות מזיקות ברורות כלשהו איים vivo לשעבר, המשתמשים צריכים להיות מודעים להשפעות microspheres יכול להיות על ניתוח תמונה. כפי שניתן לראות באיור 3 ו שהוזכרו בסעיף התוצאות, microspheres undegraded יכול להיות ברור כמו כתמים כהים בתוך תמונות immunofluorescent, עם microspheres יותר להופיע כאשר ריכוזי הגדלת מנוצלים.

יצוין כי הפרוטוקול המתואר כבר מותאם לעבודה עם איי עכבר מבודדים. ככזה, אין זה ברור אם תנאים זהים יעבדו עם איים שנקטפו מן אורגניזמים חלופיים, כגון חולדה ובני אדם. יש לציין, איים שנקטפו מאורגניזמים שונים לעתים קרובות יש תנאי culturing אופטימלית שונים בדרגות שונות של התפשטות β-cell 17,18.

biom רבaterials זמינים פוטנציאל לנהל rhCTGF כדי איים מבודדים, כולל פולי (thioketal-urethane) ו פולי (גופרי פרופילן) 19. בחרנו להתמקד PLGA בשל מספר תכונות לציין, כי ברשותה. ראשית, PLGA הוא מגיב סביר יחסית ואת microspheres יכול להיוצר עם ציוד סטנדרטי (צנטריפוגות, homogenizer, lyophilizer) זמין לכל היותר ומכוני מחקר. PLGA הוא פולימר מלאכותי כי יש תקדים לשימוש מוצלח התקני ה- FDA בשל biocompatibility שלה, פריקות ביולוגית, ויכולתה לווסת שיעורי שחרור מתחם 20. PLGA מדרדרת ידי הידרוליזה בנוכחות מים, שחרור המטען שלה בתהליך. ההרכב הכימי של חלקיקי PLGA יכול להיות מותאם כך תרכובת משתחררת in vivo על התקופה של מספר שבועות. PLGA שימש גם בניסויים פרה-קליניים בבעלי חיים וטיפולים קליניים בבני אדם כדי מקומית לנהל תרכובות לאיברים tissu שוניםes 21,22. פולימרים הידרופובי אחרים יכולים לשמש גם בדור של microspheres מתכלה. פולימרים אלו יכולים להגיב לגירויים סביבתיים ספציפיים, כגון pH, טמפרטורה, ואת הנוכחות של מיני חמצן מגיבים 23,24. לכן, החוקרים צריכים לשקול היטב אשר ביולוגי הוא המתאים ביותר עבור לימודיהם.

כל חוקר ניצול PLGA, או חומרים ביולוגיים אחרים, ללמוד התפשטות β-cell vivo לשעבר צריך להיות מודע הבדלים אפשריים בין ההשפעות של כמוס COI לעומת unencapsulated COI. לדוגמה, משלוח של rhCTGF באמצעות PLGA יכול לשנות את מידת ועיתוי אינדוקציה התפשטות β-cell בהשוואה לטיפול עם חלבון unencapsulated. מחקרים מתמשכים במעבדה שלנו בוחנים בימים אלו הבדלים אפשריים אלה.

הניתוח של התפשטות β-תא איים תרבותי הוא מודל רב עוצמה לזיהוי ליניתוח chanistic של mitogens β-cell. באמצעות assay המתואר כאן אנו מציגים שיטה יחסית מהירה וחסכונית עבור חולש על COI כדי איים בתרבית מבודדת עם רכב משלוח השחרור מורחב. Assay זה צריך לחול על כמעט כל COI עניין, והבחירה שלנו להתמקד CTGF מבוסס אך ורק על היכולת שלה שפורסמה בעבר כדי לעורר התפשטות β-cell in vivo לשעבר vivo 11. בנוסף, assay זה יכול לאמת את היעילות והבטיחות של שימוש PLGA כשיטת ההצגה לפני קידום מודלים שבו איים מושתלים ביצורים חיים. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר מספק דרך חדשנית לניהול תרכובות איים תרבותיים עם השפעה רחבה יותר על מדידת הבטיחות של PLGA כדי ברקמות להשתלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer ThermoFisher Scientific O6149 For labeling COI with fluorophore
DMSO Dimethyl Sulfoxide Fisher BioReagents BP231-1 For dissolving fluorophore in step 1
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01 Desalting column used in step 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 Sigma-Aldrich 739960 Used in generation of microspheres in step 2
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 Sigma-Aldrich 341584 Used in generation of microspheres in step 2
RPMI 1640 Thermo Scientific 11879-020 For culturing islets
Dextrose Anhydrous Fisher BioReagents 200-075-1 Supplement for islet media
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Antibiotics for islet media
Normal horse serum Jackson ImmunoResearch 008-000-121 Supplement for islet media
96-well tissue culture plate Corning 3603 For culturing islets
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 Supplement for pre-assay islet media
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 For spinning cells onto microscope slides
EZ Single Cytofunnel Thermo Scientific A78710020 For spinning cells onto microscope slides
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BioReagents BP118-500 Used in dissociating islets
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 For fixing cells
Triton  X-100 Fisher BioReagents BP151 For permeabilizing cells
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121 Blocking reagents for immunofluorescence
Anti-Ki67 antibody abcam ab15580 For Ki67 immunofluorescence
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin Dako A0564 For insulin immunofluorescence
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152 For Ki67 immunofluorescence
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig Jackson ImmunoResearch 706-175-148 For insulin immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ThermoFisher Scientific D1306 For nuclei visualization in immunofluorescence
Aqua-Mount Lerner Laboratories 13800 Fast drying mounting media
FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System Labconco 7382020 For lyophilization of microspheres

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (1), 102-110 (2003).
  2. Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15, (4), 290-296 (1998).
  3. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, (4), 1255-1270 (2005).
  4. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (7), 007823 (2012).
  5. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161, (2), 505-522 (2012).
  6. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27, (2), 105-113 (2010).
  7. Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8, (2), 511-518 (2012).
  8. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, (1), 35-39 (1967).
  9. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
  10. Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3, (4), 487-496 (2008).
  11. Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64, (4), 1284-1298 (2015).
  12. Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55, (6), 310-312 (2013).
  13. Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20, (5), 617-626 (2007).
  14. Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56, (4), 856-866 (2013).
  15. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119, (3), 493-501 (1992).
  16. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22, (3), 305-309 (2008).
  17. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19, (12), 1523-1535 (2010).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16, (5), 635-646 (2016).
  20. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3, (3), 1377-1397 (2011).
  21. Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114, (2), 242-250 (2006).
  22. Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. (2015).
  23. Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9, (5), 6526-6534 (2013).
  24. Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).More

Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter