Introduction
Олефин этилена (С 2 Н 4) был впервые обнаружен в качестве гормона растений в 1901 г. , когда было обнаружено , что проростков гороха, выращенных в лаборатории , которые использовали уголь газовых ламп, обнаруживал аномальную морфологию , в которой грозди (гипокотиля) были короче, толще и изгибается в сторону по сравнению с нормальными проростков гороха; фенотип позже назвал тройной 1,2 ответа. Последующие исследования показали , что этилен является жизненно важным фитогормонов , который регулирует многочисленные процессы развития , такие как рост, реакции на стресс, созревание плодов и Старение 3. Резуховидка Таля, модельного организма для исследования биологии растений, хорошо изучен в отношении его реакции на этилен. Мутанты ответа Несколько этилена были выделены за счет использования тройного фенотип ответ , наблюдаемый в темно-выращенной А. thaliana рассады в присутствии этилена 1,4,5. Биосинтетического предшественника для производства этилена в растениях 1-аminocyclopropane карбоновой кислоты (АСС) 6 и обычно используется в процессе анализа тройной ответ , чтобы увеличить выработку эндогенного этилена , что приводит к тройному фенотипа ответ 1,4,5.
Хотя реакция этилена широко изучен в растениях, действие экзогенного этилена на бактерий значительно изучено недостаточно, несмотря на тесной ассоциации бактерий с растениями. В одном из исследований сообщалось , что некоторые штаммы Pseudomonas могут выжить с использованием этилена в качестве единственного источника углерода и энергии 7. Тем не менее, только два исследования показали, что бактерии реагируют на этилен. Первое исследование показало , что штаммы синегнойной палочки, P. Fluorescens, П. putida и P. syringae были хемотаксическая к этилена с использованием агарозы анализа штепсельной вилки , в котором расплавленный агарозы, смешивали с буфером для хемотаксиса , уравновешенную чистым газообразным этиленом 8. Тем не менее, насколько нам известно, не было ни одного Фюртотчеты эр с использованием чистого газообразного этилена для характеристики бактериальной реакции этилена, вероятно, связано с трудноподдающихся обращения газов в лаборатории без специализированного оборудования. Второй доклад бактериальной реакции этилена показали , что этилен увеличился объем производства целлюлозы бактерий и влиял на экспрессию генов в фруктовой-ассоциированной бактерии, Komagataeibacter (ранее Gluconacetobacter) xylinus 9. В этом случае соединение этилен-рилизинг, использовали 2-chloroethylphosphonic кислота (СЕРА) для получения этилена на месте в бактериальной ростовой среде, обходя потребность чистого газообразного этилена или специализированного оборудования.
СЕРА производит этилен при соотношении 1: 1 молярной при рН выше 3,5 10,11 через катализируемой основанием, реакцией первого порядка 12 - 14. Деградация ЗООСК положительно коррелирует с рН и температурой 13,14 и результатов в производстве этилового эфираена, хлорид и фосфат. CEPA обеспечивает исследователей, заинтересованных в изучении бактериальных ответов этилена с удобной альтернативой газообразным этиленом.
Общая цель следующих протоколов является обеспечение простой и эффективный метод для изучения бактериальных ответ этилена и включает в себя проверку физиологически соответствующих уровней производства этилена из разложения CEPA средой роста бактерий, анализ культуры рН, чтобы обеспечить СЕРА разложение не нарушается во время рост бактерий, и оценка влияния этилена на бактериальной морфологии и фенотипом. Мы демонстрируем эти протоколы с использованием К. xylinus, однако, эти протоколы могут быть адаптированы для изучения реакции этилена в других бактерий, используя соответствующую среду для роста и фенотип анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Химические вещества
- Готовят раствор 500 мМ СЕРА (144,49 г / моль) и раствор , состоящий из обоих 500 мМ NaCl (58,44 г / моль) и 500 мМ NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 г / моль) в подкисленной (рН 2.5) ультра-чистой воды или 0,1 N HCl. Смешайте с помощью вихря до тех пор, пока решения очевидны.
- Серийно разбавить (10x) в 500 мМ растворов в том же растворителе, чтобы получить 5 мМ и 50 мМ запасов.
- Готовят 10 мМ раствор 1-аминоциклопропан карбоновой кислоты (АКК; 101,1 г / моль) в сверхчистой воде.
- Фильтр-стерилизовать растворы и хранить аликвоты при -20 ° С.
- Фильтр-стерилизовать целлюлазы. Хранить аликвоты при температуре 4 ° С.
2. Проверка производства этилена из 2-Chloroethylphosphonic кислотного расщепления: Тройной Анализ ответа
- Поверхностно-стерилизовать Резуховидка Таля Семена Экотип Columbia Использование парофазной метода:
ВНИМАНИЕ: Следующий шаг производит тгазообразный хлор кислородной. Проведение стерилизации семян в вытяжном шкафу.- Получить свариваемый контейнер достаточно глубоко, чтобы разместить стеклянный стакан емкостью 250 мл для стерилизации семян и поместить его в вытяжном шкафу.
- Добавить A. thaliana семена в микроцентрифужных трубки и поместить трубку в стойку. Поместите стойку, содержащую открытую трубу в запечатанный контейнер.
Примечание: Не заполнять отдельные трубы более половины заполнен, чтобы позволить газообразный хлор проникать в нижние семена. - Поместите 250 мл химический стакан, содержащий 100 мл коммерческого хлорной извести в запечатанный контейнер. Осторожно добавьте 3 мл концентрированной соляной кислоты к хлорной извести и немедленно герметизировать контейнер с крышкой.
ВНИМАНИЕ: Bleach и HCl взаимодействовать с образованием токсичных газов хлора, который действует на поверхность стерилизации семян. - Выдержите семена в присутствии газообразного хлора в течение 4 ч в fumehood.
Примечание: Более длительное время стерилизации приведет к снижению эффективности всхожесть. - После стерилизации позволяют грhlorine газа, чтобы выразить в вытяжном шкафу в течение не менее 1 часа, а затем запечатать микроцентрифужных трубку. Оставьте отбеливатель и смесь HCl в fumehood в течение по крайней мере 24 часов, прежде чем выбросить.
Примечание: Стерилизованные семена могут храниться при комнатной температуре для немедленного использования. - Хранить семена при температуре 4 ° С в течение длительного хранения. Принесите семена до комнатной температуры перед открытием микроцентрифужных трубки для предотвращения образования конденсата. Семена Хранить в темноте.
- Приготовьте чашки с агаром в 4 сектора чашки Петри (90 х 15 мм):
- Приготовьте 110 мл ростовой среды для А. thaliana рассаду: 1x Мурасиге и Скуга (МС) базальную среду 15 (4,33 г / л) , содержащий 1% (вес / объем) сахарозы и 0,8% (вес / объем) агара. Отрегулировать среду MS до рН 6 NaOH.
- Приготовьте 100 мл средой роста бактерий для разложения CEPA: Шрамм и Hestrin (SH) среды 16 , содержащей 1,5% (вес / объем) агара. Отрегулируйте SH среды до рН 7 с помощью NaOH.
- Стерилизовать автоклавированием СМИ и Темпег в C водяной бане при 55 °.
- После того, как MS агар закалила, добавьте 40 мл в стерильную колбу. Для получения положительного ростовую среду управления для А. thaliana рассада, дополняют 40 мл аликвоты MS агар с 40 мкл 10 мМ АСС , чтобы получить конечную концентрацию 10 мкМ АСС.
- Добавьте 5 мл среды в соответствующие квадрантов секторных чашки Петри (рис 1) и позволяют агар затвердеть. Подготовьте все пластины в трех экземплярах.
Примечание: CEPA не не добавляется в среду роста до позже в протоколе.
Рисунок 1:. Установка агаровых пластин , используемых для тройного анализа ответа с ЗООСК Схематическое иллюстрирует квадранты специфические для отрицательного контроля (A), положительный контроль (б) и экспериментальные пластины (С). Эта цифра была изменена с Augimeri и ремешок 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Стратифицировать А. thaliana Семена по обеспечению синхронного прорастание:
- Добавьте примерно пятьдесят A. Семена thaliana на каждый квадрант , содержащий MS или MS + ACC агара. Семена Обеспечить равномерно распределены для облегчения удаления и анализа всходов.
- Инкубируют планшеты, содержащие семена в темноте при 4 ° C в течение 3-4 дней.
- Разложить CEPA на бактериальный рост среды (SH) и выполнить тройной Response Пробирной:
- После стратификации, подвергать семена люминесцентным светом в течение 2 часов.
- Спред 10 мкл исходного раствора 500 мМ CEPA на квадранты экспериментальных пластин , содержащих SH агар (рН 7; Рисунок 1) , чтобы получить конечную концентрацию СЕРА1 мМ.
- Уплотнение пластин лабораторной пленкой и накрыть фольгой, чтобы создать темную среду для семян.
- Прорастают семена путем инкубирования пластин в темноте при 23 ° С в течение 3-х дней с агаровой стороной вниз.
Примечание: Пластины могут быть сложены, но негативные контроли должны быть размещены на дне, так как этилен легче воздуха.
- Анализ Тройной Response Пробирной данных:
- С пламенем стерилизовать пинцетом, удалить отдельные сеянцы из пластины, соответствующей каждой обработки и зрения при вскрытии или цифровой USB-микроскоп. Убедитесь, что в нижней части сеянцев выровнены и фотография.
- Удалить 30 рассаду из каждого квадранта (60 саженцев на биологической повторности и 180 саженцев на обработку). Совместите на поверхности с черным фоном и фотографии с линейкой.
- Измерьте длину гипокотиля (мм) дублирующих рассады с использованием программного обеспечения ImageJ 17. Установите масштаб, нажав и перетащив * прямые *Инструмент для выбора длины 10 мм. Выберите "Set Scale" на вкладке "Анализ" и установить известное расстояние до 10. Использование * сегментированных * инструмент, нажмите и перетащите, чтобы выбрать длину гипокотиля и нажмите кнопку M, чтобы измерить расстояние. Сравните средства с использованием биологических повторностей одностороннего ANOVA с многократным тестом сравнени, Тьюки. Различия считались значимыми при р <0,05.
3. Анализ рН на протяжении роста бактерий
- Расти и Quantify Komagataeibacter xylinus заквасок в трех экземплярах:
- Привить одну колонию К. xylinus в 5 мл SH среды (рН 5) , дополненной 0,2% (об / об) стерилизованным фильтрацией целлюлазы. Инкубируйте культур при 30 ° С при перемешивании при 150 оборотах в минуту , пока OD 600 с от 0,3 до 0,4 достигается (около 72 ч).
- Урожай закваски путем центрифугирования (2000 XG; 4 ° C; 10 мин). 5 мл стерильного 0,85% (вес / объем) наКл раствора, промыть клетки дважды и ресуспендируют осадок клеток. Сохранить клетки на льду.
- Количественно клеток с использованием счетнокамерное Petroff-Häusser.
- Привить Культуры для анализа рН:
- Добавьте 150 мл бульона SH (рН 7), дополненной 0,2% (об / об) стерилизованным фильтрацией целлюлазы до двенадцати 500 мл колбах с крышками из фольги. Привить колб с К. Закваски xylinus при концентрации 10 5 клеток / мл. Используя три заквасок, подготовить три биологических повторах на курс лечения.
- Дополнение культуры с 300 мкл 5, 50, или 500 мМ растворов УСППОО для получения конечных концентраций УСППОО 0,01, 0,1 и 1,0 мм, соответственно. Дополнение необработанных контрольных культур с 300 мкл растворителя, используемого для растворения CEPA.
- Уплотнение колб путем плотно лентой крышки из фольги к колб и инкубировать культур в течение 14 дней при температуре 30 ° C при перемешивании со скоростью 150 оборотов в минуту.
- Каждый день, asepticaLLY удалить 5 мл пробы из каждой колбы и гранул клеток путем центрифугирования (2000 XG; 4 & deg; С; 10 мин). Передача супернатанты в чистую пробирку, и измеряют рН каждого биологического повторности с использованием рН-метра.
- Анализ данных по времени курса путем построения графика среднее значение рН биологических повторностях.
Примечание: Важно, чтобы культура рН не падает ниже 3,5; культура рН 5 значительно уменьшает высвобождение этилена с СЕРА, и рН ниже 3,5 полностью ингибирует высвобождение этилена. - Для контроля уровней хлора и фосфатов, выполняют идентичный эксперимент с использованием 0,01, 0,1, и 1,0 мМ 4-раствором хлорида натрия NaH 2 PO с использованием 5, 50 и 500 мМ запасов, соответственно.
4. Colony Морфология
- Grow K. xylinus Закваски в трех экземплярах:
- Привить одну колонию К. xylinus в 5 мл SH среды (рН 5) , дополненной 0,2% (об / об) стерилизованным фильтрацией целлюлазы. ИнкубаторыТе культуры при 30 ° С при перемешивании при 150 оборотах в минуту , пока OD 600 составляет от 0,3 до 0,4 достигается (около 72 ч).
- Урожай закваски путем центрифугирования (2000 XG; 4 ° C; 10 мин). 5 мл стерильного физиологического раствора, промыть клетки и затем ресуспендируют осадок клеток. Сохранить клетки на льду.
- Подготовка 24 агаром, содержащих 25 мл SH (рН 7) среде с 1,5% (вес / объем) агара.
- После того, как агар затвердеет, распространение 50 мкл 5, 50 и 500 мМ УСППОО растворы на агаре для получения необходимой концентрации УСППОО 0,01, 0,1 и 1,0 мм, соответственно. Настройка необработанных и контроля растворителя пластины, которые состоят не поправки и распространение 50 мкл растворителя, используемого для растворения исследуемых соединений.
- Streak пластины для изолированных колоний с петлей-полной (~ 5 мкл) К. xylinus закваска и запечатать их с парафиновой пленки. Привить все пластины в трех экземплярах. Инкубируйте пластин в течение пяти дней при 30 ° C.
- фотograph колонии при увеличении 20Х с помощью цифрового микроскопа USB и качественной оценки морфологии колоний и целлюлозного производства на твердой среде.
Примечание: Целлюлоза появляется в виде туманного вещества по краю колонии. - Для контроля уровней хлора и фосфатов, выполняют идентичный эксперимент с использованием 0,01, 0,1, и 1,0 мМ 4-раствором хлорида натрия NaH 2 PO с использованием 5, 50 и 500 мМ запасов, соответственно.
5. пелликулой Assays
- Расти и Quantify К. xylinus Закваски в трех экземплярах:
- В трех экземплярах, прививают одну колонию К. xylinus в 5 мл SH среды (рН 5) , дополненной 0,2% (об / об) стерилизованным фильтрацией целлюлазы. Инкубируйте культур при 30 ° С при перемешивании при 150 оборотах в минуту , пока OD 600 с от 0,3 до 0,4 достигается (около 72 ч).
- Урожай закваски путем центрифугирования (2000 XG; 4 ° C; 10 мин). С 5 мл стерильного физиологического раствора, промойте тон клетки дважды и ресуспендируют осадок клеток. Сохранить клетки на льду.
- Количественно клеток с использованием счетнокамерное Petroff-Häusser.
- Подготовка мастер Смеси для инокуляции 24-луночные планшеты:
- Дополнение 60 мл SH среды (рН 7) с 120 мкл 5, 50 и 500 мМ запасов CEPA для получения необходимой концентрации УСППОО 0,01, 0,1 и 1,0 мм, соответственно. Дополнение еще 60 мл SH среды (рН 7) с 120 мкл растворителя, используемого для растворения CEPA. Vortex перемешать.
- Разделите каждые 60 мл CEPA-содержащей среды на четыре 14 аликвоты. Инокулируйте три аликвоты по 14 мл с биологическими повторах закваски при концентрации 10 5 клеток / мл. Хранить пробирки с клетками на льду для предотвращения производства целлюлозы.
Примечание: Оставшиеся 14 мл аликвоты будет использоваться для стерильных контрольных лунок.
- Привить 24-луночные планшеты:
- Проверьте каждое лечение в своей собственной тарелке с тремя рядами биологических повторностей иряд стерильных элементов управления (рисунок 2).
Рисунок 2:. Блок-схема , иллюстрирующая протокол , используемый для анализа и анализа зубного налета со СЕРА-добавляемой рН 7 SH среды (60 мл) , аликвоты для трех отдельных биологических повторными прививками и стерильный контроль (14 мл каждый раз ). Эти культуры затем аликвоты в шесть технических повторностей (2 мл) в 24-луночный планшет и затем герметизируют парафином пленкой. После инкубации в течение 7 дней при температуре 30 ° C, Плёночные собирают и характеризуется путем определения влажного веса, толщины, сухой вес и степень кристалличности с помощью FT-IR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры
- Использование основной смеси 14 мл, добавьте 2 мл в EACч из шести лунок стерильного 24-луночного планшета. Заполните для трех биологических повторностях и стерильного контроля (рисунок 2). Повторите эти действия для каждой обработки.
- Уплотнительные пластины с парафиновой пленки и инкубировать статически в течение 7 дней при 30 ° C.
- Урожай и Мера зубного налета Мокрый вес, толщина, сухой вес (Целлюлоза Выход) и кристалличности (рисунок 2):
- Выжмите одну сторону пелликулой, чтобы поднять противостоящую пленочную края и удалить отдельные Плёночные с пинцетом. При сохранении сцепление с дорогой, поместите их на бумажное полотенце свежей в течение 3 секунд, чтобы удалить излишки среды до взвешивания для определения их влажные веса.
- Совместите Плёночные, примыкающие к линейке и фотографии со стороны с помощью цифровой камеры с высоким разрешением.
- С помощью программного обеспечения ImageJ 17, измерения толщины пленки на левое плечо, правое плечо и в центре каждого налетом. Нормальное все технические повторах для каждого биологического replicatе.
- Индивидуально передачи Плёночные в лунки 6-луночного планшета. Treat Плёночные с 12 мл 0,1 N NaOH при 80 ° С в течение 20 мин для лизиса клеток.
- Удалите NaOH и нейтрализуют Плёночные путем промывания сверхчистой водой в течение 24 ч при перемешивании. Изменение воды каждые 6 часов.
Примечание: Плёночные должен быть белым после завершения стадии промывки. - Место Плёночные на кремниевых матов и сушат при 50 ° С в течение 48 ч до постоянного веса. После высыхания удалить из ковриков и измерения веса пелликулой в аналитическом масштабе для определения бактериальной выход целлюлозы.
- Анализ пленочную кристалличности с использованием ИК-Фурье - спектроскопии (FT-IR) с использованием 32 сканирований и разрешением 4 см -1 в диапазоне от 4000 до 650 см -1. Вычислить показатель кристалличности, CI (ИК), с использованием 1437 / A 895; отношение абсорбция "кристаллической группы" и "аморфный" полосы , как описано ранее 18.
- Для контроля уровней хлора и фосфатов, выполняют идентичный эксперимент с использованием 0,01, 0,1, и 1,0 мМ 4-раствором хлорида натрия NaH 2 PO с использованием 5, 50 и 500 мМ запасов, соответственно.
- Анализ пелликулой данных:
- Вычислить пленочную гидратацию путем определения разности между зубного налета влажного веса и сухого веса.
- Средние значения всех технических повторах, чтобы получить одно значение для каждого биологического повторности для статистического анализа. Сравните различные процедуры с использованием одностороннего ANOVA с несколькими тест сравнения Тьюки. Различия существенны при р <0,05.
- Нормализация данных в процентах от необработанных контролей и участок средства биологических повторностях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема установки пластины для проверки этилена освобождения от CEPA в SH среде (рН 7) с помощью анализа тройной ответ показан на рисунке 1А - С. Блок-схема , иллюстрирующая протокол пленочную показан на рисунке 2. Темно-выращенный А. thaliana сеянцы проявляют тройной ответ фенотип (короче и толще гипокотиля с преувеличенной апикальной крючка) в присутствии АКК и в присутствии этилена , полученного в результате разложения ЗООСК на SH среде (рН 7), но не при нелеченных условиях (Рисунок 3А) 9. Длина гипокотиль ACC- и CEPA-производного этилена обрабатывали А. Семена thaliana были значительно (р <0,0001) короче , чем необработанных контрольных (рис 3B) 9, подтверждая , что этилен выпустили из CEPA на SH среде (рН 7) в физиологически соответствующем Concentraции. Значение рН необработанной и обработанной СЕРА-K. xylinus культуры оставались выше 5 (Рисунок 4) 9; поэтому разложение СЕРА в этилен не нарушалась из-за бактериальной продукции органической кислоты. CEPA происхождения этилена увеличился бактериальной целлюлозы производства , когда К. xylinus выращивали на твердой среде SH (рН 7) (Рисунок 5) 9. Все концентрации СЕРА-производного этилена значительно снизилась пленочную влажного веса (рис 6А), не влияет на пленочную толщину (рис 6б) и значительно увеличился пленочную сухой массы (выход целлюлозы; Рисунок 6C) 9. Представитель снимок , сделанный для измерения толщины пелликула показана на рисунке 7. Гидратация относительно пленки была уменьшена на всех концентрациях СЕРА-производного этилена (Фиг.8А) 9, в то время как все концентрации СЕРА производных этилена 9 увеличилась PELlicle кристалличности (фиг.8В). Эффекты NaCl и NaH 2 PO 4 , были незначительными во всех случаях (данные не показаны) , подтверждающие , что наблюдаемые фенотипы были вызваны СЕРА-производного этилена.
Рисунок 3: CEPA разлагается при SH среде (рН 7) для получения этилена Цифровой USB - микроскоп фотографии показывают , что темно-выращенный А.. thaliana рассады отображения тройной фенотип ответа (короткий, толстый гипокотиль гипокотиль и преувеличенные верхушечный крючок) при выращивании в присутствии АКК и CEPA-производного этилена по сравнению с необработанным контролем (A). Длина гипокотиля рассады выращивают в присутствии АКК и СЕРА-производного этилена были significantlY короче , чем необработанным контролем (В). Шкала бар = 1 мм. Столбики ошибок показывают SD (n = 3). Штанги с разными буквами, существенно различаются (р <0,0001). Эта цифра была изменена с Augimeri и ремешок 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: рН K. xylinus культуры остается достаточно высокой для разложения CEPA в SH среде (рН 7). Культура рН остается выше 5, что позволяет эффективно разложения CEPA в этилен в течение всего цикла роста бактерий. РН К. xylinus культуры необходимо контролировать , поскольку они секретируют и резорбции органические кислоты. Легенда показывает концентрации УСППОО протестированы. Обратите внимание, что начинается ось упри рН 5. Отрезки ошибок показывают SD (n = 3). Эта цифра была изменена с Augimeri и ремешок 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: CEPA полученный сополимер этилена увеличивает производство целлюлозы с помощью К. xylinus на твердой среде. К. xylinus выращивали на SH чашки с агаром (рН 7) , которые были необработанными (А), или предварительно обрабатывают подкисленной (рН 2,5) сверхчистой воды (В), фосфат и хлорид (C - E) или CEPA (F - H ). Типичные колонии показаны. Стрелка показывает целлюлозу производства К. xylinus, рассматривается как туманного вещества вокруг колонии. Шкала бар = 0,5 мм. Эта цифра гаы был изменен из Augimeri и ремешок 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: CEPA полученный сополимер этилена снижает водоудерживающей и повышает выход К. xylinus целлюлозы Плёночные. Культуры выращивали статически в SH бульоне (рН 7) , дополненной ЗООСК в 24-луночные планшеты, и инкубировали при 30 ° С в течение 7 дней до Плёночные собирали и анализировали. CEPA полученный сополимер этилена снизился пленочную влажного веса (А), не оказывает никакого влияния на толщину зубного налета (B) и увеличилась зубного налета сухой массы (С). Различные методы лечения CEPA существенно не отличались друг от друга. Столбики ошибок показывают SD (n = 3). Штанги сразные буквы существенно различаются (р <0,05). Эта цифра была изменена с Augimeri и ремешок 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Представитель фотография К. xylinus Плёночные. Толщина зубного налета измеряли с фотографий с помощью программного обеспечения ImageJ. Шкала бар = 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8: СЕРА полученный сополимер этилена уменьшили гидратациюK. xylinus целлюлозы Плёночные путем увеличения пленочную кристалличности. Культуры выращивали статически в SH бульоне (рН 7) в 24-луночные планшеты, и инкубировали при 30 ° С в течение 7 дней до Плёночные собирали и анализировали. Пленка гидратация была рассчитана как разница между пелликулой мокрой и сухой массы. CEPA полученных этилена снижается пленочную гидратацию (А) за счет увеличения зубного налета кристалличности (B). Различные методы лечения CEPA существенно не отличались друг от друга. Столбики ошибок показывают SD (n = 3). Штанги с разными буквами, существенно различаются (р <0,05). Эта цифра была изменена с Augimeri и ремешок 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы , описанные здесь , очертить на месте залегания производства этилена из CEPA для исследования бактериальной реакции этилена с использованием модельного организма, К. xylinus. Этот метод очень полезен в качестве этилен может быть получен путем дополнения любой водной среде, имеющей рН выше 3,5 10,11 с СЕРА устраняет необходимость чистого газообразного этилена или специализированного лабораторного оборудования. Этот метод не ограничивается изучением эффектов CEPA производных этилена на бактерии, но могут быть также приспособлены для изучения реакции этилена в эукариотических организмах. Важно , что эксперименты параллельное управление производится с фосфатом и хлорида , как эти соединения также образуются в результате разложения CEPA на месте. Другой необходимый контроль, чтобы выяснить, оказывает ли сам CEPA прямое влияние на микробных культур, находящихся под следствием. Физиологически несущественные концентрации этилена были получены , когда К. xylinus культуры мывновь выращивали в среде SH рН 5 - и , следовательно , служат в качестве контроля для CEPA эффектов 9; Тем не менее, этот подход работает только для кислых толерантных организмов.
Использование CEPA-производного этилена, необходимого для биологических исследований в водной среде роста требует проверки, что этилен действительно вырабатываться в рамках системы. Описанный здесь метод использует A. thaliana анализ тройной ответ , который использует тройной фенотип отклика , демонстрируемое темно выращенных саженцев в присутствии этилена 1. Чашки Петри разделены на четыре квадранта позволяют рассаду выращивать в среде МС отдельно, но рядом с соответствующей микробной среды роста. Применение раствора CEPA на микробной среды роста облегчает производство этилена и выставляет соседние сеянцы экзогенного источника этилена, как он проникает в свободное пространство. Дополняющий среду MS с ACC обеспечивает положительный контроль, поскольку это повышает эндогенный продуктион этилена А. thaliana и последующее индуцирование тройного фенотипа ответа.
Культура рН является еще одним важным фактором при производстве этилена из CEPA в микробной среде роста 13,14. SH среда обычно используется для культуры К. xylinus имеет рН около 5 , что существенно уменьшает производство СЕРА-производного этилена (Augimeri и ремень, неопубликованные данные); Поэтому, среду доводили до рН 7 9. Это согласуется с результатами других исследований , которые показали , что скорость распада CEPA крайне медленно на уровне или ниже рН 5, в то время как оно значительно усиливается при рН 7 13. Поэтому крайне важно , чтобы гарантировать , что среда роста тест - организма остается выше рН 5. K. xylinus культуры достигли минимального рН около 5,5, что позволяет эволюции этилена 9. Важно отметить, что абсолютная концентрация этилена не может управляться в соответствии с этими культуры Conditions.
Эффект CEPA производных этилена на рост, производство целлюлозы и свойства К. пленкой xylinus был использован для иллюстрации того, что бактериальные реакции этилена могут быть изучены с помощью CEPA. Адаптация этих методов для изучения реакции этилена в других организмах так просто, как изменение среды роста и фенотип анализов. Использование ЗООСК предоставляет исследователям с удобной замены газа этилена и может способствовать более этилен-опосредованного исследования в области бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
- Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
- Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
- Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
- Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
- Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
- Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
- Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
- Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
- Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
- Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
- Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
- Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I.
