Introduction
L'éthylène oléfine (C 2 H 4) a d' abord été découvert comme une hormone végétale en 1901 quand il a été observé que les semis de pois, cultivés dans un laboratoire qui utilise des lampes à gaz de charbon, présentaient une morphologie anormale dans laquelle les tiges (hypocotyles) étaient plus courtes, plus épais et courbé latéralement par rapport aux semis de pois normaux; un phénotype appelé plus tard , le 1,2 triple réponse. Des études ultérieures ont démontré que l' éthylène est une phytohormone vitale qui régule de nombreux processus de développement tels que la croissance, la réponse au stress, la maturation des fruits et de la sénescence 3. Arabidopsis thaliana, un organisme modèle pour la recherche en biologie végétale, a été bien étudiée en ce qui concerne sa réponse à l' éthylène. Mutants de réponse Plusieurs d'éthylène ont été isolés en exploitant le phénotype triple réponse observée dans l' obscurité-adulte A. semis thaliana en présence d'éthylène 1,4,5. Le précurseur biosynthétique pour la production d'éthylène dans les plantes est 1-aacide minocyclopropane carboxylique (ACC) 6 et est couramment utilisé pour le dosage de la triple réponse pour augmenter la production endogène d'éthylène qui conduit à la triple réponse 1,4,5 phénotype.
Bien que la réponse à l'éthylène est largement étudié dans les plantes, l'effet de l'éthylène exogène sur les bactéries est largement sous-étudiée en dépit de l'étroite association de bactéries avec des plantes. Une étude a rapporté que certaines souches de Pseudomonas peuvent survivre à l' aide d' éthylène en tant que source unique de carbone et d' énergie 7. Cependant, seules deux études ont démontré que les bactéries réagissent à l'éthylène. La première étude a montré que les souches de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida et P. syringae étaient chimiotactique envers l' éthylène en utilisant un essai de bouchon d' agarose dans lequel l' agarose fondu a été mélangé avec un tampon de chimiotaxie éthylène pur équilibrée avec du gaz 8. Cependant, à notre connaissance, il n'y a pas eu de further rapports en utilisant de l'éthylène gazeux pur pour caractériser la réponse d'éthylène bactérienne, probablement en raison de la difficulté de manipulation des gaz dans le laboratoire sans matériel spécialisé. Le deuxième rapport de la réponse à l'éthylène bactérienne a démontré que l' éthylène a augmenté la production de cellulose bactérienne et l' expression des gènes influencés dans la bactérie de fruits associée, Komagataeibacter (anciennement Gluconacetobacter) xylinus 9. Dans ce cas, le composé libérant de l' éthylène, l' acide 2-chloréthylphosphonique (CEPA) a été utilisé pour produire de l' éthylène in situ dans le milieu de croissance bactérienne, en évitant la nécessité d'éthylène gazeux pur ou d'un équipement spécialisé.
LCPE produit de l' éthylène à un rapport 1: 1 molaire pH supérieur à 3,5 10,11 à travers, une réaction de premier ordre catalysée par une base 12-14. La dégradation de la LCPE est positivement corrélée avec le pH et la température 13,14 et les résultats dans la production d'éthylène, le chlorure et le phosphate. CEPA offre aux chercheurs intéressés à étudier les réponses bactériennes à l'éthylène avec une alternative pratique à l'éthylène gazeux.
L'objectif global des protocoles suivants est de fournir une méthode simple et efficace pour étudier la réponse d'éthylène bactérienne et comprend la validation des niveaux physiologiquement pertinents de la production d'éthylène de la LCPE décomposition dans un milieu de croissance bactérienne, l'analyse de la culture pH pour assurer la LCPE décomposition ne soit pas compromise pendant la croissance bactérienne, et l'évaluation de l'effet de l'éthylène sur la morphologie et le phénotype bactérien. Nous démontrons ces protocoles utilisant K. xylinus Toutefois, ces protocoles peut être adapté pour étudier la réponse de l' éthylène dans d' autres bactéries en utilisant le milieu de croissance approprié et analyse le phénotype.
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Protocol
1. Produits chimiques
- Préparer une solution mM CEPA 500 (144,49 g / mol) et une solution comprenant à la fois du NaCl 500 mM (58,44 g / mol) et 500 mM de NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) dans acidifiée (pH 2,5) de l'eau ultra-pure ou HCl 0,1N. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que les solutions sont claires.
- Diluer en série (10x) les solutions 500 mM dans le même solvant pour obtenir 5 mM et des stocks 50 mM.
- Préparer une solution 10 mM de 1-aminocyclopropane-carboxylique (ACC; 101,1 g / mol) dans de l'eau ultra-pure.
- Filtre-stériliser les solutions mères et aliquotes stocker à -20 ° C.
- Filtre-stériliser cellulase. aliquotes Conserver à 4 ° C.
2. Vérification de production d'éthylène de 2-chloroéthylphosphonique Acid Décomposition: Assay Triple Response
- Surface-stériliser Arabidopsis thaliana Seeds Ecotype Columbia Utilisation de la vapeur en phase Méthode:
ATTENTION: L'étape suivante produit toxic chlore gazeux. Effectuer la stérilisation des semences dans une hotte.- Procurez-vous un contenant hermétique assez profond pour accueillir un bécher en verre de 250 ml pour la stérilisation des semences et le placer dans une hotte.
- Ajouter A. thaliana graines à un tube à centrifuger et placer le tube dans un rack. Placer la grille contenant le tube ouvert dans le récipient hermétique.
Note: Ne pas remplir des tubes individuels plus de la moitié plein pour permettre au gaz de chlore de pénétrer les graines inférieures. - Placez un bécher de 250 ml contenant 100 ml d'eau de Javel commerciale dans le récipient hermétique. ajouter avec précaution 3 ml d'HCl concentré à l'eau de Javel et sceller immédiatement le récipient avec son couvercle.
ATTENTION: Bleach et HCl réagissent pour produire du chlore gazeux toxique qui agit à la surface-stériliser les graines. - Incuber les graines en présence de chlore gazeux pendant 4 heures dans la hotte.
Remarque: plus longs temps de stérilisation réduisent l'efficacité de la germination. - Après stérilisation, laisser le cgaz hlorine pour évacuer dans la hotte pendant au moins 1 h puis sceller le tube de microcentrifugation. Laissez l'eau de Javel et le mélange HCl dans la hotte pendant au moins 24 heures avant de les jeter.
Remarque: les graines stérilisées peuvent être conservés à température ambiante pour une utilisation immédiate. - Gardez les graines à 4 ° C pour le stockage à long terme. Apportez des graines à la température ambiante avant d'ouvrir le tube de microcentrifugation pour éviter la condensation. graines de magasin dans l'obscurité.
- Préparer des plaques d'agar dans 4-secteur des boîtes de Pétri (90 x 15 mm):
- Préparer 110 ml de milieu de croissance pour A. thaliana plants: 1x Murashige et Skoog (MS) d' un milieu de base 15 (4,33 g / L) contenant 1% (p / v) de saccharose et 0,8% (p / v) d' agar - agar. Ajuster le milieu MS à pH 6 avec NaOH.
- Préparer 100 ml de milieu de croissance bactérienne pour la décomposition CEPA: Schramm et Hestrin (SH) milieu 16 contenant 1,5% (p / v) d' agar - agar. Ajuster le milieu SH à un pH de 7 avec NaOH.
- Stériliser médias par autoclavage et Temper dans un bain d'eau C 55 °.
- Une fois que la gélose MS a trempé, ajouter 40 ml dans un flacon stérile. Pour préparer le milieu de croissance témoin positif pour R. thaliana semis, complètent les 40 ml aliquote de gélose MS avec 40 pl de mM ACC 10 pour obtenir une concentration finale de 10 uM ACC.
- Ajouter 5 ml de milieu aux quadrants appropriés des plats sectorisées Petri (figure 1) et laisser la gélose se solidifier. Préparer toutes les plaques en trois exemplaires.
Remarque: la LCPE ne sont pas ajoutés au milieu de croissance jusqu'à ce que plus tard dans le protocole.
Figure 1:. Mise en place de plaques d' agar utilisés pour le dosage de la triple réponse à la LCPE Un schéma illustre les quadrants spécifiques pour le contrôle négatif (A), le contrôle positif (B), et les plaques expérimentales (C). Ce chiffre a été modifié depuis Augimeri et Strap 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Stratify A. thaliana Seeds pour assurer Germination synchrone:
- Ajouter environ cinquante A. thaliana graines sur chaque quadrant contenant de la gélose MS ou MS + ACC. Veiller à graines sont réparties uniformément pour faciliter le retrait et l'analyse des semis.
- Incuber les plaques contenant des graines dans l'obscurité à 4 ° C pendant 3-4 jours.
- Décomposer LCPE sur Milieu de croissance bactérienne (SH) et effectuer Triple Response Assay:
- Après stratification, exposer les graines à la lumière fluorescente pendant 2 heures.
- Étaler 10 pi de la LCPE mM solution mère 500 sur les quadrants des plaques expérimentales contenant de la gélose SH (pH 7; Figure 1) pour obtenir une concentration finale de la LCPEde 1 mM.
- Sceller les plaques avec un film de laboratoire et couvrir de papier pour créer un environnement sombre pour les graines.
- Germer des graines par incubation des plaques dans l'obscurité à 23 ° C pendant 3 jours avec le côté agar vers le bas.
Remarque: Les plaques peuvent être empilés, mais les contrôles négatifs doivent être placés sur le fond depuis l'éthylène est plus léger que l'air.
- Analyser Triple Response Assay données:
- Avec des pinces de flamme stérilisée, retirer les semis simples à partir d'une plaque correspondant à chaque traitement et vue sous une dissection ou d'un microscope numérique USB. Assurer le fond des plants sont alignés et photographie.
- Retirer 30 plants de chaque quadrant (60 plants par répétition biologique et 180 plants par traitement). Aligner sur une surface avec un fond noir et la photographie avec une règle.
- Mesurer la longueur de l' hypocotyle (mm) de plants répliqués en utilisant le logiciel ImageJ 17. Réglez l'échelle en cliquant et en faisant glisser le * Droit *Outil pour sélectionner une longueur de 10 mm. Sélectionnez "Scale Set" sous l'onglet "Analyser" et régler la distance connue à 10. Utilisation de l'outil * segmenté *, cliquez et faites glisser pour sélectionner la longueur de l'hypocotyle et appuyez sur M pour mesurer la distance. Comparez les moyens de répétitions biologiques à l'aide d'une ANOVA à une voie avec un test de comparaison multiple de Tukey. Les différences sont considérées comme significatives si p <0,05.
3. Analyse du pH tout au long de la croissance bactérienne
- Cultivez et Quantifier Komagataeibacter Cultures xylinus Starter en Triplicate:
- Inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. Incuber les cultures à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu'à ce qu'une DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h).
- Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). 5 ml stérile à 0,85% (p / v) de NaCll de solution, se laver les cellules deux fois et remettre en suspension le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
- Quantifier cellules à l'aide d'une chambre de comptage de Petroff-Hausser.
- Inoculer des cultures pour l'analyse du pH:
- Ajouter 150 ml de bouillon SH (pH 7), additionné de 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration à douze flacons de 500 ml avec des opercules. Inoculer flacons avec K. xylinus cultures starter à une concentration de 10 5 cellules / ml. En utilisant les trois cultures de départ, préparer trois répétitions biologiques par traitement.
- cultures Supplément avec 300 pi des solutions de stock mM CESP 5, 50, ou 500 pour obtenir des concentrations finales de CESP de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Compléter les cultures témoins non traitées avec 300 ul de solvant utilisé pour dissoudre CEPA.
- Sceller les fioles en collant étroitement les opercules des flacons et incuber les cultures pendant 14 jours à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute.
- Chaque jour, asépticaretirer lly échantillons de 5 ml de chacune des cellules du ballon et de granulés par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Transfert surnageants dans un tube propre et mesurer le pH de chaque répétition biologique en utilisant un pH-mètre.
- Analyser les données temps-cours en traçant le pH moyen des répétitions biologiques.
Remarque: il est important que le pH de la culture ne tombe pas au-dessous de 3,5; un pH de culture de 5 réduit de manière significative l'éthylène libération de la LCPE, et un pH inférieur à 3,5 inhibe complètement l'éthylène libération. - Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH 2 PO 4 en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement.
4. Colony Morphologie
- Cultivez K. Cultures xylinus Démarreur à Triplicate:
- Inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. incubales cultures TE à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu'à une DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h).
- Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Avec 5 ml de solution saline stérile, laver les cellules, puis remettre en suspension le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
- 24 préparer des plaques d'agar contenant 25 ml de SH (pH 7) avec des moyennes de 1,5% (p / v) d'agar.
- Une fois que solidification de la gélose, étaler 50 pi de 5, 50, et 500 mM de CESP solutions mères sur l'agar pour obtenir des concentrations finales de CESP de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Mettre en place des plaques témoins non traités et de solvants, qui consistent en aucune modification et d'étalement de 50 ul du solvant utilisé pour dissoudre les composés d'essai.
- Plaques Streak pour des colonies isolées avec une boucle complète (~ 5 pi) de K. culture starter xylinus et les sceller avec un film de paraffine. Inoculer toutes les plaques en triple. Incuber les plaques pendant cinq jours à 30 ° C.
- Photcolonies de ographie à un grossissement de 20x en utilisant un microscope numérique USB et d'évaluer qualitativement coloniale morphologie et la production de cellulose sur un milieu solide.
Remarque: La cellulose se présente comme une substance trouble le long du bord de la colonie. - Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH 2 PO 4 en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement.
5. Essais des pellicules
- Cultivez et Quantifier K. Cultures xylinus Démarreur à Triplicate:
- En trois exemplaires, inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. Incuber les cultures à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu'à ce qu'une DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h).
- Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Avec 5 ml de solution saline stérile, laver tcellules il deux fois et remettre le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
- Quantifier cellules à l'aide d'une chambre de comptage de Petroff-Hausser.
- Préparer Maître Mixes pour inoculer 24 puits Plaques:
- Supplément 60 ml de milieu SH (pH 7) avec 120 pi du 5, 50, et 500 actions mM de CESP pour obtenir des concentrations finales de la LCPE de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Compléter un autre 60 ml de milieu SH (pH 7) avec 120 ul de solvant utilisé pour dissoudre CEPA. Vortex pour mélanger.
- Divisez par 60 ml de la LCPE milieu contenant en quatre 14 ml aliquotes. Inoculer trois des 14 ml aliquotes avec répétitions biologiques de culture de départ à une concentration de 10 5 cellules / ml. Garder les tubes avec des cellules sur la glace pour empêcher la production de cellulose.
Remarque: Le restant 14 ml aliquote sera utilisé pour les puits témoins stériles.
- Inoculer Plaques 24 puits:
- Testez chaque traitement dans sa propre assiette avec trois rangées de répétitions et biologiquesune rangée de témoins stériles (Figure 2).
Figure 2:. Flow-diagramme illustrant le protocole utilisé pour le dosage de la pellicule et de l' analyse Stock LCPE supplémenté milieu SH pH 7 (60 ml) est aliquoté pour trois inoculations réplicats biologiques distincts et un contrôle stérile (14 ml chacun). Ces cultures sont ensuite aliquotées en six répétitions techniques (2 ml) dans une plaque de 24 puits, puis scellés avec un film de paraffine. Après incubation pendant 7 jours à 30 ° C, pellicules sont récoltées et caractérisées par la détermination du poids humide, l' épaisseur, le poids sec, et la cristallinité par FT-IR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure
- Utilisation du mélange maître de 14 ml, ajouter 2 ml dans each de six puits d'une plaque de 24 puits stérile. Remplissez les trois répétitions biologiques et le contrôle stérile (Figure 2). Répétez l'opération pour chaque traitement.
- plaques d'étanchéité avec un film de paraffine et incuber statiquement pendant 7 jours à 30 ° C.
- Récolte et mesure Pellicle poids humide, épaisseur, poids sec (Cellulose Yield) et Cristallinité (figure 2):
- Enfoncer un côté de la pellicule pour élever le bord de la pellicule adverse et enlever les pellicules individuelles avec une pince. Tout en conservant l'adhérence, placez-les sur du papier absorbant frais pour 3 sec pour éliminer le milieu excès avant la pesée pour déterminer leurs poids humides.
- Alignez pellicules adjacentes à une règle et une photographie du côté à l'aide d'un appareil photo numérique haute résolution.
- En utilisant le logiciel ImageJ 17, mesurer l' épaisseur de la pellicule sur l'épaule gauche, l' épaule droite et au centre de chaque pellicule. En moyenne toutes les répétitions techniques pour chaque Replicat biologiquee.
- transférer individuellement les pellicules dans les puits d'une plaque à 6 puits. Traiter les pellicules avec 12 ml de NaOH 0,1 N à 80 ° C pendant 20 minutes pour lyser les cellules.
- Retirez le NaOH et neutraliser les pellicules en lavant avec de l'eau ultra-pure pendant 24 heures avec agitation. Changez l'eau toutes les 6 heures.
Remarque: Les pellicules doivent être blancs à l'issue de l'étape de lavage. - La place sur tapis pellicules de silicium et sèche à 50 ° C pendant 48 heures à poids constant. Une fois sec, retirer du tapis et de mesurer le poids des pelliculaires sur une échelle analytique pour déterminer le rendement de cellulose bactérienne.
- Analyser pelliculaire cristallinité à l' aide de transformée de Fourier par spectroscopie infrarouge (FT-IR) en utilisant 32 balayages et une résolution de 4 cm -1 dans la plage de 4000 à 650 cm -1. Calculer l'indice de cristallinité, CI (IR), en utilisant A 1437 / A 895; le rapport d'absorbance de la bande "cristallin" et "amorphe bande" 18 comme décrit précédemment.
- Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH 2 PO 4 en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement.
- Analyser Pellicle données:
- Calculer pelliculaire hydratation en déterminant la différence entre le poids humide de la pellicule et le poids sec.
- La moyenne des valeurs de toutes les répétitions techniques pour obtenir une valeur unique pour chaque répétition biologique pour l'analyse statistique. Comparez les traitements à l'aide d'une ANOVA à une voie avec un test de comparaison multiple de Tukey. Les différences sont significatives si p <0,05.
- Normaliser les données que le pour cent des témoins non traités et tracer les moyens de réplicats biologiques.
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Representative Results
Une configuration de plaque schématique pour la vérification de l' éthylène libération de la LCPE dans un milieu SH (pH 7) par le test de triple réponse est représentée sur la figure 1A - C. Un organigramme illustrant le protocole pelliculaire est représenté dans la figure 2. Dark-adulte A. thaliana plants présentent le phénotype de réponse triple (hypocotyle court et plus épais avec un crochet apicale exagéré) en présence de CPA et en présence d'éthylène produit par la décomposition de CEPA sur du milieu SH (pH 7), mais pas dans des conditions non traitées (Figure 3A) 9. La longueur de l' hypocotyle de ACC- et de la LCPE dérivés d' éthylène traité A. graines de thaliana étaient significativement (p <0,0001) plus courte que les témoins non traités (figure 3B) 9, confirmant que l' éthylène a été libéré de la LCPE sur un milieu SH (pH 7) à une concentration physiologiquement pertinentetion. Le pH non traité et de la LCPE traité K. cultures de xylinus sont restés supérieurs à 5 (Figure 4) 9; par conséquent, la LCPE décomposition en éthylène n'a pas été altérée en raison de la production biologique bactérienne d'acide. Éthylène dérivé de la LCPE a augmenté la production de cellulose bactérienne lorsque K. xylinus a été cultivée sur du milieu SH solide (pH = 7) (Figure 5) 9. Toutes les concentrations d'éthylène dérivé de la LCPE ont diminué de manière significative le poids humide de la pellicule (figure 6A), n'a pas d' incidence sur l' épaisseur pelliculaire (figure 6B) et a considérablement augmenté pelliculaire poids sec (rendement de cellulose; Figure 6C) 9. Une photo représentant pris pour la mesure de l' épaisseur de la pellicule est représentée sur la figure 7. Pellicle hydratation a été réduite de toutes les concentrations d'éthylène CEPA dérivé (figure 8A) 9, alors que toutes les concentrations de l' éthylène dérivé CEPA 9 augmenté pelcristallinité licle (figure 8B). Les effets du NaCl et du NaH 2 PO 4 étaient insignifiantes dans tous les cas (données non présentées) , confirmant que les phénotypes observés étaient dus à l' éthylène CEPA dérivé.
Figure 3: la LCPE se décompose en milieu SH (pH 7) pour produire de l' éthylène photographies au microscope USB numérique montrent que foncé adulte A.. thaliana plants affichent le phénotype de réponse triple (hypocotyle plus courte, hypocotyle plus épais et exagérées crochet apical) lorsqu'elles sont cultivées en présence d'ACC et de l' éthylène LCPE dérivée par rapport au témoin non traité (A). La longueur de l'hypocotyle de plants cultivés en présence d'ACC et de l'éthylène LCPE dérivés étaient significantly plus court que le témoin non traité (B). Barre d'échelle = 1 mm. Les barres d'erreur indiquent SD (n = 3). Les barres avec des lettres différentes sont significativement différentes (p <0,0001). Ce chiffre a été modifié depuis Augimeri et Strap 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Le pH de K. xylinus cultures reste suffisamment élevée pour que la décomposition CEPA en milieu SH (pH 7). Le pH de la culture reste supérieure à 5, ce qui permet une décomposition efficace de l' éthylène en CEPA tout au long du cycle de croissance bactérienne. Le pH de K. cultures de xylinus doivent être surveillés car ils sécrètent et résorbent les acides organiques. La légende montre les concentrations de CESP testées. A noter que l'axe Y commenceà un pH de 5. Les barres d'erreur indiquent SD (n = 3). Ce chiffre a été modifié depuis Augimeri et Strap 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: l' éthylène dérivé de la LCPE augmente la production de cellulose par K. xylinus sur un support solide. K. xylinus a été cultivée sur des plaques de gélose SH (pH 7) qui étaient non traitées (A), ou pré-traitée avec acidifiée (pH 2,5) , de l' eau ultra-pure (B), du phosphate et du chlorure de (C - E) ou CEPA (F - H ). colonies représentatives sont indiquées. La flèche indique la cellulose produite par K. xylinus, considéré comme la substance brumeux autour de la colonie. Barre d'échelle = 0,5 mm. Ce chiffre has été modifié à partir de Augimeri et Strap 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: éthylène LCPE dérivés diminue la capacité de rétention d' eau et augmente le rendement de K. xylinus pellicules de cellulose. Les cultures ont été cultivées dans du bouillon statiquement SH (pH 7) , additionné de CEPA dans des plaques à 24 puits, et incubées à 30 ° C pendant 7 jours avant la récolte et les pellicules ont été analysées. Éthylène dérivé de la LCPE diminution du poids humide de la pellicule (A), n'a eu aucun effet sur l' épaisseur de la pellicule (B) et l' augmentation de la pellicule poids sec (C). Les différents traitements CEPA ne sont pas significativement différents les uns des autres. Les barres d'erreur indiquent SD (n = 3). Bars avecdes lettres différentes sont significativement différentes (p <0,05). Ce chiffre a été modifié depuis Augimeri et Strap 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: photographie représentant de K. pellicules de xylinus. épaisseur de Pellicle a été mesurée à partir de photographies en utilisant le logiciel ImageJ. Barre d' échelle = 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: l' éthylène dérivé de la LCPE réduit l'hydratationLes pellicules cellulosiques K. pelliculaire en augmentant la cristallinité. Les cultures ont été cultivées dans du bouillon statiquement SH (pH 7) dans des plaques à 24 puits, et incubées à 30 ° C pendant 7 jours avant la récolte et les pellicules ont été analysées. Pellicle hydratation a été calculé comme la différence entre la pellicule humide et le poids sec. CEPA dérivé d' éthylène réduit pelliculaire hydratation (A) en augmentant la cristallinité de la pellicule (B). Les différents traitements CEPA ne sont pas significativement différents les uns des autres. Les barres d'erreur indiquent SD (n = 3). Les barres avec des lettres différentes sont significativement différentes (p <0,05). Ce chiffre a été modifié depuis Augimeri et Strap 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les méthodes décrites ici décrivent la production in situ de l' éthylène à partir CEPA pour l'étude de la réponse à l'éthylène bactérien en utilisant l'organisme modèle, K. xylinus. Cette méthode est très utile que l' éthylène peut être produit en complétant tout milieu aqueux qui présente un pH supérieur à 3,5 à 10,11 CEPA niant la nécessité d'éthylène gazeux pur ou de l' équipement de laboratoire spécialisé. Ce procédé ne se limite pas à l'étude des effets de l'éthylène CEPA dérivées des bactéries, mais peut également être adapté pour étudier la réponse de l'éthylène dans les organismes eucaryotes. Il est important que les expériences de contrôle en parallèle être réalisées avec du phosphate et du chlorure , car ces composés sont également fabriqués à partir CEPA décomposition in situ. Un autre contrôle nécessaire est de vérifier si la LCPE exerce un effet direct sur les cultures microbiennes sous enquête. Physiologiquement concentrations d'éthylène non pertinentes ont été produites lorsque K. xylinus cultures nousre cultivées dans un milieu pH 5 SH et donc servir de contrôle pour les effets de la LCPE 9; Cependant, cette approche ne fonctionne que pour les organismes tolérantes acides.
L'utilisation d'éthylène CEPA dérivées pour des études biologiques dans un milieu de croissance aqueux soumis à la vérification que l'éthylène est en effet produite dans le système. Le procédé décrit ici utilise A. thaliana test de triple réponse qui exploite le phénotype triple réponse présentée par semis foncé cultivé en présence d'éthylène 1. des boîtes de Petri divisé en quatre quadrants permettent aux plants d'être cultivées dans un milieu MS séparément, mais à proximité immédiate du milieu de croissance microbienne correspondant. Application d'une solution CEPA sur le milieu de croissance microbienne facilite la production d'éthylène et expose les plants adjacents à une source exogène d'éthylène tel qu'il infiltre dans l'espace de tête. Complétant le milieu avec ACC MS fournit un contrôle positif car il améliore le produit endogèneion d'éthylène par A. thaliana et l' induction subséquente du phénotype de la réponse triple.
Culture pH est un autre facteur important lors de la production d' éthylène de la LCPE dans un milieu de croissance microbienne 13,14. Le milieu SH généralement utilisé pour la culture K. xylinus a un pH d'environ 5 ce qui réduit sensiblement la production d'éthylène dérivé de la LCPE (Augimeri et Strap, données non publiées); par conséquent, le milieu a été ajusté à pH 7 9. Ceci est cohérent avec d' autres études qui ont démontré que le taux de décomposition de la LCPE est extrêmement lent à ou en dessous de pH 5, alors qu'il est grandement améliorée à pH 7 13. Il est donc essentiel d'assurer que le milieu de l'organisme d'essai de croissance reste un pH supérieur à 5. K. cultures xylinus atteint un pH minimum d'environ 5,5, permettant une évolution de l' éthylène 9. Il est important de noter que la concentration absolue d'éthylène ne peut pas être contrôlé par ces derniers de la culture conditions.
L'effet de l' éthylène de la LCPE dérivés sur la croissance, la production de cellulose, et les propriétés pelliculaires de K. xylinus a été utilisé pour illustrer le fait que les réponses d'éthylène bactériennes pourraient être examinés à l' aide de la LCPE. L'adaptation de ces méthodes pour étudier la réponse de l'éthylène dans d'autres organismes est aussi simple que de changer le milieu de croissance et des analyses phénotypique. L'utilisation de la LCPE fournit aux chercheurs un substitut commode pour le gaz d'éthylène et peut encourager d'autres études d'éthylène médiée par des bactéries.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
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