Introduction
Onlar yolları 1-4 sinyal kablolarını deşifre etmek için kullanılabilir, çünkü optogenetic araçlar kısmen, popülerlik kazanmaktadır. Işıkla aydınlatıldığında, kendi yapısını ve bağlanma afinitesini değiştirme fotoaktıfleştırılebılır proteinlerin yeteneğine dayanmaktadır. Sinyalizasyon elemanları bu proteinlerin kaynaştırarak karmaşık hücre içi sinyal yollarının 5-12 içinde tek bir oyuncunun belirli düzenlenmesi için izin verir. Sonuç olarak, bir sinyal yolu yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile ele alınabilir.
Çoğu hücre bazlı Optogenetic çalışmalarda biyokimyasal analiz 11,12 ardından ışık varlığında kültürlenmesi ile birlikte mikroskopi dayalı yöntemler kullanmaktadır. Bunun aksine, akış sitometresi kılcal boyunca hücrelerin singularizes ve hücre boyutu, boyutu ve floresan yoğunlukları ölçülür. Bu yöntem thousan analiz yeteneği dahil olmak üzere mikroskopi veya biyokimyasal yöntemlerle üzerinde önemli avantajlara sahiptirÇok kısa bir süre içinde tek hücreli çözünürlükte yaşayan hücrelerin DS. Bu nedenle, akış sitometrisi ile optogenetics birleştirilmesi arzu edilir.
Bildiğimiz kadarıyla, optogenetic flow sitometri için kurulan protokol yoktur. Bir yaygın olarak kabul prosedür el feneri cihazları ile reaksiyon tüpü dışından hücreleri aydınlatmaktır. Bununla birlikte, akış kılavuzu aydınlatma sitometresi canlı hücre görüntüleme, bir silindirik, ısıtılmış su odası, reaksiyon borusu içinden geçen ve ışık gerektirir. Bu önemli bir ışık saçılması ve ışık kaybına neden olur. Ayrıca, manuel aydınlatma tarafından sağlanan ışık yoğunluğu (vb açı, mesafe,) deneyler arasında tekrarlanabilir değildir ve bir deneyde dalga boylarının sayısı için pratik bir sınır yoktur.
LED Thermo Akış cihazı inşa ederek, bu sınırlamaları aşmak için başardık. Bu cihaz sayesinde, hücreler, bir sıcaklığı belirli dalga boyları ile aydınlatılabilirkısa süreli olarak kontrol edilen akış sitometrik ölçümleri sırasında bir şekilde. Bu mesafede olan ve deneyler arasında ışık hassas ve tekrarlanabilir miktarda sağlar.
In vivo olarak, bizim cihazın kullanılmasını göstermek için, photoswitching sırasında Ramos B hücrelerinde Dronpa floresan sinyali kaydedilmiştir. Ramos B hücreleri, bir insan Burkitt lenfoma türetilir. Dronpa bir monomer, dimer ya da tetramer olarak var olan bir fluoresan proteindir. monomerik formda, bu ışıltısızdır. 400 nm ışık ile aydınlatma dimerizasyonu ve tetramerizasyonu uyarır ve Dronpa protein floresan vermektedir. Bu süreç, 500 nm ışık ile aydınlatma ile ters olabilir. Dronpa protein proteinler 4,13 sinyal fonksiyonu ve yerini kontrol etmek için kullanılmaktadır.
Burada, bir akış sitometresinde Dronpa arasında photoswitching çalışma Ramos B hücrelerinde Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa proteini ifade etmiştir. Bizim cihaz kullanarak, başardık verimli vegerçek zamanlı olarak floresan yoğunluğu kayıt sırasında tekrarlanabilir Dronpa photoswitch. Bu yöntem, manuel aydınlatma ile mevcut aydınlatma protokolleri üzerinden önemli avantajlar sağlamaktadır ve önemli ölçüde optogenetic araçları ve kafes bileşikleri için deneysel repertuarı genişletir. önemli ölçüde basitleştirmek ve yeni Optogenetic araçlarının keşif ve gelişimini hızlandıracak bizim aygıtının kullanılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tasarımı ve Aygıtı Bina
- Pilot Deneyler
NOT: Belirli bir optogenetic aracı ve hücre tipi için gerekli olan ışık yoğunluğu önemli ölçüde değişebilir. prototip Pilot deneyler gerekli minimum ışık yoğunluğunu tahmin etmek yararlıdır. Aşağıdaki deneyler için kullanılan Optogenetic aracı Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa füzyon konstruktu olup. Dronpa dizisi ticari (Malzeme Listesi) elde edildi. Uzun bir bağlayıcı ifade yapısı, molekül-içi (ve moleküller arası) dimerlerinin oluşturulması için izin vermek için iki Dronpa diziler arasında klonlandı. aşağıda tarif edilen kademeler bir çok Optogenetic araçları veya optik olarak kontrol edilen maddelere adapte edilebilir.- ambalaj hücrelerden retroviral-ihtiva eden üst sıvıyı kullanarak transdüksiyonu için üreticinin talimatlarına göre bir Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa ihtiva eden bir yapı Ramos B lenfositleri transdüksiyonu. Bir ön göre Hasat ve sayım hücreleribir önce protokolü 13 yayınladı.
- Bir konsantrasyonda yeniden süspanse hücreler 1 x 10 6 orta / ml (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin, 50 uM 2-merkaptoetanol) ve bir cam tüp FACS aktarabilirsiniz.
- Bir akış sitometresinde içine tüp takın ve Dronpa (GFP kanal) 14,15 floresan yoğunluğu ölçmek.
- muhtemelen zararlı dalga boylarında gözleri korumak için diğer tüm adımlar için koruyucu gözlük kullanın.
- El ile borunun dış 500 nm LED ışık yerleştirin ve Dronpa floresans yoğunluğunu ölçülmesi devam edin.
- Dronpa floresan yoğunluğu azalır kadar LED ışıklar sayısı ve / veya yoğunluğunu arttırmak.
- El ile borunun dış 400 nm LED ışık yerleştirin ve Dronpa floresans yoğunluğunu ölçülmesi devam edin.
- Dronpa fluo kadar LED ışıklar sayısı ve / veya yoğunluğunu arttırmakyoğunluk artar rescence.
- adımlar 1.1.5 ve 1.1.7 de photoswitching gerekli olduğu tahmin olarak cihazı oluşturmak için en az sayıda LED ışıkları kullanın.
- cihazı bina
NOT: Cihaz bir profesyonel işleme dükkanı, Freiburg Üniversitesi'nden Arbeitsgruppe Technik tarafından yaptırılmıştır. Çoğu parça özel yapılmış ve piyasada mevcut değildir. Her bir parçanın tam boyutları, Şekil 1 ve 2 'de gösterilmiştir. Bu cihazın düzeneğinin açıklamak için, Ek Video 1 sağlanır ve en önemli adımlar aşağıda tarif edilmiştir.- Şekil 1A gösterilen kesin ölçümler ile polivinil klorür (PVC) Mill parça A.
- Parça A delinmiş deliklere LED ışıkları yerleştirin ve su sızıntısını önlemek için PVC yapıştırıcı ile her delik mühür.
- Bir çok kanallı trafosuna LED'leri bağlayın (her dalga boyu ayrı Chann işgal etmelidir0-29 mA ayarlanabilir çıkış gücüne sahip el).
- fiziksel hasardan LED korumak için gösterildiği gibi parça A 3 vida ile dış kılıfı (B) takın.
- Parça A delinmiş deliklere tüp klipleri (C) bir su pompası, tutkal cihazı bağlamak mümkün (Şekil 1a tasvir, kesit Y: 9 mm ve 61.5 mm) PVC yapıştırıcı kullanarak.
- Bir 58.5 mm uzunluğunda pleksiglas tüp (D1) kesin.
- Şekil 2'de tasvir edildiği gibi Pleksiglastan adet D2 ve D3 imalatı.
- Pleksiglas yapıştırıcı ile D1 altına Tutkal parçası D3.
- parça D2 bir lastik O-ring takın ve pleksiglas yapıştırıcı ile D1 üstüne tutkal.
NOT: adet D1, D2 ve D3 birlikte parça D formu - 3 vida ile parça A'ya parça D yerleştirin.
- transformatör güç uygulamadan önce su kaçağı cihazı test edin.
2. Bir optogenetic Aracı Kinetiği Ölçme
- RPMI-aracı madde içinde kültür Ramos B hücreleri (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin, 50 uM 2-merkaptoetanol) 3- yoğunluğunda 10 x 10 6 hücre / ml 37 ° C de ve% 5 CO2.
- 350 xg 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile hasat Ramos B hücreleri.
- Üreticinin talimatlarına göre bir Neubauer sayım odası kullanılarak hücrelerin sayısı ve 600 uL ortamında 1-5 x 10 6 hücreleri tekrar süspansiyon.
- Bir cam FACS tüpüne hücreleri aktarmak ölçüme kadar ışıktan buz üzerine koydu ve onları korumak.
- ısıtılmış su pompasına aygıtı bağlayın ve 37 ° C sıcaklığını ayarlamak.
- Cam FACS tüpler kullanırken, sitometresinde bir lastik O-ring ile akış siyah O-ring değişimi ve buna ek olarak silikon gr uygulamakkolaylaştırmak.
- Dikkatle cihazın içine cam FACS tüp takın ve (Şekil 3) akış sitometresi bağlayın.
- ölçümünü başlatmak ve Dronpa floresan yoğunluğu (GFP kanalı) kaydedin.
- sırasıyla 400 nm veya 500 nm ışık ile hücre örneği aydınlatın ve Dronpa floresan (GFP kanalı) kaydedin.
- Yazılımın sitometresi uygun akış ile deneysel verileri analiz edin. yana dağılım ve kapısı canlı hücreler karşı komplo ileri dağılım. zamanla Dronpa floresan çizilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir Akış Sitometre LED Thermo Flow kullanarak
Cihazın bir işlevsel çekirdek ışıkları içe bakan dairesel bir biçimde düzenlenir LED silindirik bir bölme olabilir. Bu bölme ışıklarının sıcaklığı, hem de hücre örneği kontrol edilmesi için izin veren bir su ve pompa bağlanabilir. LED'ler bir transformatör bağlı ve dolayısıyla her dalga boyu için ışık yoğunluğu ayrı ayrı kontrol edilebilir. Cihazın merkezi çoğu standart akış sitometrelerinde bağlanabilir bir standart ölçü FACS tüp, barındırır (Şekil 4 ve 5). Hücrelerin arzu edilmeyen şekilde ısıtılması yol açmaz Cihazımızda bu aydınlatma göstermek için üç farklı dalga boyları için zaman içinde yanar PBS sıcaklığına (Şekil 6) ölçüldü. 360 nm, 400 nm ya da 500 nm ile aydınlatma, sadece yol açarmarjinal sıcaklık artışı. sıcaklık kontrollü hücre örneklerinin tekrarlanabilir aydınlatma bir akış sitometresinde ölçülmüştür edilmesi için genel olarak, burada sunulan cihaz sağlar.
Dronpa bölgesinin Photoswitching
Bir Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa 13,16 füzyon konstruktunu kodlayan bir ifade vektörü klonlanır ve Ramos B hücreleri içerisine transdüse edilmiştir. Şekil 7'de gösterildiği gibi, amaç belirli bir dalga boyunda ışıkla bu füzyon proteininin yapısını kontrol etmek olmuştur. Bizim aygıtı kullanma, sitozolik Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa füzyon proteini (sol, Şekil 8) birden çok kez photoswitched edildi. Parlak devlete geçiş neredeyse anında olur oysa karanlık duruma geçiş, yavaş yavaş ortaya çıkar. karanlıkta Dronpa kendiliğinden floresan kurtarma parlak forma verimli photoswitching özel aydınlatma ve gerektirdiğini gösteriyorSadece yavaş (sağ, Şekil 8) kendiliğinden ortaya çıkar.
Bu photoswitching özelliklerinin kinetik analizi (Şekil 9) gerçekleştirilmiştir. geçiş kinetiği tesisi aydınlatma ilk 4 dakika için hesaplanmıştır. Spontan geri kazanımı için eğimli karanlıkta başlangıç, 4 dakika için hesaplandı.
kinetik analiz Dronpa photoswitching hızı genel olarak çok tekrarlanabilir olduğunu gösterir. Buna karşılık, karanlıkta Dronpa floresan spontan iyileşme çok verimsiz. Hatta karanlıkta daha inkübasyondan sonra, Dronpa floresans sadece yaklaşık% 10 elde edilir. Bu gerçekten bizim cihazda aydınlatma photoswitching uyardığını göstermektedir.
Bu nedenle, tarif edilen yöntem kullanılarak, gerçek zaman üretebilen olabilir, bir akış sitometresinde veri photoswitchingBirçok optogenetic araçlar kinetik değerlendirme çevrilmesi.
Şekil 1: dış tabakanın İnşaat planı. Tüm tasvir parçalar özel polivinil klorür (PVC) yapılır. Adet A: delikli Silindirik PVC parçalı LED ve tüp klipleri eklemek için. Piece B: fiziksel hasardan LED korumak için dış kılıf. Adet C: Su soğutma sağlamak için lastik borular ile iç boşluğu bağlayan tüp klibi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: iç tabakanın İnşaat planı. Tüm tasvir parçalar Pleksiglas yapılır. Adet D: Bu parça, üç adet D1, D2 ve D3 oluşan ve FACS tüpü çevreleyen birim oluşturur. Adet D1: Silindirik pleksiglas tüp. Adet D2: iç tabakanın alt kapağı. Adet D3: iç tabakanın Kapak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: bir akış sitometresinde cihazı kullanma. A1: bir akış sitometresinde örnek girişi; A2: Numune girişine bağlı FACS tüp; B: FACS tüpü çevreleyen cihazı; C: Numune girişi; D: cihaz ile Numune girişi.ove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Cihazın Akışı şematik. C: Hücreler, cihazın aydınlatılmıştır (sol alt) ve aynı zamanda (sol üst) içine alındı ve akış sitometresi analiz. Bu durum, örneğin, izin verir, bir Optogenetic aracı (sağ üstte) kinetik özelliklerinin analizi. B: cihazın kesitidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Cihazın Süreç Akış Şeması. Bir ya da mor Belirli dalga boylarında e LED ışıklar FACS tüp içinde hücre örneği aydınlatmak. LED'ler sürekli hücre örneği istikrarlı sıcaklığını korumak için ısıtılmış banyo sirkülatör ile değiştirilir su ile çevrilidir. Canlı hücre deneyleri için, sıcaklık 37 ° C'ye ayarlanır. Bu sıcaklık kontrollü aydınlatma sırasında, hücreler analiz için akış sitometresinde içine alınır. Bu kurulum, izin verir, örneğin, bir Optogenetic aracı kinetik özelliklerini analiz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: zamanla ışıklı PBS sıcaklığı. Cam FACS tüpü içinde 1 mL PBS 360 nm ışık, 400 nm ışık veya 500 nm ışık ile zamanla aydınlatılmıştır./ 54707 / 54707fig6large.jpg "target =" _ blank "upload> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa proteininin photoswitching Modeli. 400 nm ışık ile aydınlatma dimerize (ve tetramerize) Dronpa ve floresan hale getirecektir. 500 nm ışık aydınlatma monomerik Dronpa ışıltısızdır Dronpa proteinleri, ayrışmasına neden olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8: LED Thermo Flow kullanarak Dronpa photoswitching özelliklerinin karakterizasyonu f ile birlikte Düşük sitometri. X ekseni üstünde belirtilmiştir, ve Dronpa ortalama floresans yoğunluğu (MFI), zaman içinde tasvir edildiği gibi hücreler aydınlatıldı. Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa füzyon proteini cihazı (sol) ile birkaç kez photoswitched edilebilir. Dronpa floresan yoğunluğu spontan iyileşme yavaş ve verimsiz (sağda) oluşur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 9: Dronpa photoswitching kinetik analizi. Dronpa photoswitching kinetiği, ilk 4 dakika için hesaplanmıştır. aydınlatma ve kurtarma ilk 4 dakika için hesaplandı. karanlıkta inkübasyon renkli alanlar ile gösterildiği gibi. Her hesaplama için yamaçlarında kalın sayılar tasvir edilmektedir.ource.jove.com/files/ftp_upload/54707/54707fig9large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LED Thermo Akış bir akış sitometresinin içinde optogenetic araçları incelemek için yenilikçi bir cihazdır.
Şimdiye kadar, optogenetic numuneler sadece mikroskopi lazerler veya el feneri cihazlarla 11,12 ile aydınlatılan edilmiştir. örnek el feneri açısı ve mesafeye bağlı olarak, aydınlatma miktarında önemli değişkenlik deneyler arasında bekleniyor. Ayrıca, tek bir kişi bir deney çalışabilir fenerleri sayısında bir sınır yoktur. Bu deneysel repertuar ve tekrarlanabilirlik kısıtlar. Bu kısıtlamalar, canlı hücrelerde Anlık photoswitching kinetiği karakterize etmek için kullanılabilir kurabilen cihazın geliştirilmesi sırasında ele alınmıştır. Bildiğimiz kadarıyla, hiçbir karşılaştırılabilir bir aygıt yok.
Geçerli yapılandırmada en fazla 30 LED'ler bir Termo Akış odasına inşa edilebilir. Bu durumda, her dalga boyu için gereken ışık yoğunluklarına bağlı olarak, tek bir cihaz, US olabilirOptogenetic araçları geniş bir çeşitliliği için ed. Kurulan photoswitching protokolleri daha sonra fonksiyonel okumalara örneğin, kalsiyum akısı ölçümleri için optimize edilebilir. Bizim Cihaz, kafes bileşikleri veya fotoaktıfleştırılebılır fluorophores gibi optik olarak kontrol edilen maddeler için de uygun olabilir.
Bilimsel soru ve kullanılan numune bağlı olarak, bireyselleştirilmiş protokoller hızla kurulabilir. Bunun yerine polistiren veya polipropilen tüpler, cam tüpler kullanımı 400-500 nm dalga boyu aralığında ışık kaynaklı sitotoksisite sınırlamak için tavsiye edilir. Test edilen tüm hücre hatları, aydınlatma (360 nm, 400 nm veya 500 nm), cam tüpler içinde bir saat için hayatta kaldı. Biz transferi deneyler plastik tüplerde aydınlatma sırasında hücre ölüm nedenini araştırmak için çalıştı. Biz farklı dalga boylarında ışık PBS veya RPMI hücreleri ışıklı ve daha sonra hücre ölümünü ölçmek için ışıksız hücrelere süpernatant transfer. Toplanan hiçbirisüpernatanlar alıcı hücrelere önemli hücre ölümüne neden (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, polistiren veya polipropilen tüpler aydınlatılmış PBS sıcaklık cam tüplerde sıcaklığına hemen hemen aynıdır. Bu nedenle, sadece hücre ölümü nedeni üzerinde spekülasyon olabilir. Işıklı plastik hücreleri için toksik olan bir dalga boyu kararsız bir madde veya radyasyon bırakabilir.
Her bir deney için kullanılan ortamın seçimi önemlidir. tamponlama kapasitesi olarak kabul edilir ve farklı reaktifler, pH göstergelerinin gibi, farklı derecelerde farklı dalga boylarını absorbe edilmelidir. FCS içeren ortama FCS'siz karşılaştırırken Bundan başka, hücre hayatta kalması, örneğin, önemli ölçüde farklıdır.
Işık titrasyon hedefi, maksimum photoswitching için gerekli ışık az miktarda kullanılmasıdır. En deneyler için, photoswitch hızını en üst düzeye çıkarmak ve böylece ışık yoğunluğunu arttırmak için uygundur. Ancak, wavele bağlı olarakngth ve hücre tipi, ışık, aşırı aydınlatma kaçınılmalıdır neden sinyal davranışı üzerinde doğrudan etkileri olabilir.
Bizim cihaz için ışık programlarını programlamak ve diğer ışık cihazları için ortak olduğu gibi bir bilgisayara bağlamak mümkündür. En akış sitometrelerinde çok sayıda farklı laboratuvarlar tarafından paylaşılan ortak iş yerlerinde olduğundan Ancak, mümkün olduğunca küçük ve taşınabilir olarak cihazı korumak için en iyisidir. Ayrıca, burada sunulan bir iki renkli kurulumu için bizim cihazın elle taşıma kadar basit, o programlama sadece marjinal deneysel prosedür artıracak.
Birlikte ele alındığında, biz burada optogenetic araçların gücünü birleştiriyor ve akım sitometri yenilikçi bir cihaz sunuyoruz. Bu esasen in vivo karakterizasyonu ve optogenetic araçların geliştirilmesini kolaylaştırmak ve deneysel repertuarı genişletmek olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12x75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1.5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T.
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L.
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
