Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En murin model af gruppe B Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

Formålet med denne protokol er at efterligne menneskelige gruppe B Streptococcus (GBS) vaginal kolonisering i en musemodel. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge værtsimmunresponser og bakterielle faktorer, der bidrager til GBS vaginal vedholdenhed, samt at teste terapeutiske strategier.

Abstract

Streptococcus agalactiae (gruppe B-Streptococcus, GBS), er en gram-positiv, asymptomatisk kolonisator af fordøjelsessystemet og vagina på 10 - 30% af voksne. I immunsvækkede individer, herunder nyfødte, gravide kvinder og ældre mennesker, kan GBS skifte til en invasiv patogen forårsager sepsis, gigt, lungebetændelse og meningitis. Fordi GBS er en førende bakterielt patogen af ​​nyfødte, er aktuel profylakse består af sene drægtighed screening for GBS vaginal kolonisering og efterfølgende peripartum antibiotisk behandling af GBS-positive mødre. Heavy GBS vaginal byrde er en risikofaktor for både neonatal sygdom og kolonisering. Desværre, lidt er kendt om værten og bakterielle faktorer, der fremmer eller tillader GBS vaginal kolonisering. Denne protokol beskriver en teknik til indførelse vedvarende GBS vaginal kolonisering anvendelse af en enkelt β-østradiol forbehandling og daglig prøvetagning til bestemmelse bakteriel load. It yderligere detaljer metoder til at administrere yderligere behandlinger eller reagenser af interesse og for at indsamle vaginal skyllevæske og reproduktive tarmkanalen væv. Denne musemodel vil fremme forståelsen af ​​GBS-vært interaktion inden for den vaginale miljø, hvilket vil føre til potentielle terapeutiske mål at kontrollere maternal vaginal kolonisering under graviditeten og for at forhindre transmission til sårbare nyfødte. Det vil også være af interesse at øge vores forståelse af generelle bakterielle-vært interaktioner i den kvindelige vagina.

Introduction

Streptococcus agalactiae, gruppe B-Streptococcus (GBS), er en indkapslet, gram-positiv bakterie, som ofte isoleret fra tarmen og urogenitale kanal af raske voksne. I 1970'erne, GBS opstået som den førende agent for smitsomme neonatal dødelighed, med over 7.000 tilfælde af neonatal sygdom årligt 1. Tidlig debut GBS sygdom (EOD) forekommer i de første timer eller dage af livet, opstår som lungebetændelse eller åndedrætsbesvær, og ofte udvikler sig til sepsis, mens sent debuterende sygdom (LOD) ensues efter flere måneder og præsenterer med bakteriæmi, som ofte forskud til meningitis 2. Som af 2002, Centers for Disease Control og Forebyggelse anbefaler universel screening for GBS vaginal kolonisering i slutningen drægtighed og intrapartum antibiotisk profylakse (IAP) til GBS-positive mødre 1. På trods af den reduktion af tidlig debut sygdom til ca. 1.000 sager i USA årligt på grund af IAP,GBS er fortsat den hyppigste årsag til tidlig debut neonatal sepsis, og sent debuterende forekomst forbliver upåvirket 1. Hvad enten i livmoderen, under fødslen, eller endda i sent forekommende tilfælde, neonatal eksponering for GBS kræver overlevelse, tværgående gennem en række værtsmiljøer og barrierer, immun unddragelse, og, i tilfælde af meningitis, passage af stærkt reguleret blod- hjernebarrieren 2. Opstrøms for disse virulente interaktioner inden den nyfødte er den indledende kolonisering af moderens vagina. Maternal GBS vaginal kolonisering varierer fra 8-18% i de udviklede lande og udviklingslande, med en anslået gennemsnit på 12,7% 3,4. GBS koloniseringen af vagina under graviditeten kan være konstant, intermitterende, eller forbigående mellem de enkelte kvinder 5. Interessant, er en maternal alder> 36 år i forbindelse med vedvarende kolonisering 6. Talrige biologiske og socio-økonomiske risikofaktorer for GBS vaginal koloniseringer blevet identificeret. Biologiske faktorer indbefatter gastrointestinale GBS kolonisering og fravær af Lactobacillus i tarmen. Imidlertid har ethnicity, fedme, hygiejne, og seksuel aktivitet også været forbundet med GBS vaginal vognen 7.

Selvom berygtet for at forårsage neonatale infektioner, GBS forårsager også en række maternelle infektioner både peripartum og postpartum. GBS transport forøges i kvinder med vaginitis 8 og, i nogle tilfælde kan endda være sygdommen enhed 9. Derudover kan GBS opstigning af den reproduktive tarmkanalen under graviditet resultere i intra-fostervand infektion eller chorioamnionitis 10. Øvrigt i op til 3,5% af graviditeter, GBS formidler på urinblæren at forårsage en urinvejsinfektion eller asymptomatisk bakteriuri 11. GBS bacteriuri under graviditet er forbundet med en øget risiko for intrapartum feber, chorioamnionitis, for tidlig fødsel, og premature hindebristning 12. Tilsammen er tilstedeværelsen af ​​GBS i vagina knyttet til infektioner af multiple værtsvæv, og evnen til at eliminere GBS fra denne niche er bydende nødvendigt for både maternal og neonatal sundhed.

Indtil for nylig var størstedelen af arbejdet undersøger GBS interaktioner med cervicovaginal tarmkanalen begrænset til in vitro celle modeller 13-15. Disse in vitro-forsøg har vist, bakterielle faktorer, der er vigtige for overholdelse, herunder overfladeproteiner sådan en pili og serin-rige gentagelser 17,18, samt to-komponent reguleringsordninger 15,19 og den globale transkriptionel respons vaginale epitel til GBS 19. Men for at kunne belyse host-mikrobe interaktioner i vagina, et solidt dyremodel er nødvendig. Tidlig arbejde viste, at GBS kan genvindes fra vagina af podede mus 20,21 og rotter <sup> 22 i både gravide og ikke-gravide betingelser. I 2005 blev kortvarig GBS vaginal kolonisering modelleret i mus for at undersøge effekten af en fag lytisk enzym til behandling af vaginal GBS over en 24 timers periode 23. Flere år senere blev en langsigtet GBS vaginal kolonisering musemodel udviklet til at studere vært og bakterielle faktorer, der styrer GBS vedholdenhed. Denne model har identificeret adskillige GBS faktorer, der bidrager til kolonisering, herunder overflade vedhæng 17,18 og GBS to-komponent systemer 19,24. Denne model har bidraget til at identificere værten reaktionsmekanismer 19,25 og blev brugt til at teste flere terapeutiske strategier, herunder immunmodulerende peptider 26 og probiotika 27. Denne protokol giver den nødvendige vejledning til at pode GBS i musen vagina og efterfølgende spore kolonisering og indsamle prøver til yderligere analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyr arbejde blev godkendt af Kontoret for Lab Animal Care på San Diego State University og udføres under anerkendte veterinære standarder. Hunmus, 8 år - 16 uger blev anvendt til udvikling af denne fremgangsmåde.

1. Fremstilling og intraperitoneal injektion af β-estradiol

  1. Mål ud β-østradiol (0,5 mg / mus) på afveje papir, mens iført egnede personlige værnemidler (PPE). ADVARSEL: β-estradiol kan optages gennem huden og slimhindeoverflader.
  2. Overfør β-estradiol til et 15 ml konisk rør og vortexes, indtil alle klumper fjernes, og β-estradiol er et fint pulver. Udarbejde sesamolie (100 pi / mus) i en 10 ml sprøjte. Sprøjte-filter sesamolie i 15 ml konisk rør indeholdende β-estradiol under anvendelse af en 0,45-pm-filter. Vortexes 15 ml konisk rør, indtil β-estradiol er en homogen suspension i sesamolie.
  3. Udarbejde p-estradiol suspensionen i en ny 10-ml sprøjte. Med en 18 G, 1-i. nål, aliquot 100 pi af suspensionen i 1 ml tuberkulin sprøjter. Forbered en sprøjte til hver mus. Placer en ny, steril 26 G, ½-in. nålen på hver tuberculinsprøjte.
  4. Administrere 0,5 mg af β-estradiol suspenderet i 100 pi sesamolie (5 mg / ml) til hver mus 24 timer før bakteriel inokulering. Injicere hver mus i bughulen, i de nedre abdominale kvadranter, lige til højre eller venstre for midterlinien, som tidligere beskrevet 28.
    BEMÆRK: Ingen rengøring eller klipning af injektionsstedet er nødvendig.

2. Vaginal Podning med GBS

  1. En dag inden inokulering, vokser en 5-ml natten over flydende kultur af en GBS-stamme af interesse, såsom A909 (serotype Ia), i Todd Hewitt-bouillon (THB) ved 37 ° C.
  2. Subkultur GBS overnatskultur ved en 1:10 volumen i frisk THB og inkuberes ved 37 ° C. Grow denbakterier til midt-log-fase (OD600 = 0,4-0,5). BEMÆRK: Denne vil typisk tage 2 - 3 i timer, afhængig af stamme af GBS.
  3. Overfør subkultur til et sterilt 15 ml konisk rør og pellet bakterier ved 3000 x g i 5 min. Aspirere supernatanten. Resuspender den bakterielle pellet i 200 pi sterilt phosphatpufret saltvand (PBS).
  4. Brug af den resuspenderede pellet, bringe 3 - 5 ml PBS (1 ml pr 10 mus) til præcis OD 600 = 0,4 i en ny 5-ml kultur rør. Dette vil være en koncentration på ~ 1 x 10 8 kolonidannende enheder (CFU) / ml. Overførsel til en ny 15 ml konisk rør og re-pelletere bakterierne ved 3000 x g i 5 min. Aspirere supernatanten.
  5. Pellet resuspenderes i PBS til 1/10 af det oprindelige volumen. For eksempel, hvis 3 ml OD600 = 0,4 blev pelleteret, og derefter resuspenderes det i 300 pi PBS. BEMÆRK: Dette er den sidste bakteriesuspension (~ 1 × 10 9 CFU / ml) anvendes til dyr inokulering.
  6. Reserve 50 pi af denne suspension til seriel fortynding og plettering på THB agar at fastslå den nøjagtige inokulum.
  7. Inokulere hver mus med 10 pi af den endelige bakteriesuspension således at 1 × 10 7 CFU administreres til hver mus.
    1. For at pode, begrænse musen manuelt ved at fastgøre den løse hud på nakkeskindet mellem handleren tommelfinger og pegefinger og derefter immobilisere halen, som tidligere 28 beskrevet.
    2. Udarbejde 10 pi af GBS fremstillet i trin 2.6 i en 200-pi gel loading pipettespids. Sæt spidsen 5 til 10 mm ind i den vaginale lumen og dispensere de 10 pi inokulum.
      BEMÆRK: Gel Tip til ilægning foretrækkes frem standard 200-pi tips til at minimere risikoen for orgel traume eller skade, især hos yngre eller mindre mus.
    3. Umiddelbart efter inokulering frigive nakkeskindet og løfte den bageste ende af musen, løfte musen i halen og walking forpoterne på en hård overflade til ~ 1 min.
    4. Efterse skedeåbningen for enhver tilbageløb af inokulum. Hvis der observeres tilbagestrømning, kan en frisk pipettespids anvendes til at manipulere eller forstørre den vaginale åbning, hvilket letter optagelse af tilbagestrømning ind i lumen. Yderligere kan tilbagestrømning blive opsuget via pipette og re-inokuleret.
      BEMÆRK: Hvis administrere topiske midler, probiotiske organismer eller proteiner af interesse, et volumen på op til 20 pi i en fysiologisk buffer kan gives i vagina.

3. pensle Vaginal Lumen at kvantificere GBS Load

  1. Der forberedes en 1,5-ml mikro-centrifugerør pr mus ved tilsætning af 100 pi PBS. Lige før podning, præ-vådt vatpinden i PBS.
  2. Begrænse mus som beskrevet i trin 2.7.1 og indsætte vatpinden 10 mm ind i den vaginale lumen. Drej forsigtigt podepinden 4 gange med uret og 4 gange mod uret, et let tryk til den vaginale væg.
  3. Overfør podepinden til 1,5-ml mikrocentrifugerør med 100 pi PBS. Før udpladning, vortex mikrocentrifugerøret til ~ 15 sek for at frigøre bakterier fra vatpinden. Serielt fortynde hver prøve i PBS og plade 20 pi fortyndinger 1:10 til 1: 10.000 på differentielt medium agarplader fremstillet ifølge producentens anvisninger. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 24 timer. GBS kolonier vises enten lys pink eller lilla i farven. Andre endogene flora vil blive hæmmet, eller vises som blå, hvide eller grå kolonier.

4. Indsamling Vaginal udskylningsvæske

  1. Begrænse musen som beskrevet i trin 2.7.1. Ved hjælp af en 200-pi gel loading pipettespids, pipette 20 pi PBS i den vaginale lumen. Forsigtigt pipetteres hele volumen op og ned 4 gange inden i hulrummet, og derefter trække hele volumen i samme pipettespids. BEMÆRK: Hvis lavage væsken er tyk med slim, en standard 200 pi pipettespidskan anvendes til at opsamle det endelige udskylningsvæske.
  2. Hvis besparelse udskylningsvæske for cytokin analyse eller CFU kvantificering, dispensere til en 0,7-ml mikrocentrifugerør. Hvis bestemme den fase af brunst, dispensere mindst 5 ul udskylningsvæske på en glasplade og observere cellerne under 100X forstørrelse på et lysmikroskop. BEMÆRK: For eksempler på brunst stadier, se figur 1.

5. Tissue Dissektion og Homogenisering

  1. For hver mus, forberede tre 2 ml skruelåg-rør (en for hvert væv: vagina, cervix, og livmoderen). Fyld hvert rør med rigelig aktiveringstid (0,4 - 0,5 g) 1,0 mm zirconiumdioxidperler at dække koniske bunden af ​​røret.
  2. Autoklaver de fremstillede rør forud for indsamlingen af ​​væv i 30 minutter ved 121 ° C, især hvis kvantificere bakteriel belastning. Der tilsættes 500 pi sterilt PBS til hvert rør. Vejes hvert rør efter autoklavering og rekord for fremtidig reference til at beregne inddrives væv vægt.
    3. 2 kvælning og cervikal dislokation. Spray ned ventrale maven med 70% EtOH. Med steril saks, åbne abdominopelvic hulrum, løfte ryggen hud og mavemuskler, og fortrænge tarmene, så den reproduktive tarmkanalen er eksponeret.
  3. Sterilisere saksen med 70% EtOH, tørre om nødvendigt, og skæres begge livmoderhornene midtskibs mellem livmoderen og æggestokkene. Brug saks og pincet, separat visceral fedt, membraner, og urinblæren væk fra den reproduktive tarmkanalen, bevæger kaudalt.
  4. Sterilisere saks som beskrevet i trin 5.4. Skåret tværs skeden så tæt på vulva som muligt at adskille reproduktionskanalen fra kroppen. Løft og fjern den intakte reproduktive tarmkanalen og læg den i en steril petriskål.
  5. Ved hjælp af en ny barberblad, adskille livmoderen fra cervix i en tværgående snit. Steriliser barberblad med 70%EtOH, og derefter adskille livmoderhalsen fra skeden i én tværgående snit. BEMÆRK: Der vil være en minimal mængde uterusvæv stadig fastgjort på livmoderhalsen. Der vil være en minimal mængde af vaginalt væv stadig fastgjort på livmoderhalsen.
  6. Under anvendelse af sterile pincetter, overføre hver af vævene i deres respektive 2 ml rør indeholdende PBS og homogenisering perler. Rengør pincet med 70% EtOH mellem håndtering hvert væv.
  7. Afvej hver 2 ml rør med skruelåg og trække den oprindelige vægt af røret for at bestemme vævsvægt. Tissue vægte typisk varierer mellem 20-100 mg. Tæt forsegle skruelåg rør og homogeniseres væv i 1 min ved maksimal hastighed i en vævshomogenisator.
  8. For at kvantificere bakteriel belastning, serielt fortynde 25 pi vævshomogenat og plade fortyndinger 1:10 gennem 1: 10.000 på differentierede medium agarplader. Pladerne inkuberes som beskrevet i trin 3.3. For at gemme prøver til cytokin kvantificering, fryse vævshomogenater på -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under udviklingen af ​​denne model blev flere observationer gjort med hensyn faktorer, der påvirker varigheden af ​​GBS vaginal kolonisering. At bestemme, hvordan østrale stadium inokulering virkninger GBS bakteriel persistens blev mus iscenesat på dagen for inokulering via vaginal skyllevæske. Figur 1 illustrerer de fire faser af muse østrale cyklus, som bestemt ved våd-mount vaginal udskylningsvæske, en veletableret metode 29. Mus blev inddelt i grupper baseret på denne indledende fase, og GBS vedholdenhed blev overvåget over tid via vaginal pensling. Mus inokuleret ved proøstrus fase blev koloniseret med GBS længere end nogen anden fase af østrus, især i diøstrus på tidspunktet for inokulering (figur 2). Baseret på disse resultater, i den nuværende model behandles mus med β-østradiol én dag før GBS inokulering for at synkronisere dem i proøstrus fase. Andre murine modeller af reproduktive infektioner har vist en øget evne til patogene organisme at fortsætte, når mus opretholdt i brunst fase gennem eksogen estradiol behandling 30,31. At afgøre, om dette fænomen også opstod under vaginal kolonisering med GBS blev GBS vedholdenhed overvåget under gentagne β-østradiol behandling. Vedvarende brunst fremmes GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC # BAA-1138) persistens i CD-1 mus, med 90% kolonisering 2 uger efter indpodning (figur 3A). I et typisk forsøg med en dosis af β-estradiol før podning blev kun 40-50% af musene koloniseret én uge efter inokulering (figur 4). Middelværdien GBS CFU udvundet fra disse mus efterligner procentdelen af kolonisering (figur 3B). Selv om disse resultater blev opnået fra uafhængige forsøg disse data dæmonerlysning af bl.a. at opretholde kontinuerlig østrus fremmer GBS vaginal persistens i de fleste CD-1-mus.

Når der udføres kolonisering eksperimenter med forskelligt humant GBS-isolater, blev det observeret, at stammer varierede i deres evne til at forblive i CD-1-mus, der spænder fra flere dage til over en måned. Af stammerne testet, NCTC 10/84 havde den korteste varighed, A909 og COH1 varet i en til to uger, mens stammen CJB111 varet i de fleste mus i to uger (figur 4), og endda ud over en måned (data ikke vist) . Til dato har der ikke været nogen observerede korrelation af serotype og evne til at forblive i mus vagina; har dog betydelige forskelle mellem de enkelte GBS stammer rapporteret 25. Evnen af ​​GBS til at kolonisere flere indavlede og udavlede mus linjer blev også undersøgt. GBS-stamme A909 varet i vagina i ca. en uge i udavlede CD-1mus og indavlede FVB-mus (figur 5). Alternativt blev størstedelen af indavlede BALB / c og C57BL / 6 koloniseret på en uge (figur 5) og forblev koloniseret i en måned eller længere (data ikke vist).

Ved anvendelse af denne protokol blev GBS vaginal kolonisering in vivo visualiseret ved at pode mus med et plasmid GFP-udtrykkende GBS stamme og indsamle væv til fluorescensmikroskopi. GFP-GBS blev påvist både vedhæftende murine vaginale epitel (figur 6A) og i tæt nærhed til andre native vaginale flora (figur 6B). Nr GFP signal blev detekteret hos mus, der havde ryddet GFP-GBS på tidspunktet for væv indsamling (data ikke vist).

figur 1
Figur 1: Identifikation af fase af Estrus fra Ufarvet Murine Vaginal Lavage Fluid. (A) proøstrus: rigelige kerneholdige pladeepitelceller (sorte pile). (B) Estrus: rigelige forhornede pladeepitelceller (blå pile). (C) Metestrus: blanding af nukleerede og forhornede pladeepitelceller og overvejende leukocytter (grå pile). (D) diøstrus: rigelige leukocytter. Forstørrelse = 100X, skala bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: østrale Stage Impacts Vaginal Persistens af GBS. Procent af CD-1 mus koloniseret med 1 × 10 7 CFU GBS A909 over tid. Mus blev grupperet (n = 7 - 11 / gruppe) baseret på østrus stadium på tidspunktet for GBS inokulering, bestemt ved vaginal udskylning væske. Et uafhængigt forsøg er vist. Dette tal er blevet ændret fra tidligere offentliggjorte arbejde og genoptrykt med tilladelse 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Fortsat Behandling med β-østradiol Fremmer GBS Vaginal Persistens. Procent koloniseret (A) eller inddrives CFU (B) i CD-1 mus (n = 10) podet med 1 × 10 7 CFU GBS A909 og vedligeholdes på β-østradiol behandling. Mus blev injiceret med β-østradiol én dag forud for GBS inokulering og på dag 1, 3, og 5 efter inokulering. Et uafhængigt forsøg er vist. Linjen i (B) repræsenterer betyde udvindes CFU. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: GBS Stammer forskellige i deres evne til at forblive i Vaginal Tract. Udavlede CD-1-mus (n = 10 / gruppe) blev injiceret med en enkelt dosis af β-estradiol én dag forud for GBS inokulering med 1 × 10 7 CFU af de givne GBS stammer. Forsøg med hver stamme blev udført uafhængigt og blev gentaget mindst tre gange; en repræsentativt resultat er vist. Dette tal er blevet ændret fra tidligere offentliggjorte arbejde og genoptrykt med tilladelse 25. Klik her for at se en større version af dette tal.

pload / 54.708 / 54708fig5.jpg "/>
Figur 5: musestammer forskellige i deres evne til at blive koloniseret med GBS i vagina. Mus fra angivne baggrund stammer blev injiceret med en enkelt dosis af β-estradiol én dag forud for inokulation med 1 × 10 7 CFU af GBS A909. Forsøg med hver stamme blev udført uafhængigt og blev gentaget mindst to gange; en repræsentativt resultat er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Fluorescent Imaging af GBS i Mouse Vaginal Tract. Visualisering af GFP- udtrykker GBS (grøn) langs vaginale epitel ved forstørrelse = 630x, skala bar = 50 um (A), og i umiddelbar nærhed af endogenous vaginal mikrober på forstørrelse = 1.000X, skala bar = 20 um (B). Blåsplint = DAPI. Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Udarbejdelse af GBS stammer og Mouse Lines Udnyttet til vaginal Colonization Studies. GBS baggrund stammer, mus linjer, og dosering af β-estradiol er vist. Undersøgelser med den model, der er beskrevet i dette arbejde er fremhævet med gråt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at fremme fremføringen af ​​forståelsen af ​​GBS interaktioner med både værten og andre mikrober i forbindelse med værten, er en dyremodel påkrævet. Dette arbejde beskriver de tekniske aspekter af indførelse af GBS vaginal kolonisering hos mus. Denne protokol opnår> 90% kolonisering af mus uden anvendelse af anæstetika til inokulering bakterier eller at indsamle prøver podning, immun-suppressants at muliggøre kolonisering, vaginal forvask, eller tilsætningsstoffer til at fortykke inokulum. Desuden denne model demonstrerer robust reproducerbarhed, med beskedne inter-eksperimentel variabilitet i både længden af ​​GBS persistens og den bakterielle belastning. De repræsentative resultater demonstreret i denne undersøgelse er udarbejdelse af uafhængige forsøg og bør være en reference for fremtidig eksperimentelt design; dog bør direkte sammenligninger på tværs af GBS stammer og mus linjer gøres med omhu.

Denne model efterligner menneskelige colonizatipå i den slimhinde vaginal GBS kolonisering af mus synes at være begrænset til den reproduktive tarmkanalen. Selvom opstigning ind i livmoderhalsen og livmoderen er blevet observeret med flere GBS stammer 25, behøver mus ikke vise tegn på morbiditet eller mortalitet, selv efter måneders kolonisering. Afhængigt af GBS og musestammer undersøgt, mus viser konsekvent eller forbigående vaginal kolonisering, som er nyttig til at studere bakterielle faktorer og vært immunresponser hhv. I denne model nogle mus viser intermitterende kolonisering; det er i øjeblikket uvist, om mus bliver recolonized på senere tidspunkter, eller hvis kolonisering falder under detektionsgrænsen, typisk 50 til 100 CFU, på bestemte tidspunkter. Af note, har transmission mellem mus ikke observeret når koloniserede og ikke-koloniserede mus huses sammen over flere uger (data ikke vist).

Denne metode bruger en kommercielt tilgængelig selektivt og differentielt mediumfor GBS at kvantificere muse bakterielle byrder. GBS vokser som lyse pink eller grålilla kolonier, som er let synlig efter 24 timers inkubation. Dette medie har vist sig at have højere følsomhed til detektering GBS sammenlignet med andre medier, herunder blod agar og Granada medium 32, og har været anvendt i kombination med latex bead agglutinationstest at bekræfte GBS kliniske isolater 18. I denne undersøgelse, lyse pink eller grålilla kolonier fra ikke-GBS koloniserede mus er aldrig blevet tilbagebetalt. Nogle endogene flora, typisk Enterococcus arter, vil vokse som blå kolonier, og nogle kolonier vises hvid, grå eller meget bleg pink. Er vigtigt, at pladerne tælles efter 18 til 24 timers inkubation, som ikke-GBS kolonier kan inkorporere den lyserøde pigment hvis det efterlades i inkubatoren eller på benchtop i længere perioder. Vi har observeret, som tidligere er blevet rapporteret 32, at visse S. pyogenes isolater vil danne lyserøde kolonier på CHROMagar StrepB, men disse colonies er typisk mindre end GBS kolonier. S. pyogenes er ikke blevet isoleret fra de endogene vaginale flora af mus i disse studier, men denne observation bør overvejes i det fremtidige arbejde.

Størstedelen af resultaterne blev opnået fra udavlede CD-1 mus linje, der viser robuste medfødte immunrespons inden for de første få dage efter indpodning, med efterfølgende bakteriel clearance i de fleste mus 19. Andre har også testet yderligere GBS stammer og har observeret længere vedholdenhed gange 33,34. Da udviklingen af denne model, har andre grupper begyndt at udvikle lignende musemodeller af GBS vaginal kolonisering at undersøge virkningen af værtens immunrespons 33,35, forebyggende behandlinger 36,37 og transmission til fosteret i livmoderen 34,38. Disse forskelle kan forklares ved en række faktorer, herunder genetiske determinanter, der påvirker immunrespons og than sammensætning af indfødte vaginale flora. Vi har samlet en liste over de GBS stammer og respektive mus linjer der er blevet undersøgt til dato i GBS vaginal kolonisering studier (tabel 1). Antallet af nylige undersøgelser med dyremodeller fremhæver interesse og nødvendigheden af ​​disse typer af modeller inden for GBS patogenese forskning.

Inden for vagina, er slimhindeimmunitet stramt reguleret af steroidhormoner 44, og endda én dosis β-østradiol, som beskrevet i denne model, forstyrrer værtens immunrespons. Alligevel er der findes solide medfødte immunrespons inden for de første dage af GBS kolonisering 19,25, hvilket antyder, at berørte immunresponser er stort set intakt. Modeller, der involverer gentagne p-østradiol injektioner kan forlænge GBS vaginal vedholdenhed, som påvist i denne undersøgelse (figur 3) og af andre 33. Men immunrespons og reproduktive tarmkanalen physiologi kan mere forvirret, hvilket gør resultaterne svære at fortolke. Vigtigt er det, der er beskrevet på tværs forskellige GBS forskelle isolerer og mus stammer i denne undersøgelse kan ændres i løbet af modeller for vedvarende østrus og bør undersøges i det fremtidige arbejde. Notatet hverken brunst scene eller GBS serotype påvirket vaginal kolonisering i en rotte model 22. Derudover humane sure vaginale pH på 3,6 til 4,5 45 drastisk forskellig fra den mere neutral murine vaginal pH på 6,5 46, som kan have indflydelse GBS genekspression og efterfølgende faktorer bidrager til kolonisering. Endelig indfødte vaginal flora adskiller mellem mennesker og murine model modparter og fremtidige arbejde bør undersøge GBS kolonisation i gnotobiotiske mus, der bærer humane vaginale flora.

Sammenfattende har disse undersøgelser forsøgt at undersøge vært og bakterielle faktorer, der styrer GBS vaginal kolonisering. Primært, den robuste, innovative dyremodel af GBS vaginal colonization udviklet i dette arbejde kan anvendes til at beskrive komplekse vært-mikrobe interaktioner i et in vivo vaginal miljø. Opnået fra denne model oplysninger har allerede øget viden om værten immune komponenter og specifikke GBS gener, der styrer GBS vaginal vedholdenhed. Derudover er disse resultater rejste yderligere spørgsmål og vil være nyttig til yderligere udvikling af nye terapeutiske midler til at begrænse maternal GBS vaginal kolonisering og efterfølgende udsættelse af den nyfødte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Tags

Infektion Gruppe B GBS, Vaginal kolonisering model murine model bakteriel-host interaktion
En murin model af gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine … More

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter