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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

ग्रुप 'बी' के एक murine मॉडल Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य से एक murine मॉडल में मानव समूह बी स्ट्रेप्टोकोकस (जीबीएस) योनि उपनिवेशवाद की नकल करने के लिए है। इस विधि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और जीबीएस योनि हठ के लिए योगदान दे बैक्टीरियल कारकों की जांच करने के लिए, साथ ही चिकित्सीय रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

वयस्कों के 30% - स्ट्रेप्टोकोकस agalactiae (ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकस, जीबीएस), एक ग्राम पॉजिटिव, मानव जठरांत्र संबंधी मार्ग और 10 के योनि मार्ग की स्पर्शोन्मुख उपनिवेशवादी है। प्रतिरक्षा-समझौता व्यक्तियों, नवजात शिशुओं सहित, गर्भवती महिलाओं, और बुजुर्गों में, जीबीएस के कारण पूति, गठिया, निमोनिया, और दिमागी बुखार एक आक्रामक रोगज़नक़ के लिए स्विच कर सकते हैं। क्योंकि जीबीएस नवजात शिशुओं के एक अग्रणी जीवाणु रोगज़नक़ है, वर्तमान प्रोफिलैक्सिस जीबीएस योनि उपनिवेशवाद और जीबीएस पॉजिटिव माताओं के बाद peripartum एंटीबायोटिक उपचार के लिए देर से गर्भ स्क्रीनिंग के शामिल है। भारी जीबीएस योनि बोझ दोनों नवजात रोग और उपनिवेशवाद के लिए एक जोखिम कारक है। दुर्भाग्य से, थोड़ा मेजबान और बैक्टीरियल कारक है कि को बढ़ावा देने या जीबीएस योनि उपनिवेश की स्थापना की अनुमति के बारे में जाना जाता है। इस प्रोटोकॉल एक भी β-एस्ट्राडियोल पूर्व उपचार और दैनिक नमूने का उपयोग बैक्टीरियल लोआ निर्धारित करने के लिए लगातार जीबीएस योनि उपनिवेशवाद की स्थापना के लिए एक तकनीक का वर्णनघ। यह अधिक जानकारी के तरीकों अतिरिक्त उपचारों या ब्याज की अभिकर्मकों प्रशासन के लिए और योनि पानी से धोना तरल पदार्थ और प्रजनन पथ ऊतकों एकत्र करने के लिए। इस माउस मॉडल योनि वातावरण में जीबीएस मेजबान बातचीत, जो गर्भावस्था के दौरान मातृ योनि उपनिवेशवाद को नियंत्रित करने और कमजोर नवजात शिशु को संचरण को रोकने के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को बढ़ावा मिलेगा की समझ को आगे होगा। यह भी महिला योनि मार्ग में सामान्य जीवाणु मेजबान बातचीत के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने के लिए ब्याज की हो जाएगा।

Introduction

स्ट्रेप्टोकोकस agalactiae, समूह बी स्ट्रेप्टोकोकस (जीबीएस), एक समझाया, ग्राम पॉजिटिव जीवाणु जो अक्सर पेट और स्वस्थ वयस्कों की genitourinary पथ से अलग है। 1970 के दशक में जीबीएस संक्रामक नवजात मृत्यु दर का प्रमुख एजेंट के रूप में उभरा है, प्रतिवर्ष नवजात रोग के 7,000 से अधिक मामलों के साथ 1। पहले ही शुरू होने जीबीएस रोग (ईओडी) के पहले घंटे या जीवन के दिनों में होता है, निमोनिया या श्वसन संकट के रूप में उठता है, और अक्सर, पूति में विकसित करता है, जबकि देर शुरुआत रोग (लोद) कई महीनों के बाद ensues और bacteremia, जो अक्सर के साथ प्रस्तुत करता है 2 मैनिंजाइटिस के लिए अग्रिम। 2002 के रूप में, रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र जीबीएस पॉजिटिव माताओं 1 करने के लिए देर से गर्भ और intrapartum एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस (आईएपी) में जीबीएस योनि उपनिवेश की स्थापना के लिए सार्वभौमिक स्क्रीनिंग की सिफारिश की। संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 1000 मामलों में पहले ही शुरू होने रोग की कमी के सालाना आईएपी के कारण के बावजूद,जीबीएस पहले ही शुरू होने नवजात पूति का प्रमुख कारण बनी हुई है, और देर शुरुआत घटना अप्रभावित 1 रहता है। गर्भाशय में चाहे, प्रसव के दौरान, या यहां तक ​​कि देर शुरुआत मामलों में, जीबीएस के लिए नवजात जोखिम दिमागी बुखार, विनियमित अत्यधिक रक्त की क्रासिंग के मामले में मेजबान वातावरण और बाधाओं, प्रतिरक्षा चोरी के एक नंबर के माध्यम से अस्तित्व, आड़ा आवश्यकता है, और, मस्तिष्क बाधा 2। नवजात शिशु के भीतर इन विषमय बातचीत के ऊपर मातृ योनि पथ का प्रारंभिक बसाना है। मातृ जीबीएस योनि बसाना दरों 12.7% 3,4 की अनुमानित औसत दर के साथ, विकसित और विकासशील देशों में 8-18% से लेकर। गर्भावस्था के दौरान योनि मार्ग की जीबीएस उपनिवेशन, लगातार रुक-रुक कर, या अलग-अलग महिलाओं 5 के बीच में प्रकृति में क्षणिक हो सकता है। दिलचस्प है, एक मातृ उम्र> 36 साल से लगातार बसाना 6 के साथ जुड़ा हुआ है। जीबीएस योनि उपनिवेश की स्थापना के लिए कई जैविक और सामाजिक-आर्थिक जोखिम कारकोंपहचान की गई है। जैविक कारकों जठरांत्र जीबीएस उपनिवेशवाद और पेट के भीतर लैक्टोबैसिलस के अभाव में शामिल हैं। हालांकि, जातीयता, मोटापा, स्वच्छता, और यौन गतिविधि भी जीबीएस योनि गाड़ी 7 के साथ संबद्ध किया गया है।

हालांकि संक्रमण के कारण नवजात के लिए कुख्यात, जीबीएस भी मातृ संक्रमण के दोनों peripartum और प्रसवोत्तर की एक किस्म का कारण बनता है। जीबीएस गाड़ी योनिशोथ 8 के साथ पेश महिलाओं में बढ़ जाती है और कुछ मामलों में, यहां तक कि रोग इकाई 9 हो सकता है। इसके अतिरिक्त, गर्भावस्था के दौरान प्रजनन पथ की जीबीएस उदगम इंट्रा-एमनियोटिक संक्रमण या chorioamnionitis 10 में परिणाम हो सकता है। इसके अलावा, गर्भधारण के 3.5% तक में, जीबीएस मूत्राशय के लिए प्रसार एक मूत्र पथ के संक्रमण या स्पर्शोन्मुख बेक्टेरियूरिया 11 पैदा करने के लिए। गर्भावस्था के दौरान जीबीएस बेक्टेरियूरिया intrapartum बुखार, chorioamnionitis, अपरिपक्व प्रसव, और prematur का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़ेझिल्ली 12 की ई टूटना। साथ में ले ली, योनि पथ के भीतर जीबीएस की उपस्थिति कई मेजबान ऊतकों के संक्रमण से जुड़ा हुआ है, और क्षमता इस जगह से जीबीएस समाप्त करने के लिए दोनों मातृ एवं नवजात के स्वास्थ्य के लिए आवश्यक है।

अभी हाल तक, काम cervicovaginal पथ के साथ जीबीएस बातचीत की जांच के बहुमत में इन विट्रो सेल मॉडल 13-15 तक ही सीमित था। ये इन विट्रो प्रयोगों बैक्टीरियल कारक है कि पालन के लिए महत्वपूर्ण हैं, सतह प्रोटीन सहित पता चला है इस तरह के एक पिली और सेरीन अमीर दोहराता 17,18, साथ ही दो घटक नियामक प्रणाली 15,19 और योनि उपकला के वैश्विक ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया जीबीएस 19। हालांकि, पूरी तरह से योनि पथ के भीतर मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत स्पष्ट करने के लिए एक मजबूत पशु मॉडल आवश्यक है। प्रारंभिक कार्य प्रदर्शन किया है कि जीबीएस टीका चूहों 20,21 और चूहों के योनि मार्ग से बरामद किया जा सकता है <sup> दोनों गर्भवती और गैर गर्भवती की स्थिति में 22। 2005 में, अल्पकालिक जीबीएस योनि बसाना चूहों में मॉडलिंग की थी एक फेज अपघट्य एंजाइम की प्रभावकारिता की जांच के लिए एक 24 घंटा अवधि 23 से अधिक योनि जीबीएस के इलाज के लिए। कई साल बाद, एक लंबी अवधि जीबीएस योनि बसाना माउस मॉडल जीबीएस हठ गवर्निंग मेजबान और बैक्टीरियल कारकों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। यह मॉडल उपनिवेशन के लिए योगदान कई कारकों जीबीएस, सतह उपांग 17,18 और जीबीएस दो घटक प्रणालियों 19,24 सहित पहचान की है। यह मॉडल मेजबान प्रतिक्रिया तंत्र 19,25 की पहचान के लिए योगदान दिया है और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी पेप्टाइड्स 26 और 27 प्रोबायोटिक्स सहित कई चिकित्सीय रणनीतियों, परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस प्रोटोकॉल आवश्यक मार्गदर्शन माउस योनि मार्ग में जीबीएस टीका लगाना और बाद में उपनिवेशवाद पर नज़र रखने और आगे के विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र करने के लिए देता है।

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Protocol

सभी जानवर काम सैन डिएगो स्टेट यूनिवर्सिटी में लैब पशु की देखभाल के कार्यालय ने मंजूरी दे दी है और स्वीकार किए जाते हैं पशु चिकित्सा मानकों के तहत आयोजित किया गया। मादा चूहों, उम्र 8 - 16 सप्ताह, इस पद्धति के विकास के लिए इस्तेमाल किया गया।

1. तैयारी और इंट्रापेरिटोनियल β-estradiol के इंजेक्शन

  1. बाहर उपाय कागज वजन, जबकि उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनने पर β-एस्ट्राडियोल (0.5 मिलीग्राम / माउस)। चेतावनी: β-एस्ट्राडियोल त्वचा और श्लैष्मिक सतहों के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और भंवर β-एस्ट्राडियोल स्थानांतरण जब तक सभी गांठ निकाल रहे हैं और β-एस्ट्राडियोल एक ठीक पाउडर है। एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में तिल का तेल (100 μl / माउस) ड्रा। 15 मिलीलीटर शंक्वाकार एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग β-एस्ट्राडियोल युक्त ट्यूब में सिरिंज फिल्टर तिल का तेल। 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब भंवर तक β-एस्ट्राडियोल तिल के तेल में एक समरूप निलंबन है।
  3. ड्रा β-esएक नया 10 मिलीलीटर सिरिंज में tradiol निलंबन। एक 18 ग्राम, 1-इन के साथ। सुई, विभाज्य 1 मिलीलीटर ट्यूबरकुलीन सीरिंज में निलंबन के 100 μl। प्रत्येक माउस के लिए एक सिरिंज तैयार करें। एक नया, बाँझ 26 जी, साढ़े में रखें। प्रत्येक ट्यूबरकुलीन सिरिंज पर सुई।
  4. β-एस्ट्राडियोल प्रत्येक माउस के 24 घंटा जीवाणु टीका करने से पहले करने के लिए तिल का तेल (5 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μl में निलंबित की 0.5 मिलीग्राम प्रशासन। प्रत्येक माउस सिर्फ सही करने के लिए, पेट के निचले भाग quadrants में पेरिटोनियल गुहा के भीतर इंजेक्षन, या midline के छोड़ दिया है, के रूप में पहले 28 में वर्णित है।
    नोट: कोई सफाई या इंजेक्शन साइट की कतरन आवश्यक है।

2. जीबीएस के साथ योनि टीका

  1. एक दिन टीका करने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर टोड हेविट शोरबा (THB) में इस तरह के A909 (सीरोटाइप आइए) के रूप में ब्याज की एक जीबीएस तनाव का एक 5 मिलीलीटर रात भर तरल संस्कृति विकसित।
  2. ताजा THB में एक 1:10 मात्रा में जीबीएस रात संस्कृति उपसंस्कृति और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। आगे बढ़ेंमध्य लॉग चरण के लिए बैक्टीरिया (600 आयुध डिपो = 0.4-0.5)। नोट: - 3 घंटा, जीबीएस के तनाव के आधार पर यह आम तौर पर 2 ले जाएगा।
  3. 5 मिनट के लिए 3000 × छ एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और गोली बैक्टीरिया को उपसंस्कृति स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला aspirate। बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 200 μl में बैक्टीरिया गोली Resuspend।
  4. एक नया 5 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में पीबीएस के 5 मिलीलीटर (10 चूहों प्रति 1 मिलीलीटर) वास्तव में आयुध डिपो के लिए 600 = 0.4 - resuspended गोली का प्रयोग, 3 लाने के लिए। यह ~ 1 × 10 8 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) / एमएल की एकाग्रता होगा। एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और करने के लिए स्थानांतरण 5 मिनट के लिए 3000 × छ बैक्टीरिया फिर से गोली। सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  5. 1/10 मूल मात्रा में पीबीएस में गोली Resuspend। उदाहरण के लिए, यदि 600 आयुध डिपो = 0.4 के 3 मिलीलीटर pelleted किया गया था, तो यह पीबीएस के 300 μl में resuspend। नोट: यह अंतिम जीवाणु निलंबन (~ 1 × 10 9 CFU / एमएल) पशु टीका के लिए प्रयोग किया जाता है।
  6. आरधारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए इस निलंबन के 50 μl eserve और THB अगर पर चढ़ाना सटीक inoculum निर्धारित करने के लिए।
  7. अंतिम जीवाणु निलंबन के 10 μl के साथ प्रत्येक माउस टीका लगाना इतना है कि 1 × 10 7 CFU प्रत्येक माउस के लिए किया जाता है।
    1. , टीका लगाना माउस के रूप में पहले 28 में वर्णित है, हैंडलर के अंगूठे और तर्जनी और फिर पूंछ immobilizing के बीच गर्दन के कूड़ा पर ढीली त्वचा हासिल करके मैन्युअल को नियंत्रित करने के लिए।
    2. एक 200 μl जेल लोड हो रहा विंदुक टिप में 2.6 चरण में तैयार जीबीएस के 10 μl ड्रा। टिप योनि लुमेन में 5 से 10 मिमी डालें और inoculum के 10 μl बांटना।
      नोट: जेल लोड हो रहा सुझावों का मानक 200 μl सुझावों का अधिक पसंद कर रहे अंग आघात या चोट के जोखिम को कम करने के लिए, विशेष रूप से युवा या छोटे चूहों में।
    3. इसके तत्काल बाद टीका, गर्दन के कूड़ा जारी है और माउस के पीछे के भाग को ऊपर उठाना, पूंछ और डब्ल्यू द्वारा माउस उठाने~ 1 मिनट के लिए एक कठिन सतह पर सामने पंजे alking।
    4. दिखने में inoculum के किसी भी backflow के लिए योनि खोलने का निरीक्षण किया। backflow मनाया जाता है, एक ताजा विंदुक टिप में हेरफेर या योनि खोलने विस्तार करने के लिए, लुमेन में backflow के तेज को सुविधाजनक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, backflow पिपेट के माध्यम से aspirated जा सकता है और फिर से टीका।
      नोट: सामयिक एजेंटों, प्रोबायोटिक जीवों, या ब्याज के प्रोटीन का प्रबंध करते हैं, तो एक शारीरिक बफर में 20 μl अप करने के लिए एक मात्रा योनि मार्ग में दी जा सकती है।

3. जीबीएस लोड यों योनि लुमेन swabbing

  1. पीबीएस के 100 μl जोड़कर माउस के प्रति एक 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें। बस swabbing करने से पहले, पीबीएस में झाड़ू पूर्व गीला।
  2. कदम 2.7.1 में वर्णित के रूप में माउस को नियंत्रित करना और योनि लुमेन में झाड़ू 10 मिमी डालें। धीरे 4 बार घड़ी की झाड़ू से बारी बारी से और 4 बार काउंटर घड़ी, योनि दीवार को मामूली दबाव लागू करने।
  3. पीबीएस के 100 μl के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब झाड़ू स्थानांतरण। चढ़ाना करने से पहले, भंवर ~ के लिए झाड़ू से बैक्टीरिया को रिहा करने के लिए 15 सेकंड के microcentrifuge ट्यूब। निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार अंतर मध्यम अगर प्लेटों पर 10,000: क्रमानुसार 01:10 के माध्यम से 1 पीबीएस में प्रत्येक नमूना और प्लेट dilutions के 20 μl पतला। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। जीबीएस कालोनियों या तो चमकीले गुलाबी या रंग में चमकीला दिखाई देगा। अन्य अंतर्जात वनस्पतियों हिचकते किया जाएगा, या नीले, सफेद, ग्रे या कालोनियों के रूप में दिखाई देगा।

4. एकत्रित योनि पानी से धोना द्रव

  1. कदम 2.7.1 में वर्णित के रूप में माउस को नियंत्रित। एक 200 μl जेल लोड हो रहा विंदुक टिप, pipet योनि लुमेन में पीबीएस के 20 μl का उपयोग करना। धीरे पूरे मात्रा ऊपर और नीचे लुमेन के भीतर 4 बार pipet, और फिर एक ही विंदुक टिप में पूरी मात्रा वापस ले लें। नोट: यदि पानी से धोना तरल पदार्थ म्यूकस के साथ मोटी है, एक मानक 200 μl विंदुक टिपअंतिम पानी से धोना तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. साइटोकाइन विश्लेषण या CFU मात्रा का ठहराव के लिए पानी से धोना तरल पदार्थ की बचत करते हैं, एक 0.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बांटना। मद के मंच का निर्धारण करते हैं, तो एक गिलास स्लाइड पर पानी से धोना तरल पदार्थ की कम से कम 5 μl बांटना और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर 100X बढ़ाई के तहत कोशिकाओं का पालन। नोट: estrous चरणों के उदाहरण के लिए, चित्रा 1 देखें।

5. ऊतक विच्छेदन और homogenization

  1. प्रत्येक माउस के लिए, तीन 2 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब (: योनि, गर्भाशय ग्रीवा, गर्भाशय और प्रत्येक ऊतक के लिए एक) तैयार करते हैं। पर्याप्त के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें (0.4 - 0.5 ग्राम) 1.0 मिमी zirconia मोती ट्यूब के शंक्वाकार के आकार नीचे कवर करने के लिए।
  2. 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऊतक एकत्रित करना, बैक्टीरियल लोड बढ़ाता है, खासकर अगर करने से पहले तैयार नलियों आटोक्लेव। प्रत्येक ट्यूब बाँझ पीबीएस के 500 μl जोड़ें। autoclaving और भविष्य में संदर्भ बरामद ऊतक वजन की गणना करने के लिए रिकॉर्ड के बाद प्रत्येक ट्यूब वजन।
    3. 2 asphyxiation और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के रूप में अनुमोदित संस्थागत तरीकों का उपयोग बलिदान। 70% EtOH के साथ उदर पेट के नीचे स्प्रे। बाँझ कैंची के साथ, उदरगणिका गुहा खुली पीठ त्वचा और पेट की मांसपेशियों को उठा, और आंतों इतना है कि प्रजनन पथ अवगत कराया है विस्थापित।
  3. 70% EtOH के साथ कैंची जीवाणुरहित, यदि आवश्यक हो तो साफ साफ है, और दोनों गर्भाशय सींग गर्भाशय और अंडाशय शरीर के बीच मध्य लंबाई में कटौती। कैंची और संदंश, अलग आंत वसा, झिल्ली, और प्रजनन पथ से दूर मूत्राशय का प्रयोग, दुमदारी घूम रहा है।
  4. कदम 5.4 में वर्णित के रूप में कैंची जीवाणुरहित। Transversely योनि के रूप में संभव के रूप में योनी शरीर से प्रजनन पथ को अलग करने के लिए करीब काटा। लिफ्ट और बरकरार प्रजनन पथ को हटाने और एक बाँझ पेट्री डिश में जगह है।
  5. एक नई धार का प्रयोग, एक अनुप्रस्थ काट में गर्भाशय ग्रीवा से गर्भाशय अलग। 70% के साथ धार जीवाणुरहितEtOH, और फिर एक अनुप्रस्थ काट में योनि से गर्भाशय ग्रीवा अलग। नोट: गर्भाशय ऊतक का एक न्यूनतम राशि अभी भी गर्भाशय ग्रीवा से जुड़ी होगी। वहाँ योनि ऊतक का एक न्यूनतम राशि अभी भी गर्भाशय ग्रीवा से जुड़ी होगी।
  6. बाँझ संदंश का प्रयोग, उनके संबंधित 2-मिलीलीटर ट्यूबों पीबीएस युक्त और मोती homogenizing में ऊतकों के प्रत्येक हस्तांतरण। प्रत्येक ऊतक से निपटने के बीच में 70% EtOH के साथ संदंश साफ करें।
  7. प्रत्येक 2 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब वजन और ट्यूब के मूल वजन घटाना ऊतक वजन का निर्धारण करने के लिए। 100 मिलीग्राम - ऊतक वजन आमतौर पर 20 के बीच बदलती हैं। कसकर पेंच टोपी नलियों सील करने और एक ऊतक homogenizer में अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए ऊतकों homogenize।
  8. अंतर मध्यम अगर प्लेटों पर 10,000: बैक्टीरियल लोड यों, क्रमानुसार ऊतक homogenate और प्लेट dilutions 01:10 के माध्यम से 1 की 25 μl पतला। 3.3 कदम के रूप में वर्णित प्लेटें सेते हैं। साइटोकाइन मात्रा का ठहराव के लिए नमूने स्टोर करने के लिए, पर ऊतक homogenates फ्रीज -20 डिग्री सेल्सियस।

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Representative Results

इस मॉडल के विकास के दौरान, कई टिप्पणियों कारक है कि जीबीएस योनि उपनिवेशवाद की अवधि को प्रभावित के बारे में किए गए थे। टीका प्रभावों जीबीएस बैक्टीरियल हठ पर कैसे estrous चरण का निर्धारण करने के लिए, चूहों योनि पानी से धोना तरल पदार्थ के माध्यम से टीका के दिन का मंचन किया गया। के रूप में द्वारा निर्धारित चित्रा 1, माउस estrous चक्र के चार चरण दिखाता गीला माउंट योनि पानी से धोना तरल पदार्थ, एक अच्छी तरह से स्थापित विधि 29। चूहों इस प्रारंभिक चरण के आधार पर समूहों में विभाजित किया गया है, और जीबीएस हठ योनि swabbing के माध्यम से समय के साथ नजर रखी थी। Proestrus स्तर पर टीका चूहे मद के किसी भी अन्य मंच है, विशेष रूप से टीका के समय (चित्रा 2) पर diestrus में उन लोगों की तुलना में अब जीबीएस के साथ उपनिवेश थे। इन परिणामों के आधार पर, मौजूदा मॉडल में, चूहों β-estradiol के साथ एक दिन जीबीएस टीका करने से पहले उन्हें proestrus चरण में सिंक्रनाइज़ करने के लिए इलाज कर रहे हैं। प्रजनन पथ के संक्रमण के अन्य murine मॉडल रोगजनक जीव की एक वृद्धि की क्षमता जारी रहती है जब चूहों बहिर्जात एस्ट्राडियोल उपचार 30,31 के माध्यम से मद चरण में निरंतर कर रहे हैं प्रदर्शन किया है। यदि यह घटना भी जीबीएस के साथ योनि उपनिवेशवाद के दौरान हुई निर्धारित करने के लिए, जीबीएस हठ दोहराया β-एस्ट्राडियोल उपचार के दौरान नजर रखी थी। निरंतर मद, सीडी 1 चूहों में जीबीएस A909 (अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह, ATCC # मिमियाना-1138) हठ पदोन्नत 90% बसाना 2 सप्ताह बाद टीका (चित्रा 3) के साथ। Β-एस्ट्राडियोल टीका करने से पहले की एक खुराक के साथ एक ठेठ प्रयोग में, चूहों का केवल 40-50% एक सप्ताह बाद टीका (चित्रा 4) उपनिवेश थे। मतलब जीबीएस CFU इन चूहों से बरामद उपनिवेशवाद का प्रतिशत (चित्रा 3 बी) mimics। इन परिणामों स्वतंत्र प्रयोगों, इन आंकड़ों राक्षसों से प्राप्त किया गया है हालांकिtrate कि निरंतर मद बनाए रखने सीडी 1 चूहों के बहुमत में जीबीएस योनि दृढ़ता को बढ़ावा देता है।

विभिन्न मानव जीबीएस आइसोलेट्स का उपयोग कर बसाना प्रयोगों का आयोजन करते हैं, यह देखा गया है कि उपभेदों सीडी 1 चूहों में जारी रहती है, कई दिनों से एक महीने से परे को लेकर उनकी क्षमता में विविध। के तनाव परीक्षण किया है, एनसीटीसी 10/84 कम से कम अवधि, A909 था और COH1 एक से दो सप्ताह के लिए बनी है, जबकि तनाव CJB111 (डेटा) नहीं दिखाया दो सप्ताह (चित्रा 4) और के लिए चूहों के बहुमत में कायम भी एक महीने से परे । तिथि करने के लिए, वहाँ सीरोटाइप और माउस योनि मार्ग में जारी रहती है करने की क्षमता का कोई मनाया सहसंबंध है; हालांकि, व्यक्तिगत जीबीएस प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण अंतर 25 सूचित किया गया है। कई जन्मजात और outbred माउस लाइनों उपनिवेश स्थापित करने जीबीएस की क्षमता भी जांच की गई थी। जीबीएस तनाव A909 outbred सीडी -1 में लगभग एक सप्ताह के लिए योनि मार्ग में कायमचूहों और जन्मजात FVB चूहों (चित्रा 5)। वैकल्पिक रूप से, जन्मजात BALB / सी और C57BL / 6 के बहुमत एक सप्ताह (चित्रा 5) में उपनिवेश और एक महीने के लिए या परे (डेटा) नहीं दिखाया उपनिवेश बने थे।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, विवो में जीबीएस योनि बसाना एक प्लाज्मिड GFP व्यक्त जीबीएस तनाव के साथ चूहों inoculating और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए ऊतक को इकट्ठा करके कल्पना की गई थी। GFP-जीबीएस दोनों योनि उपकला (चित्रा 6A) और अन्य देशी योनि वनस्पति (चित्रा 6B) के करीब निकटता में murine का पालन करने का पता चला था। कोई GFP संकेत चूहों कि ऊतक संग्रह के बार में GFP-जीबीएस को मंजूरी दी थी में पाया गया था (डेटा) नहीं दिखाया।

आकृति 1
चित्रा 1: बेदाग Murine योनि पानी से धोना द्रव से मद की स्टेज की पहचान करना। (ए) Proestrus: प्रचुर मात्रा में केन्द्रक स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (काला तीर)। (बी) के मद: प्रचुर मात्रा में श्रृंगित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (नीले तीर)। (सी) Metestrus: केन्द्रक और श्रृंगित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं का मिश्रण है और मुख्य रूप से ल्यूकोसाइट्स (ग्रे तीर)। (डी) Diestrus: प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स। बढ़ाई = 100X, पैमाने बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: estrous स्टेज प्रभावों योनि जीबीएस की दृढ़ता। सीडी 1 चूहों का प्रतिशत समय के साथ 1 × 10 7 CFU जीबीएस A909 के साथ उपनिवेश। चूहे वर्गीकृत किया गया (एन = 7 - 11 / समूह) जीबीएस टीका के समय में estrous मंच पर आधारित है, के रूप में योनि पानी से धोना द्वारा निर्धारित तरल पदार्थ। एक स्वतंत्र प्रयोग दिखाया गया है। यह आंकड़ा पहले प्रकाशित काम से संशोधित किया और अनुमति के साथ reprinted 19 कर दिया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: β-estradiol के साथ जारी रखा उपचार जीबीएस योनि हठ को बढ़ावा देता है। प्रतिशत उपनिवेश (ए) या CFU सीडी 1 चूहों (एन = 10) 1 × 10 7 CFU जीबीएस A909 के साथ टीका और β-एस्ट्राडियोल उपचार पर बनाए रखा का (बी) बरामद किए। चूहे 5 के बाद टीका एक दिन जीबीएस टीका करने से पहले और 1 दिन, 3 पर β-estradiol के साथ इंजेक्शन थे, और। एक स्वतंत्र प्रयोग दिखाया गया है। (बी) में लाइन बरामद CFU मतलब प्रतिनिधित्व करता है। 708fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: जीबीएस खींच योनि मार्ग में जारी रहती है उनकी क्षमता में मतभेद है। Outbred सीडी 1 चूहों (एन = 10 / समूह) दिया जीबीएस स्ट्रेन के 1 × 10 7 CFU साथ β-estradiol की एक खुराक एक दिन जीबीएस टीका करने से पहले इंजेक्शन के साथ किया गया। प्रत्येक तनाव प्रयोगों के साथ स्वतंत्र रूप से बाहर किए गए और कम से कम तीन बार दोहराया गया था; एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है। यह आंकड़ा पहले प्रकाशित काम से संशोधित किया और अनुमति के साथ reprinted 25 कर दिया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5: माउस उपभेदों उनकी क्षमता में अलग योनि मार्ग में जीबीएस के साथ उपनिवेश होने के लिए। संकेत दिया पृष्ठभूमि तनाव से चूहे 1 × 10 7 CFU जीबीएस की A909 के साथ β-estradiol की एक खुराक टीका करने के लिए एक दिन पहले के साथ इंजेक्शन थे। प्रत्येक तनाव प्रयोगों के साथ स्वतंत्र रूप से बाहर किए गए और कम से कम दो बार दोहराया गया था; एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: माउस योनि पथ के भीतर जीबीएस के फ्लोरोसेंट इमेजिंग। GFP- के दृश्य बढ़ाई योनि उपकला साथ जीबीएस (हरा) व्यक्त = 630X, पैमाने बार = 50 माइक्रोन (ए), और करीब निकटता में endogenou करने के लिएबढ़ाई रों योनि रोगाणुओं = 1,000X, पैमाने बार = 20 माइक्रोन (बी)। ब्लू दाग = DAPI। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: जीबीएस खींच और माउस लाइनों योनि औपनिवेशीकरण अध्ययन के लिए उपयोग का संकलन। जीबीएस पृष्ठभूमि में तनाव, माउस लाइनों, और β-estradiol की खुराक संकेत कर रहे हैं। मॉडल इस काम में वर्णित का उपयोग अध्ययन ग्रे में डाला जाता है।

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Discussion

दोनों मेजबान के संदर्भ में मेजबान और अन्य रोगाणुओं के साथ जीबीएस बातचीत की समझ की उन्नति आगे बढ़ाने के लिए एक पशु मॉडल की आवश्यकता है। इस काम के चूहों में जीबीएस योनि उपनिवेशवाद की स्थापना के तकनीकी पहलुओं का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल anesthetics के उपयोग बैक्टीरिया टीका लगाना या inoculum गाढ़ा करने, योनि पूर्व धोने, या additives बसाना सक्षम करने के लिए झाड़ू नमूने, प्रतिरक्षा दबाने इकट्ठा करने के लिए बिना चूहों के> 90% बसाना प्राप्त होता है। इसके अलावा, इस मॉडल मजबूत reproducibility, दोनों जीबीएस हठ की लंबाई और बैक्टीरियल बोझ में मामूली अंतर-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के साथ दर्शाता है। इस अध्ययन में प्रदर्शन प्रतिनिधि परिणाम स्वतंत्र प्रयोगों के संकलन कर रहे हैं और भविष्य की प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए एक संदर्भ होना चाहिए; हालांकि, जीबीएस तनाव और माउस लाइनों के पार प्रत्यक्ष तुलना देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।

यह मॉडल मानव colonizati mimicsचूहों के उस श्लैष्मिक योनि जीबीएस उपनिवेशन में प्रजनन पथ के लिए प्रतिबंधित किया गया लगता है। हालांकि गर्भाशय ग्रीवा और गर्भाशय में उदगम 25 उपभेदों कई जीबीएस के साथ देखा गया है, चूहे, रुग्णता या मृत्यु दर के लक्षण प्रदर्शित नहीं करते उपनिवेशवाद के महीनों के बाद भी। इसके अलावा, जीबीएस पर निर्भर करता है और माउस उपभेदों का अध्ययन किया, चूहों लगातार या क्षणिक योनि बसाना, जो बैक्टीरिया कारकों का अध्ययन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मेजबानी क्रमश: के लिए उपयोगी है प्रदर्शित करते हैं। इस मॉडल में, कुछ चूहों रुक-रुक कर बसाना प्रदर्शित; यह वर्तमान में अज्ञात है कि क्या चूहों बाद में समय बिंदुओं पर recolonized हो जाते है या उपनिवेशवाद पता लगाने की सीमा, आम तौर पर 50 से 100 CFU करने के लिए, कुछ समय बिंदुओं पर से नीचे गिरता है। ध्यान से, चूहों के बीच संचरण जब उपनिवेश और गैर-उपनिवेश चूहों को एक साथ कई हफ्तों से अधिक रखे जाते हैं मनाया नहीं किया गया है (डेटा) नहीं दिखाया।

इस पद्धति का एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चयनात्मक और अंतर माध्यम का उपयोग करताजीबीएस माउस बैक्टीरियल बोझ यों के लिए। जीबीएस के रूप में उज्ज्वल गुलाबी या चमकीला गुलाबी कालोनियों कि ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद आसानी से दिखाई दे रहे हैं बढ़ता है। यह मीडिया रक्त अगर और ग्रेनेडा मध्यम 32 सहित अन्य मीडिया, की तुलना में जीबीएस का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता को दिखाया गया है, और लेटेक्स मनका समूहन परीक्षण के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है इस बात की पुष्टि करने के लिए जीबीएस नैदानिक आइसोलेट्स 18। इस अध्ययन में, गैर जीबीएस से उज्ज्वल गुलाबी या चमकीला गुलाबी कालोनियों उपनिवेश चूहों बरामद किया गया कभी नहीं किया है। कुछ अंतर्जात वनस्पतियों, आम तौर पर उदर प्रजातियों, नीले रंग की कालोनियों के रूप में विकसित होगा, और कुछ कालोनियों, सफेद, भूरे, या बहुत गुलाबी रंग पीला दिखाई देगा। महत्वपूर्ण बात है, प्लेटें ऊष्मायन के 18 से 24 घंटे के बाद गिना जाना चाहिए, गैर जीबीएस कालोनियों यदि इनक्यूबेटर में या लंबी अवधि के लिए benchtop पर छोड़ दिया गुलाबी वर्णक को शामिल कर सकते हैं। हम देखा है जैसा कि पहले बताया जा चुका है 32, कि कुछ एस प्योगेनेस वियोजन CHROMagar StrepB पर गुलाबी कालोनियों के रूप में होगा, लेकिन इन गolonies आम तौर पर जीबीएस कालोनियों की तुलना में छोटे होते हैं। एस प्योगेनेस इन अध्ययनों में चूहों की अंतर्जात योनि वनस्पति से अलग नहीं किया गया है, लेकिन इस अवलोकन भविष्य के काम में विचार किया जाना चाहिए।

परिणामों के बहुमत outbred सीडी -1 माउस लाइन है, जो पहले कुछ दिनों के भीतर के बाद टीका मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दर्शाता है, चूहों 19 के बहुमत में बाद में बैक्टीरियल मंजूरी के साथ से प्राप्त किया गया। दूसरों को भी अतिरिक्त जीबीएस उपभेदों का परीक्षण किया है और अब हठ बार 33,34 मनाया गया है। इस मॉडल के विकास के बाद से, अन्य समूहों के गर्भाशय में भ्रूण 34,38 के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 33,35, preventative उपचारों 36,37, और पारेषण के प्रभाव की जांच करने के लिए जीबीएस योनि उपनिवेशवाद के इसी तरह के माउस मॉडल विकसित करने के लिए शुरू कर दिया है। इन मतभेदों, कारकों की एक किस्म के द्वारा समझाया जा सकता है आनुवंशिक निर्धारकों है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और टी प्रभाव सहितवह मूल निवासी योनि वनस्पति की संरचना है। हम जीबीएस तनाव और संबंधित माउस लाइनों है कि जीबीएस योनि बसाना स्टडीज (1 टेबल) में तारीख करने के लिए अध्ययन किया गया है की एक सूची तैयार की है। पशु मॉडलों के साथ हाल ही के अध्ययन की संख्या जीबीएस रोगजनन अनुसंधान के क्षेत्र के भीतर ब्याज और मॉडल के इन प्रकार की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया।

योनि मार्ग के भीतर, श्लैष्मिक प्रतिरोधक क्षमता कसकर स्टेरॉयड हार्मोन 44, और β-estradiol की भी एक खुराक से नियंत्रित किया जाता है, इस मॉडल के रूप में वर्णित, मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया perturbs। फिर भी, वहाँ जीबीएस बसाना 19,25 के पहले कुछ दिनों के भीतर मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, सुझाव है कि प्रभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया काफी हद तक बरकरार हैं। मॉडल है कि बार-बार शामिल β-एस्ट्राडियोल इंजेक्शन जीबीएस योनि हठ को लम्बा खींच सकता है, के रूप में इस अध्ययन (चित्रा 3) में और दूसरों 33 के द्वारा प्रदर्शन किया। हालांकि, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रजनन पथ श्री बुशology अधिक चकित किया जा सकता है, परिणामों की व्याख्या करने के लिए मुश्किल बना रही है। महत्वपूर्ण बात है, मतभेद अलग जीबीएस भर में वर्णित आइसोलेट्स और इस अध्ययन में माउस उपभेदों निरंतर मद के मॉडल के दौरान बदला जा सकता है और भविष्य के काम में जांच की जानी चाहिए। ध्यान से, न मद मंच है और न ही जीबीएस सीरोटाइप एक चूहे मॉडल 22 में योनि उपनिवेशवाद पर असर पड़ा। इसके अतिरिक्त, 3.6 4.5 करने के लिए 45 वर्ष की मानव अम्लीय योनि पीएच काफी 6.5 46 से अधिक तटस्थ murine योनि पीएच, जो प्रभाव हो सकता है जीबीएस जीन अभिव्यक्ति और औपनिवेशीकरण के लिए योगदान कारकों बाद से अलग है। अन्त में, देशी योनि वनस्पति मानव योनि वनस्पति ले जाने gnotobiotic चूहों में जीबीएस उपनिवेशवाद की जांच करनी चाहिए मानव और murine मॉडल समकक्षों, और भविष्य के काम के बीच अलग है।

सारांश में, इन अध्ययनों मेजबान और बैक्टीरियल कारकों है कि सरकार जीबीएस योनि उपनिवेशवाद की जांच करने की मांग की है। जाहिर है, जीबीएस योनि कर्नल के मजबूत, नवीन पशु मॉडलइस काम में विकसित onization एक विवो योनि वातावरण में जटिल मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत का वर्णन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। जानकारी इस मॉडल से प्राप्त पहले से ही बहुत मेजबान प्रतिरक्षा घटकों और विशिष्ट जीबीएस जीन है कि जीबीएस योनि हठ पर नियंत्रण के ज्ञान में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, इन परिणामों के अतिरिक्त प्रश्न उठाया है और उपन्यास चिकित्सा के आगे विकास मातृ जीबीएस योनि उपनिवेशवाद और नवजात के बाद के जोखिम को सीमित करने के लिए उपयोगी हो जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

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