Summary
Lo scopo di questo protocollo è di imitare gruppo umano B Streptococcus (GBS) la colonizzazione vaginale in un modello murino. Questo metodo può essere usato per studiare risposta immunitaria e fattori batterici contribuiscono GBS persistenza vaginale, nonché per testare strategie terapeutiche.
Abstract
Streptococcus agalactiae (streptococco di gruppo B, GBS), è un Gram-positivi, colonizzatore asintomatico del tratto gastrointestinale umano e del tratto vaginale del 10 - 30% degli adulti. Negli individui immunocompromessi, compresi i neonati, donne incinte e gli anziani, GBS può passare a un patogeno invasivo provocando sepsi, artrite, polmonite e la meningite. Perché GBS è un batterio patogeno leader di neonati, la profilassi corrente è composto di uno screening in ritardo di gestazione per GBS colonizzazione vaginale e la successiva terapia antibiotica peri-parto delle madri GBS-positivi. Heavy GBS onere vaginale è un fattore di rischio per entrambe le malattie neonatali e la colonizzazione. Purtroppo, poco si sa circa l'host e fattori batterici che incoraggiare o consentire GBS colonizzazione vaginale. Questo protocollo descrive una tecnica per stabilire persistente GBS colonizzazione vaginale utilizzando un unico β-estradiolo pre-trattamento e campionamento giornaliero per stabilire loa battericad. La comunicazione precisa inoltre particolari metodi per somministrare terapie o reagenti di interesse aggiuntivi e per raccogliere vaginale liquido di lavaggio e tessuti dell'apparato riproduttivo. Questo modello di topo favorirà la comprensione dell'interazione GBS-host all'interno dell'ambiente vaginale, che porterà a potenziali bersagli terapeutici per il controllo materno colonizzazione vaginale durante la gravidanza e per prevenire la trasmissione al neonato vulnerabili. Sarà anche essere di interesse per aumentare la nostra comprensione delle interazioni generali batterico-ospite nel tratto vaginale femminile.
Introduction
Streptococcus agalactiae, streptococco di gruppo B (GBS), è un incapsulato batterio Gram-positivi che spesso viene isolato dal intestino e tratto genito-urinario degli adulti sani. Nel 1970, GBS è emerso come l'agente principale di mortalità neonatale infettiva, con oltre 7.000 casi di malattia neonatale all'anno 1. Precoce della malattia di GBS (EOD) si verifica nelle prime ore o giorni di vita, si pone come polmonite o distress respiratorio, e spesso si sviluppa in sepsi, mentre la malattia ad esordio tardivo (LOD) ne consegue dopo diversi mesi e si presenta con batteriemia, che spesso anticipi a meningite 2. A partire dal 2002, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie raccomanda lo screening universale per GBS colonizzazione vaginale a fine gestazione e la profilassi antibiotica intrapartum (IAP) per le madri GBS-positivi 1. Nonostante la riduzione della malattia ad esordio precoce a circa 1.000 casi negli Stati Uniti ogni anno a causa di IAP,GBS rimane la principale causa di sepsi neonatale ad esordio precoce e tardiva comparsa rimane inalterato 1. Sia in utero, durante il travaglio, o anche nei casi ad esordio tardivo, l'esposizione neonatale a GBS richiede la sopravvivenza, trasversale attraverso una serie di ambienti e barriere di accoglienza, evasione immune, e, nel caso di meningite, attraversamento del sangue- altamente regolamentato encefalica 2. A monte di queste interazioni virulenti nel neonato è la colonizzazione iniziale del tratto vaginale materno. Materna GBS tassi di colonizzazione vaginale vanno 8-18% nei paesi sviluppati e in via di sviluppo, con un tasso medio stimato del 12,7% 3,4. GBS colonizzazione del tratto vaginale durante la gravidanza può essere costante, intermittente, o di natura transitoria tra singole donne 5. È interessante notare che, a materni di età> 36 anni è associata con la colonizzazione persistente 6. Numerosi fattori di rischio biologici e socio-economici per la colonizzazione GBS vaginaleè stato identificato. Fattori biologici includono gastrointestinale colonizzazione GBS e l'assenza di Lactobacillus all'interno dell'intestino. Tuttavia, l'etnia, l'obesità, l'igiene e l'attività sessuale sono stati anche associati con GBS trasporto vaginale 7.
Anche se noti per causare infezioni neonatali, GBS provoca anche una varietà di infezioni materne sia peri-parto e dopo il parto. GBS carrello viene aumentata in donne che presentano una vaginiti 8 e, in alcuni casi, può anche essere l'entità della malattia 9. Inoltre, GBS ascensione del tratto riproduttivo durante la gravidanza può causare infezioni intra-amniotico o corionamnionite 10. Inoltre, fino al 3,5% delle gravidanze, GBS diffonde alla vescica urinaria per provocare una infezione delle vie urinarie o batteriuria asintomatica 11. bacteriuria GBS durante la gravidanza è associato ad un aumentato rischio di febbre intrapartum, corionamnionite, parto prematuro, e premature rottura delle membrane 12. Presi insieme, la presenza di GBS nel tratto vaginale è legata ad infezioni di più tessuti dell'ospite, e la capacità di eliminare GBS da questa nicchia è fondamentale per la salute materna e neonatale.
Fino a poco tempo, la maggior parte del lavoro esaminare interazioni GBS con il tratto cervicovaginale era limitato a modelli cellulari in vitro 13-15. Questi esperimenti in vitro hanno rivelato fattori batterici che sono importanti per l'adesione, tra cui proteine di superficie come una pili e ricco di serina ripete 17,18, così come i sistemi di regolazione a due componenti 15,19 e la risposta trascrizionale globale dell'epitelio vaginale GBS 19. Tuttavia, per chiarire completamente le interazioni ospite-microbo all'interno del tratto vaginale, un modello animale robusto è necessario. I primi lavori hanno dimostrato che GBS può essere recuperato dal tratto vaginale di topi inoculati 20,21 e ratti <sup> 22 sia in condizioni di gravidanza e non gravide. Nel 2005, a breve termine la colonizzazione GBS vaginale è stato modellato nei topi per esaminare l'efficacia di un enzima fago litico per il trattamento di GBS vaginale nel corso di un periodo di 24 ore 23. Diversi anni dopo, un modello di topo GBS colonizzazione vaginale a lungo termine è stato sviluppato per studiare i fattori di accoglienza e batteriche che disciplinano GBS persistenza. Questo modello ha identificato numerosi fattori che contribuiscono alla GBS colonizzazione, comprese le appendici superfici 17,18 e GBS sistemi a due componenti 19,24. Questo modello ha contribuito alla identificazione dei meccanismi di risposta dell'ospite 19,25 ed è stato utilizzato per testare diverse strategie terapeutiche, tra cui peptidi immunomodulatori 26 e probiotici 27. Questo protocollo fornisce le indicazioni necessarie per inoculare GBS nel tratto vaginale mouse e per monitorare successivamente colonizzazione e raccogliere campioni per ulteriori analisi.
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Protocol
Tutto il lavoro animale è stato approvato dall'Ufficio di Lab Animal Care a San Diego State University e condotta sotto gli standard veterinari riconosciuti. Topi femmina, età 8 - 16 settimane, sono stati utilizzati per lo sviluppo di questo metodo.
1. Preparazione e intraperitoneale Iniezione di β-estradiolo
- Misurare β-estradiolo (0,5 mg / topo) su carta pesare indossando dispositivi di protezione adeguati (DPI). ATTENZIONE: β-estradiolo può essere assorbito attraverso la pelle e delle mucose.
- Trasferire β-estradiolo in una provetta conica da 15 ml e vortex fino a quando tutti i grumi vengono rimossi e la β-estradiolo è una polvere fine. Elaborare olio di sesamo (100 ml / topo) in una siringa da 10 ml. Siringa-filtro olio di sesamo nel tubo conico da 15 ml contenente il β-estradiolo usando un filtro da 0,45 micron. Agitare la provetta conica da 15 ml fino alla β-estradiolo è una sospensione omogenea in olio di sesamo.
- Elaborare il beta-essospensione tradiol in una nuova siringa da 10 ml. Con 18 G, 1-in. ago, un'aliquota 100 ml di sospensione in siringhe tubercolina da 1 ml. Preparare una siringa per ogni mouse. Mettere un nuovo, sterile, 26 G, ½-in. ago su ogni siringa da tubercolina.
- Somministrare 0,5 mg di β-estradiolo sospesa in 100 ml di olio di sesamo (5 mg / ml) per ciascun topo 24 ore prima dell'inoculo batterico. Iniettare ogni topo all'interno della cavità peritoneale, nei quadranti addominali inferiori, appena a destra oa sinistra della linea mediana, come descritto in precedenza 28.
NOTA: Nessuna pulizia o clipping del sito di iniezione è necessaria.
2. vaginale inoculazione con GBS
- Un giorno prima dell'inoculo, crescere a 5 ml coltura liquida durante la notte di un ceppo GBS di interesse, come la A909 (sierotipo Ia), in Todd Hewitt Broth (THB) a 37 ° C.
- Sottocultura cultura overnight GBS a volume 01:10 in THB fresca e incubare a 37 ° C. Far crescere labatteri agli fase di mid-log (OD 600 = 0,4-0,5). NOTA: Questo genere prendere 2 - 3 ore, a seconda del ceppo di GBS.
- Trasferire la sottocultura di una sterile batteri tubi e pellet coniche 15 ml a 3.000 × g per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet batterico in 200 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
- Utilizzando il pellet risospeso, portare 3 - 5 ml di PBS (1 ml per 10 topi) esattamente OD 600 = 0.4 in un nuovo tubo 5 ml cultura. Questo sarà una concentrazione di ~ 1 × 10 8 unità formanti colonie (CFU) / ml. Trasferimento a un nuovo tubo conico da 15 ml e ri-pellet i batteri a 3.000 × g per 5 min. Aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet in PBS a 1/10 del volume originale. Ad esempio, se 3 ml di OD 600 = 0.4 è stato pellettati, poi risospendere in 300 ml di PBS. NOTA: Questa è la sospensione finale batterica (~ 1 × 10 9 CFU / ml) utilizzato per l'inoculazione animale.
- Reserve 50 ml di questa sospensione per la diluizione di serie e placcatura in THB agar per determinare l'inoculo esatto.
- Inoculare ogni topo con 10 microlitri della sospensione batterica finale in modo che 1 × 10 7 CFU viene somministrato a ciascun topo.
- Per inoculare, trattenere il mouse manualmente, garantendo la pelle floscia alla collottola tra il pollice del gestore e l'indice e quindi immobilizzare la coda, come descritto in precedenza 28.
- Redigere 10 ml di GBS previste al punto 2.6 in un gel da 200 ml punta di carico della pipetta. Inserire la punta da 5 a 10 mm nel lume vaginale e dispensare i 10 ml di inoculo.
NOTA: punte di carico gel sono preferite rispetto alle normali punte di 200 microlitri per ridurre al minimo il rischio di traumi o lesioni d'organo, in particolare nei topi più giovani o più piccoli. - Subito dopo l'inoculazione, rilasciare la collottola ed elevare la fine posteriori del mouse, sollevando il mouse per la coda e walking le zampe anteriori su una superficie dura per ~ 1 min.
- Visivamente l'apertura vaginale per qualsiasi riflusso di inoculo. Se si osserva riflusso, un puntale per pipetta può essere usato per manipolare o ingrandire l'apertura vaginale, facilitando l'assorbimento del riflusso nel lume. Inoltre, riflusso può essere aspirato tramite pipetta e ri-inoculato.
NOTA: Se la somministrazione di agenti topici, organismi probiotici, o proteine di interesse, un volume fino a 20 ml in un buffer fisiologica può essere dato nel tratto vaginale.
3. tamponamento la Lumen vaginale per quantificare GBS carico
- Preparare una micro-centrifuga tubo da 1,5 ml per il mouse con l'aggiunta di 100 ml di PBS. Appena prima di tampone, pre-bagnare il tampone in PBS.
- Trattenere il mouse come descritto al punto 2.7.1 e inserire il tampone 10 mm nel lume vaginale. Ruotare delicatamente il tampone 4 volte in senso orario e 4 volte in senso antiorario, esercitando una leggera pressione sulla parete vaginale.
- Trasferire il tampone per la provetta da 1,5 ml con 100 ml di PBS. Prima di placcatura, vortex la provetta per ~ 15 sec per rilasciare i batteri dal tampone. In serie diluire ogni campione in PBS e la piastra di 20 ml di diluizioni 1:10 attraverso 1: 10.000 su piastre di agar differenziale medio preparati secondo le istruzioni del produttore. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 ore. colonie GBS appariranno sia rosa brillante o malva a colori. Altri flora endogena saranno inibiti, o appariranno come colonie blu, bianco, o grigio.
4. Raccogliere fluido vaginale Lavage
- Trattenere il mouse come descritto al punto 2.7.1. Utilizzando un 200 ml di gel di carico punta della pipetta, pipetta 20 ml di PBS nel lume vaginale. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 4 volte all'interno del lume, e poi ritirare l'intero volume nella stessa punta della pipetta. NOTA: Se il liquido di lavaggio è densa di muco, uno standard di 200 microlitri punta della pipettapuò essere utilizzato per raccogliere il liquido di lavaggio finale.
- Se il risparmio liquido di lavaggio per l'analisi delle citochine o CFU quantificazione, erogare in una provetta da 0,7 ml. Se la determinazione della fase di estro, erogare almeno 5 ml di liquido di lavaggio su un vetrino e osservare le cellule sotto ingrandimento 100X su un microscopio ottico. NOTA: Per esempi di stadi estro, si veda la Figura 1.
5. Tessuto Dissection e omogeneizzazione
- Per ogni mouse, preparare tre tubi da 2 ml con tappo a vite (una per ogni tessuto: vagina, cervice e utero). Riempire ogni provetta con ampi (0,4 - 0,5 g) 1,0 mm perline zirconia per coprire il fondo a forma conica del tubo.
- Autoclave provette preparate prima di raccogliere il tessuto per 30 minuti a 121 ° C, specialmente se quantificazione carica batterica. Aggiungere 500 ml di PBS sterile ad ogni provetta. Pesare ogni tubo dopo la sterilizzazione in autoclave e record per riferimento futuro per calcolare il peso dei tessuti recuperati.
- Sterilizzare le forbici con il 70% EtOH, pulire se necessario, e tagliare entrambe le corna uterine di media lunghezza tra il corpo dell'utero e delle ovaie. Utilizzando forbici e pinze, grassi separata viscerale, membrane, e la vescica urinaria lontano dal tratto riproduttivo, lo spostamento caudale.
- Sterilizzare le forbici come descritto al punto 5.4. Trasversalmente tagliare la vagina più vicino alla vulva come possibile separare il tratto riproduttivo dal corpo. Sollevare e rimuovere il tratto riproduttivo intatto e metterlo in una piastra di Petri sterile.
- Utilizzando un nuovo lama di rasoio, separare l'utero dalla cervice in un taglio trasversale. Sterilizzare la lama di un rasoio con il 70%EtOH, e quindi separare la cervice dalla vagina in un taglio trasversale. NOTA: Ci sarà una quantità minima di tessuto uterino ancora attaccato alla cervice. Ci sarà una quantità minima di tessuto vaginale ancora attaccato alla cervice.
- Utilizzando pinze sterili, trasferire singoli tessuti nelle loro rispettive provette da 2 ml contenenti PBS e omogeneizzazione perline. Pulire la pinza con il 70% EtOH tra gestione ogni tessuto.
- Pesare ciascuna 2 ml provetta con tappo a vite e sottrarre il peso iniziale del tubo per determinare il peso del tessuto. pesi tessuto variano tipicamente circa 20 - 100 mg. Strettamente sigillare le provette con tappo a vite e omogeneizzare i tessuti per 1 min alla massima velocità in un omogeneizzatore tessuto.
- Per quantificare carica batterica, in serie diluire 25 ml di omogenato tissutale e diluizioni piastra 01:10 attraverso 1: 10.000 su piastre agar differenziali. Incubare le piastre come descritto al punto 3.3. Per memorizzare i campioni per la quantificazione di citochine, congelare omogenati di tessuti a -20 ° C.
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Representative Results
Durante lo sviluppo di questo modello, sono state fatte diverse osservazioni per quanto riguarda i fattori che influenzano la durata della GBS colonizzazione vaginale. Per determinare fase estrale come ad impatti di inoculazione GBS persistenza batterica, i topi sono stati in scena il giorno della inoculazione mediante liquido di lavaggio vaginale. La Figura 1 illustra le quattro fasi del ciclo estrale mouse, come determinato da wet-montare liquido di lavaggio vaginale, un metodo consolidato 29. I topi sono stati divisi in gruppi in base a questa prima fase, e la persistenza GBS è stata monitorata nel corso del tempo attraverso swabbing vaginale. Topi inoculati nella fase proestrus furono colonizzate con GBS più di qualsiasi altra fase dell'estro, in particolare quelli diestrus al momento dell'inoculo (figura 2). Sulla base di questi risultati, nel modello attuale, i topi sono trattati con β-estradiolo un giorno prima GBS inoculazione al sincronizzarli nella fase proestrus. Altri modelli murini di infezioni dell'apparato riproduttivo hanno dimostrato una maggiore capacità dell'organismo patogeno di persistere quando i topi sono sostenuti in fase di estro attraverso un trattamento esogeno estradiolo 30,31. Per determinare se questo fenomeno si è verificato anche durante la colonizzazione vaginale con GBS, GBS persistenza è stata monitorata durante il trattamento β-estradiolo ripetuto. Estro sostenuta promosso GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC # BAA-1138) la persistenza in topi CD-1, con il 90% colonizzazione 2 settimane post-inoculazione (Figura 3A). In un tipico esperimento con una dose di β-estradiolo prima dell'inoculo, solo il 40-50% dei topi furono colonizzate una settimana dopo-inoculazione (Figura 4). La media GBS CFU recuperato da questi topi imita la percentuale di colonizzazione (Figura 3B). Anche se questi risultati sono stati ottenuti da esperimenti indipendenti, questi dati demonitrate che il mantenimento estro continuo promuove GBS persistenza vaginale nella maggior parte dei topi CD-1.
Mentre conducendo esperimenti colonizzazione con diverso umana GBS isolati, è stato osservato che ceppi variavano nella loro capacità di persistere in topi CD-1, che vanno da alcuni giorni a oltre un mese. Dei ceppi testati, NCTC 10/84 ha il minor tempo, A909 e COH1 persisteva per una o due settimane, mentre ceppo CJB111 persisteva nella maggior parte dei topi per due settimane (Figura 4) e anche oltre un mese (dati non mostrati) . Fino ad oggi, non vi è stata alcuna correlazione osservata di sierotipo e capacità di persistere nel tratto vaginale del mouse; tuttavia, differenze significative tra i singoli ceppi GBS sono stati segnalati 25. La capacità di GBS di colonizzare più linee del mouse consanguinee e outbred stato anche esaminato. GBS ceppo A909 persisteva nel tratto vaginale per circa una settimana in outbred CD-1topi e topi FVB inbred (Figura 5). In alternativa, la maggioranza dei inbred BALB / ce C57BL / 6 sono stati colonizzata una settimana (figura 5) ed è rimasto colonizzati per un mese o oltre (dati non mostrati).
Usando questo protocollo, la colonizzazione GBS vaginale in vivo è stato visualizzato inoculando i topi con un plasmide GFP che esprimono ceppo GBS e la raccolta dei tessuti per la microscopia a fluorescenza. GFP-GBS è stato rilevato sia aderente alla murine dell'epitelio vaginale (Figura 6A) e in prossimità di altri flora vaginale nativi (figura 6b). Nessun segnale GFP è stato rilevato nei topi che avevano eliminato la GFP-GBS al momento della raccolta dei tessuti (dati non riportati).
Figura 1: Identificare la fase di estro da non colorati murino Vaginale Lavage Fluid. (A) proestrus: abbondanti nucleate squamose cellule epiteliali (frecce nere). (B) Estrus: abbondanti cornified squamose cellule epiteliali (frecce blu). (C) Metestrus: miscela di cellule epiteliali squamose nucleate e cornified e prevalentemente leucociti (frecce grigie). (D) Diestrus: abbondanti leucociti. Ingrandimento = 100X, barra della scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: estrale fase impatti Vaginale Persistenza di GBS. Percentuale di CD-1 nei topi colonizzata con 1 × 10 7 CFU GBS A909 nel corso del tempo. I topi sono stati raggruppati (n = 7 - 11 / gruppo) basato sulla fase estrale al momento del GBS inoculazione, come determinato da lavanda vaginale fluido. è mostrato un esperimento indipendente. Questa cifra è stata modificata dal lavoro precedentemente pubblicato e ristampato con il permesso 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la continuazione del trattamento con β-estradiolo promuove GBS vaginale persistenza. Percentuale colonizzato (A) o recuperato CFU (B) di topi CD-1 (n = 10) inoculati con 1 × 10 7 CFU GBS A909 e mantenuti sul trattamento β-estradiolo. I topi sono stati iniettati con β-estradiolo un giorno prima GBS inoculazione e nei giorni 1, 3 e 5 post-inoculazione. è mostrato un esperimento indipendente. La linea a (B) rappresenta significano recuperato CFU. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: GBS ceppi differiscono nella loro capacità di persistere nel tratto vaginale. Outbred topi CD-1 (n = 10 / gruppo) sono stati iniettati con una singola dose di β-estradiolo un giorno prima GBS inoculazione con 1 × 10 7 UFC di dato ceppi GBS. Esperimenti con ciascun ceppo sono state effettuate indipendentemente e sono stati ripetuti almeno tre volte; un risultato rappresentativo è mostrato. Questa cifra è stata modificata dal lavoro precedentemente pubblicato e ristampato con il permesso 25. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5: Mouse ceppi differiscono nella loro capacità di essere colonizzati con GBS nel tratto vaginale. Topi da sfondo ceppi indicati sono stati iniettati con una singola dose di β-estradiolo un giorno prima dell'inoculo con 1 × 10 7 UFC di GBS A909. Esperimenti con ciascun ceppo sono state effettuate indipendentemente e sono stati ripetuti almeno due volte; un risultato rappresentativo è mostrato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Imaging fluorescente del GBS all'interno del mouse vaginale Tract. Visualizzazione di GFP esprimere GBS (verde) lungo l'epitelio vaginale con ingrandimento = 630X, barra della scala = 50 micron (A), e in prossimità di endogenous microbi vaginali a ingrandimenti = 1,000X, barra della scala = 20 micron (B). Blu macchia = DAPI. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Raccolta di GBS Ceppi e linee di topi utilizzati per Vaginale colonizzazione Studies. GBS sfondo ceppi, le linee del mouse, e il dosaggio di β-estradiolo sono indicati. Gli studi che utilizzano il modello descritto in questo lavoro sono evidenziate in grigio.
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Discussion
Per promuovere l'avanzamento della comprensione delle interazioni GBS con lo sia l'host e altri microbi nell'ambito dell'ospite, è necessario un modello animale. Questo lavoro descrive gli aspetti tecnici di stabilire GBS colonizzazione vaginale nei topi. Questo protocollo raggiunge> 90% colonizzazione topi senza l'uso di anestetici per inoculare i batteri o per raccogliere campioni di tampone, immuno-soppressori per consentire la colonizzazione, vaginale prelavaggio, o additivi per addensare l'inoculo. Inoltre, questo modello dimostra riproducibilità robusto, con modesta variabilità inter-sperimentale sia la lunghezza del GBS persistenza e la carica batterica. I risultati rappresentativi dimostrato in questo studio sono la compilazione di esperimenti indipendenti e dovrebbe essere un punto di riferimento per il futuro disegno sperimentale; tuttavia, attraverso confronti diretti ceppi GBS e linee del mouse devono essere effettuate con cura.
Questo modello riproduce colonizati umaniin quella della mucosa vaginale GBS colonizzazione dei topi sembra essere limitato al tratto riproduttivo. Anche se l'ascensione nella cervice e l'utero è stato osservato con più GBS ceppi 25, i topi non mostrano segni di morbilità o mortalità, anche dopo mesi di colonizzazione. Inoltre, a seconda del GBS e ceppi di topi studiato, topi mostrano colonizzazione vaginale coerente o transitorio, che è utile per studiare fattori batterici e risposta immunitaria, rispettivamente. In questo modello, alcuni topi mostrano colonizzazione intermittente; è attualmente noto se i topi diventano ricolonizzato in momenti successivi o se la colonizzazione scende al di sotto del limite di rilevazione, tipicamente 50 a 100 CFU, in certi momenti. Da segnalare, la trasmissione tra i topi, non è stato osservato quando colonizzati e topi non-colonizzato sono alloggiati insieme per diverse settimane (dati non riportati).
Questo metodo utilizza un terreno selettivo e differenziale disponibile in commercioper GBS quantificare topo oneri batteriche. GBS cresce rosa o malva colonie come brillanti che sono facilmente visibili dopo 24 ore di incubazione. Questo supporto è stato dimostrato di avere una maggiore sensibilità per la rilevazione GBS rispetto ad altri media, tra cui agar sangue e Granada media 32, ed è stato utilizzato in combinazione con i test di agglutinazione tallone lattice per confermare GBS isolati clinici 18. In questo studio, brillante rosa o malva colonie da non GBS colonizzato i topi non sono mai stati recuperati. Alcuni flora endogena, tipicamente specie Enterococcus, cresceranno come colonie blu, e alcune colonie appariranno rosa bianco, grigio, o molto pallido. È importante sottolineare che, piastre devono essere contati dopo il 18 a 24 ore di incubazione, come le colonie non GBS possono incorporare il pigmento rosa se lasciato in incubatrice o sul banco per periodi più lunghi. Abbiamo osservato, come è stato riferito in precedenza 32, che alcuni S. pyogenes isolati saranno formare colonie rosa su CHROMagar StrepB, ma questi colonies sono in genere più piccolo di colonie GBS. S. pyogenes non è stata isolata dalla flora vaginale endogene di topi in questi studi, ma questa osservazione dovrebbe essere considerata in futuro lavoro.
La maggior parte dei risultati sono stati ottenuti dal outbred CD-1 linea di topi, che dimostra robuste risposte immunitarie innate entro i primi pochi giorni dopo l'inoculazione, con successiva liquidazione batterica nella maggior parte dei topi 19. Altri hanno anche testato una pressione supplementare GBS e hanno osservato più volte la persistenza 33,34. Dal momento che lo sviluppo di questo modello, altri gruppi hanno cominciato a sviluppare modelli murini simili di GBS colonizzazione vaginale per esaminare l'impatto della risposta immunitaria 33,35, terapie preventive 36,37, e la trasmissione al feto in utero 34,38. Queste differenze possono essere spiegate da una varietà di fattori, tra cui determinanti genetici che influenzano le risposte immunitarie e tegli composizione della flora vaginale nativi. Abbiamo compilato una lista dei ceppi GBS e le rispettive linee di topi che sono stati studiati fino ad oggi in GBS studi di colonizzazione vaginale (Tabella 1). Il numero di recenti studi con modelli animali evidenzia l'interesse e la necessità di questi tipi di modelli nel campo della ricerca patogenesi GBS.
All'interno del tratto vaginale, l'immunità mucosale è strettamente regolata dagli ormoni steroidei 44, e anche una dose di β-estradiolo, come descritto in questo modello, perturba la risposta immunitaria dell'ospite. Anche così, ci sono solide risposte immunitarie innate nei primi giorni di GBS colonizzazione 19,25, il che suggerisce che le risposte immunitarie colpite sono in gran parte intatta. Modelli che implicano ripetute iniezioni beta-estradiolo può prolungare GBS persistenza vaginale, come dimostrato in questo studio (figura 3) e da altri 33. Tuttavia, le risposte immunitarie e Physi tratto riproduttivoology può essere più confuso, rendendo i risultati difficili da interpretare. È importante sottolineare che le differenze tra i diversi descritti GBS isolati e ceppi di topi in questo studio può essere alterato durante modelli di estro sostenuta e devono essere esaminati in futuro lavoro. Da segnalare, né fase estro né GBS sierotipo influenzato la colonizzazione vaginale in un modello di ratto 22. Inoltre, l'acido pH vaginale umana di 3,6-4,5 45 differisce drasticamente dal più neutro pH vaginale murino di 6,5 46, che può incidere l'espressione genica GBS e successive fattori che contribuiscono alla colonizzazione. Infine, nativo flora vaginale è distinto tra gli esseri umani e le controparti modello murino, e il lavoro futuro dovrebbe esaminare GBS colonizzazione nei topi gnotobiotic trasportano flora vaginale umani.
In sintesi, questi studi hanno cercato di esaminare i fattori di accoglienza e batterici che governano la colonizzazione GBS vaginale. In primo luogo, il robusto, innovativo modello animale di GBS col vaginaleonization sviluppato in questo lavoro può essere utilizzato per descrivere complesse interazioni ospite-microbo in un ambiente vaginale in vivo. Le informazioni ottenute da questo modello è già notevolmente aumentato la conoscenza delle componenti immunitarie dell'ospite e specifici geni che controllano GBS GBS persistenza vaginale. Inoltre, questi risultati hanno sollevato ulteriori domande e sarà utile per un ulteriore sviluppo di nuove terapie per limitare materna GBS colonizzazione vaginale e successiva esposizione del neonato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sesame oil | Sigma Aldrich | S3547-250ML | |
| β-Estradiol | Sigma Aldrich | E8875-1G | CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. |
| 200 μl gel loading pipette tips | USA Scientific | 1252-0610 | |
| Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs | Puritan | 25-801 A 50 | |
| CHROMagar StrepB | DRG International | SB282 | |
| Todd Hewitt Broth | Hardy Diagnostics | 7161C | |
| 18 G, 1.5 inch needles | BD | 305199 | |
| 26 G, 0.5 inch needles | BD | 305111 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 1 ml syringes | BD | 309659 | |
| 0.45 μm PVDF syringe filters | Whatman | 6900-2504 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | 21-031-CV |
References
- Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
- Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
- Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
- Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
- Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
- Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
- Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
- Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
- Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
- Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
- Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
- Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
- Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
- Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
- Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
- Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
- Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
- Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
- Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
- Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
- Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
- Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
- Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
- Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
- Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
- Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
- Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
- Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
- Caligioni, C. S.
- Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
- Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
- Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
- Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
- Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
- Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
- Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
- Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
- Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
- Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
- Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
- Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).
