Summary
El objetivo de este protocolo es imitar grupo humano Streptococcus B (GBS) la colonización vaginal en un modelo murino. Este método se puede utilizar para investigar respuestas inmunes del huésped y factores bacterianos que contribuyen a la persistencia vaginal GBS, así como para poner a prueba estrategias terapéuticas.
Abstract
Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B, GBS), es un Gram-positivo, colonizador asintomática del tracto gastrointestinal humano y el tracto vaginal de 10 a 30% de los adultos. En individuos inmunocomprometidos, incluyendo los recién nacidos, mujeres embarazadas y ancianos, GBS puede cambiar a un patógeno invasivo que causa la sepsis, artritis, neumonía y meningitis. Debido a que el GBS es un patógeno bacteriano líder de los recién nacidos, la profilaxis actual se compone de detección final de la gestación para la colonización vaginal por EGB y el tratamiento con antibióticos periparto posterior de las madres GBS-positivas. carga vaginal abundante GBS es un factor de riesgo tanto para la enfermedad neonatal y la colonización. Por desgracia, poco se sabe acerca del anfitrión y los factores bacterianos que favorecer o permitir la colonización por GBS vaginal. Este protocolo describe una técnica para establecer persistente colonización vaginal GBS utilizando un β-estradiol solo pre-tratamiento y toma de muestras diariamente para determinar loa bacterianare. Aún más detalles métodos para administrar terapias o reactivos de interés adicionales y para recoger el líquido de lavado vaginal y los tejidos del tracto reproductivo. Este modelo de ratón será favorecer la comprensión de la interacción GBS-host dentro del ambiente vaginal, lo que conducirá a posibles dianas terapéuticas para controlar la colonización vaginal de la madre durante el embarazo y para prevenir la transmisión al recién nacido vulnerable. También será de interés para aumentar nuestra comprensión de las interacciones generales bacteriana en host en el tracto vaginal femenino.
Introduction
Streptococcus agalactiae, Streptococcus del grupo B (GBS), es una bacteria encapsulada, Gram-positiva que con frecuencia se aísla de los intestinos y el tracto genitourinario de adultos sanos. En la década de 1970, GBS surgió como el agente principal de mortalidad neonatal infecciosa, con más de 7.000 casos de la enfermedad neonatal por año 1. La aparición temprana de la enfermedad por EGB (EOD) se produce en las primeras horas o días de vida, surge como neumonía o dificultad respiratoria, y con frecuencia se desarrolla en la sepsis, mientras que la enfermedad de aparición tardía (LOD) sobreviene después de varios meses y se presenta con bacteriemia, que con frecuencia avanza a la meningitis 2. A partir de 2002, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades recomiendan el cribado universal de la colonización vaginal por EGB en el final de la gestación y la profilaxis antibiótica intraparto (IAP) para las madres GBS-positivas 1. A pesar de la reducción de la enfermedad de aparición temprana a aproximadamente 1.000 casos en los Estados Unidos anualmente debido a IAP,GBS sigue siendo la principal causa de sepsis neonatal de aparición temprana, y la aparición de inicio tardío no se ve afectada 1. Ya sea en el útero, durante el parto, o incluso en los casos de aparición tardía, la exposición neonatal a GBS requiere la supervivencia, transversal a través de una serie de entornos y barreras de acogida, la evasión inmune y, en el caso de meningitis, cruce de la sangre altamente regulado 2 barrera del cerebro. Aguas arriba de estas interacciones virulentas en el recién nacido es la colonización inicial del tracto vaginal maternal. Materna GBS las tasas de colonización vaginal varían de 8-18% en los países desarrollados y en desarrollo, con una tasa promedio estimado del 12,7% 3,4. GBS colonización del tracto vaginal durante el embarazo puede ser constante, intermitente, o de naturaleza transitoria entre las mujeres individuales 5. Curiosamente, a la edad materna> 36 años se asocia con la colonización persistente 6. Numerosos factores de riesgo biológicos y socio-económico para la colonización vaginal por EGBhan sido identificados. Los factores biológicos incluyen la colonización gastrointestinal GBS y la ausencia de Lactobacillus en el intestino. Sin embargo, el origen étnico, la obesidad, la higiene, y la actividad sexual también se han asociado con EGB 7 vaginal.
Aunque conocidos por causar infecciones neonatales, GBS también causa una variedad de infecciones maternas ambos periparto y posparto. GBS carro se incrementa en mujeres que se presentan con vaginitis 8 y, en algunos casos, incluso puede ser la entidad de la enfermedad 9. Además, GBS ascensión del tracto reproductivo durante el embarazo puede resultar en una infección intra-amniótica o corioamnionitis 10. Por otra parte, en un máximo de 3,5% de los embarazos, GBS difunde a la vejiga urinaria para causar una infección del tracto urinario o la bacteriuria asintomática 11. bacteriuria por GBS durante el embarazo se asocia con un mayor riesgo de fiebre intraparto, corioamnionitis, parto prematuro y premature rotura de las membranas 12. En su conjunto, la presencia de GBS dentro del tracto vaginal está vinculada a las infecciones de múltiples tejidos del huésped, y la capacidad de eliminar GBS de este nicho es imprescindible tanto para la salud materna y neonatal.
Hasta hace poco, la mayoría del trabajo de examinar las interacciones de GBS con el tracto cervicovaginal se limita a los modelos celulares in vitro 13-15. Estos experimentos in vitro han revelado factores bacterianos que son importantes para la adhesión, incluyendo proteínas de superficie Tal pili y rico en serina repite 17,18, así como los sistemas de regulación de dos componentes 15,19 y la respuesta transcripcional global del epitelio vaginal para GBS 19. Sin embargo, para dilucidar plenamente las interacciones huésped-microorganismo en el tracto vaginal, un modelo animal robusto es necesario. Los primeros trabajos demostraron que GBS se puede recuperar a partir del tracto vaginal de ratones inoculados 20,21 y ratas <sup> 22 en ambas condiciones embarazadas y no embarazadas. En 2005, a corto plazo la colonización vaginal por EGB se modeló en ratones para examinar la eficacia de una enzima del fago lítico realizar un tratamiento vaginal durante un período de 24 horas 23. Varios años más tarde, un modelo de ratón de GBS colonización vaginal de larga duración fue desarrollado para estudiar anfitrionas bacterianas y factores que regulan GBS persistencia. Este modelo ha identificado numerosos factores que contribuyen a la colonización por GBS, incluyendo apéndices superficiales 17,18 y sistemas de dos componentes de GBS 19,24. Este modelo ha contribuido a la identificación de los mecanismos de respuesta de acogida 19,25 y fue utilizado para probar varias estrategias terapéuticas, incluyendo péptidos inmunomoduladores 26 y 27 probióticos. Este protocolo da la orientación necesaria para inocular GBS en el tracto vaginal del ratón y posteriormente realizar un seguimiento de la colonización y recoger muestras para análisis posteriores.
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Protocol
Todos los animales de trabajo fue aprobado por la Oficina de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad Estatal de San Diego y lleva a cabo bajo las normas veterinarias aceptados. Los ratones hembra, edad 8 - 16 semanas, se utilizaron para el desarrollo de este método.
1. Preparación y la inyección intraperitoneal de β-estradiol
- Medir β-estradiol (0,5 mg / ratón) en un peso de papel mientras que use el equipo de protección personal (EPP) apropiado. PRECAUCIÓN: β-estradiol puede ser absorbido por la piel y las mucosas.
- Transferencia β-estradiol a un tubo cónico de 15 ml y agitar hasta que todos los grumos se eliminan y el β-estradiol es un polvo fino. Elaborar aceite de sésamo (100 l / ratón) en una jeringa de 10 ml. aceite de sésamo Jeringa-filtro en el tubo cónico de 15 ml que contiene la β-estradiol usando un filtro de 0,45-micras. Vortex el tubo cónico de 15 ml hasta que el β-estradiol es una suspensión homogénea en el aceite de sésamo.
- Elaborar los ß-EStradiol suspensión en una nueva jeringa de 10 ml. Con un 18 G, 1-in. aguja, alícuota de 100 l de la suspensión en jeringas de tuberculina de 1 ml. Preparar una jeringa para cada ratón. Colocar una nueva, estéril 26 G, ½ pulg. aguja en cada jeringa de tuberculina.
- Administrar 0,5 mg de la β-estradiol en suspensión en 100 l de aceite de sésamo (5 mg / ml) a cada ratón 24 hr antes de la inoculación bacteriana. Inyectar cada ratón dentro de la cavidad peritoneal, en los cuadrantes abdominales inferiores, justo a la derecha oa la izquierda de la línea media, como se ha descrito previamente 28.
NOTA: No hay limpieza o el recorte del sitio de la inyección es necesario.
2. La inoculación vaginal con GBS
- Un día antes de la inoculación, crecer un cultivo líquido durante la noche de 5 ml de una cepa de GBS de interés, tal como A909 (serotipo Ia), en caldo de Todd Hewitt (THB) a 37 ° C.
- Subcultura del cultivo de una noche de GBS en un volumen 1:10 en THB fresca y se incuba a 37 ° C. hacer crecer ellas bacterias hasta fase semilogarítmica (OD 600 = 0,4-0,5). NOTA: Esto normalmente tomar 2 - 3 horas, dependiendo de la cepa de GBS.
- Transferir el subcultivo en un tubo estéril bacterias y pellets cónicos de 15 ml a 3000 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento bacteriano en 200 l de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
- Utilizando el sedimento resuspendido, llevar 3 - 5 ml de PBS (1 ml por cada 10 ratones) exactamente a OD 600 = 0,4 en un nuevo tubo de cultivo de 5 ml. Esta será una concentración de 1 x 10 ~ 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml. Traslado a un nuevo tubo cónico de 15 ml y se re-sedimentar las bacterias a 3000 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento en PBS a 1/10 del volumen original. Por ejemplo, si se sedimentó 3 ml de OD 600 = 0,4, a continuación, volver a suspender en 300 l de PBS. NOTA: Este es el final de suspensión bacteriana (~ 1 × 10 9 UFC / ml) que se utiliza para la inoculación de los animales.
- Reserva 50 l de esta suspensión para la dilución en serie y en placas sobre agar THB para determinar el inóculo exacta.
- Inocular cada ratón con 10 l de la suspensión bacteriana final de modo que 1 × 10 7 CFU se administra a cada ratón.
- Para inocular, restringir el ratón manualmente, asegurando la piel suelta en la piel del cuello entre el dedo pulgar del controlador y el dedo índice y luego inmovilizar la cola, como se ha descrito previamente 28.
- Elaborar 10 l de la EGB preparados en la etapa 2.6 en una punta de pipeta de carga de gel de 200 l. Inserte la punta 5 a 10 mm en el lumen vaginal y dispensar los 10 l de inóculo.
NOTA: puntas de carga de gel se prefieren sobre los consejos de 200-l estándar para minimizar el riesgo de trauma o lesión de órganos, en particular en los ratones más jóvenes o más pequeños. - Inmediatamente después de la inoculación, suelte la piel del cuello y elevar el extremo trasero del ratón, levantando el ratón por la cola y walking las patas delanteras sobre una superficie dura para ~ 1 min.
- una inspección visual de la abertura vaginal para cualquier reflujo de inóculo. Si se observa un flujo de retorno, una punta de pipeta nueva se puede usar para manipular o agrandar la abertura vaginal, facilitando la absorción de el reflujo en el lumen. Además, el reflujo puede ser aspirado a través de la pipeta y re-inoculadas.
NOTA: Si la administración de agentes tópicos, organismos probióticos, o proteínas de interés, un volumen de hasta 20 l en un tampón fisiológico se puede dar en el tracto vaginal.
3. Frotar en el lumen vaginal para cuantificar GBS carga
- Prever un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por ratón mediante la adición de 100 l de PBS. Justo antes de hisopado, humedecer previamente el hisopo en PBS.
- Restringir el ratón como se describe en el paso 2.7.1 e inserte el hisopo de 10 mm en el lumen vaginal. gire suavemente el hisopo 4 veces en sentido horario y 4 veces en sentido antihorario, ejerciendo una ligera presión a la pared vaginal.
- Transferir el hisopo en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 100 l de PBS. Antes de chapado, vórtice del tubo de microcentrífuga durante ~ 15 segundos para liberar las bacterias del bastoncillo. En serie diluir cada muestra en PBS y la placa 20 l de diluciones 1:10 a 1: 10.000 en placas de agar medio diferencial preparados según las instrucciones del fabricante. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 horas. GBS colonias van a aparecer ya sea de color rosa brillante o malva en color. Otros flora endógena se inhibirán o aparecerán como colonias azules, blancas o grises.
4. Recoger el líquido de lavado vaginal
- Restringir el ratón como se describe en el paso 2.7.1. Usando una pipeta de punta de carga de gel de 200 l, pipeta de 20 l de PBS en el lumen vaginal. pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 4 veces dentro de la luz y, a continuación retirar todo el volumen de la misma punta de la pipeta. NOTA: Si el líquido de lavado está lleno de mucosa, una punta de pipeta estándar de 200 lpuede ser utilizado para recoger el líquido de lavado final.
- Si el ahorro de líquido de lavado para el análisis de citoquinas o cuantificación de UFC, se distribuye en un tubo de microcentrífuga de 0,7 ml. Si se determina la fase de estro, dispensar al menos 5 l de líquido de lavado en un portaobjetos de vidrio y observar las células bajo un aumento de 100X en un microscopio de luz. NOTA: Para ver ejemplos de etapas de celo, véase la figura 1.
5. disección de tejido y homogeneización
- Para cada ratón, se preparan tres tubos de 2 ml con tapón de rosca (uno para cada tejido: la vagina, el cuello uterino y el útero). Llenar cada tubo con amplias (0,4 a 0,5 g) de 1,0 mm de perlas de óxido de circonio para cubrir la parte inferior de forma cónica del tubo.
- Esterilizar en autoclave los tubos preparados antes de recoger el tejido durante 30 minutos a 121 ° C, especialmente si la cuantificación de la carga bacteriana. Añadir 500 l de PBS estéril a cada tubo. Pese cada tubo después de la esterilización en autoclave y el registro para una futura referencia para calcular el peso del tejido recuperado.
- Esterilizar las tijeras con EtOH al 70%, limpiar si es necesario, y cortar en ambos cuernos uterinos media distancia entre el cuerpo del útero y los ovarios. El uso de tijeras y pinzas, la grasa visceral separada, membranas, y la vejiga urinaria lejos del tracto reproductivo, moviéndose en sentido caudal.
- Esterilizar las tijeras como se describe en el paso 5.4. Transversalmente cortar la vagina tan cerca de la vulva como sea posible para separar el tracto reproductivo del cuerpo. Levante y retire el tracto reproductivo intacto y colocarlo en una placa de Petri estéril.
- Usando una nueva hoja de afeitar, separar el útero del cuello del útero en un corte transversal. Esterilizar la hoja de afeitar con 70%EtOH, y luego separar el cuello uterino de la vagina en un corte transversal. NOTA: No habrá una cantidad mínima de tejido uterino todavía unido al cuello uterino. No habrá una cantidad mínima de tejido vaginal todavía unido al cuello uterino.
- El uso de pinzas estériles, transferir cada uno de los tejidos en sus respectivos tubos de 2 ml con PBS y homogeneizando los granos. Limpiar la pinza con EtOH al 70% entre el manejo de cada tejido.
- Pesar cada 2 ml tubo de tapón de rosca y restar el peso original de tubo para determinar el peso del tejido. pesos de los tejidos típicamente varían entre 20 - 100 mg. sellar herméticamente los tubos de tapón de rosca y homogeneizar los tejidos durante 1 min a velocidad máxima en un homogeneizador de tejidos.
- Para cuantificar la carga bacteriana, en serie se diluye 25 l de homogeneizado de tejido y las diluciones en placas 01:10 a 1: 10.000 en placas de agar medio diferencial. Se incuban las placas como se describe en el paso 3.3. Para almacenar las muestras para la cuantificación de citoquinas, congelar tejido homogeneizado en -20 ° C.
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Representative Results
Durante el desarrollo de este modelo, se hicieron varias observaciones acerca de los factores que afectan a la duración de la colonización vaginal por EGB. Para determinar cómo etapa estral en impactos de inoculación bacteriana GBS persistencia, los ratones se llevaron a cabo en el día de la inoculación a través de líquido de lavado vaginal. La Figura 1 ilustra las cuatro etapas del ciclo estral de ratón, como se determina por mojado de montaje en el líquido de lavado vaginal, un método bien establecido-29. Los ratones se dividieron en grupos en función de esta etapa inicial, y GBS persistencia se monitorizó con el tiempo a través de hisopado vaginal. Ratones inoculados en la fase de proestro fueron colonizadas con GBS más tiempo que cualquier otra fase de estro, en particular los de diestro en el momento de la inoculación (Figura 2). Basándose en estos resultados, en el modelo actual, los ratones son tratados con β-estradiol un día antes de la inoculación GBS sincronizarlos en la etapa de proestro. Otros modelos murinos de infecciones del tracto reproductivo han demostrado un aumento de la capacidad del organismo patógeno a persistir cuando los ratones se mantienen en la fase de estro a través de tratamiento con estradiol exógeno 30,31. Para determinar si este fenómeno también se produjo durante la colonización vaginal con GBS, GBS persistencia se controló durante el tratamiento β-estradiol repetido. Estro sostenida promovido GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC # BAA-1138) persistencia en ratones CD-1, con 90% colonización 2 semanas después de la inoculación (Figura 3A). En un experimento típico con una dosis de β-estradiol antes de la inoculación, sólo el 40-50% de los ratones fueron colonizados una semana después de la inoculación (Figura 4). La media CFU GBS se recuperó de estos ratones imita el porcentaje de colonización (Figura 3B). A pesar de estos resultados se obtuvieron a partir de experimentos independientes, demonios estos datostrar que el mantenimiento de estro continua promueve la persistencia vaginal GBS en la mayoría de los ratones CD-1.
Si bien la realización de experimentos de colonización utilizando diferentes humano GBS aísla, se observó que las cepas variaban en su capacidad para persistir en ratones CD-1, que van desde varios días hasta más allá de un mes. De ensayaron las cepas, NCTC 10/84 tenía la más corta duración, A909 y COH1 persistió durante una a dos semanas, mientras que la cepa CJB111 persistió en la mayoría de los ratones durante dos semanas (Figura 4), e incluso más allá de un mes (datos no mostrados) . Hasta la fecha, no ha habido ninguna correlación observada de serotipo y capacidad de persistir en el tracto vaginal de ratón; sin embargo, diferencias significativas entre las distintas cepas de GBS se han reportado 25. También se examinó la capacidad de GBS para colonizar varias líneas puras ratón y no consanguíneos. GBS cepa A909 persistió en el tracto vaginal durante aproximadamente una semana en outbred CD-1ratones y ratones FVB endogámica (Figura 5). Alternativamente, la mayoría de endogámica BALB / c y C57BL / 6 fueron colonizados en una semana (Figura 5) y se mantuvo colonizado por un mes o más allá (datos no mostrados).
El uso de este protocolo, GBS colonización vaginal in vivo se visualizó mediante la inoculación de ratones con una expresión de GFP-cepa de GBS plásmido y la recogida de tejidos para microscopía fluorescente. GFP-GBS se detectó tanto adherirse a murino epitelio vaginal (Figura 6A) y en estrecha proximidad a otros flora vaginal nativos (Figura 6B). No se detectó ninguna señal de GFP en ratones que habían superado la GFP-GBS en el momento de la recogida de tejidos (datos no mostrados).
Figura 1: Identificación de la etapa de estro de murino no teñida lavado vaginal de fluido. (A) Proestro: abundantes nucleadas células epiteliales escamosas (flechas negras). (B) El estro: abundantes cornified células epiteliales escamosas (flechas azules). (C) metaestro: mezcla de células epiteliales escamosas nucleadas y córneas y predominantemente leucocitos (flechas grises). (D) el diestro: abundantes leucocitos. Aumento = 100X, barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Escenario de celo Impactos Persistencia de la vagina de GBS. Por ciento de los ratones CD-1 colonizado con 1 × 10 7 UFC GBS A909 con el tiempo. Los ratones se agruparon (n = 7-11 / grupo) basado en el escenario de estro en el momento de GBS de la inoculación, tal como se determina mediante lavado vaginal fluido. Se muestra un experimento independiente. Esta cifra ha sido modificado a partir de trabajos publicados con anterioridad, y reimpreso con el permiso 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El tratamiento continuado con β-estradiol promueve la persistencia de GBS dentro de la vagina. Porcentaje colonizado (A) o recuperado CFU (B) de ratones CD-1 (n = 10) inoculados con 1 x 10 7 CFU GBS A909 y mantenidos en tratamiento β-estradiol. Los ratones fueron inyectados con β-estradiol un día antes de GBS de la inoculación y los días 1, 3 y 5 después de la inoculación. Se muestra un experimento independiente. La línea en (B) representa la media recuperado UFC. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Las cepas de GBS difieren en su capacidad de persistir en el tracto vaginal. Outbred ratones CD-1 (n = 10 / grupo) fueron inyectados con una sola dosis de β-estradiol un día antes de la inoculación con GBS 1 × 10 7 UFC de las cepas de GBS dadas. Los experimentos con cada cepa se llevaron a cabo de forma independiente y se repitieron al menos tres veces; Se muestra un resultado representativo. Esta cifra ha sido modificado a partir de trabajos publicados con anterioridad, y reimpreso con el permiso 25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5: Mouse cepas difieren en su capacidad de ser colonizados con GBS en el tracto vaginal. Los ratones de las cepas indicadas fondo fueron inyectados con una sola dosis de β-estradiol un día antes de la inoculación con 1 x 10 7 UFC de GBS A909. Los experimentos con cada cepa se llevaron a cabo de forma independiente y se repitieron al menos dos veces; Se muestra un resultado representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imagen Fluorescente de GBS dentro del tracto vaginal de ratón. Visualización de GFP-expresando GBS (verde) a lo largo del epitelio vaginal en la ampliación = 630x, barra de escala = 50 m (A), y en estrecha proximidad a endogenous microbios vaginales con una ampliación = 1.000X, barra de escala = 20 micras (B). la mancha azul = DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Recopilación de GBS Cepas y de ratón Líneas vaginales utilizados para estudios de colonización. GBS cepas de antecedentes, las líneas de ratón, y la dosis de β-estradiol se indican. Los estudios que utilizan el modelo descrito en este trabajo se resaltan en gris.
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Discussion
Para promover el avance de la comprensión de las interacciones con el GBS tanto el anfitrión y otros microbios en el contexto del huésped, se requiere un modelo animal. Este trabajo describe los aspectos técnicos del establecimiento de la colonización vaginal por EGB en ratones. Este protocolo logra> 90% colonización de ratones sin el uso de anestésicos para inocular bacterias o para recoger muestras de frotis, inmunes supresores para permitir la colonización, pre-lavado vaginal, o aditivos para espesar el inóculo. Por otra parte, este modelo demuestra la reproducibilidad robusta, con un modesto variabilidad inter-experimental, tanto la longitud de GBS persistencia y la carga bacteriana. Los resultados representativos se demuestra en este estudio son la compilación de experimentos independientes y deben ser una referencia para el futuro diseño experimental; Sin embargo, las comparaciones directas entre las cepas de GBS y líneas de ratones deben hacerse con cuidado.
Este modelo imita colonizati humanosen que en la mucosa vaginal colonización por GBS de ratones parece estar restringida al tracto reproductivo. Aunque la ascensión en el cuello uterino y el útero se ha observado con múltiples cepas de GBS 25, los ratones no muestran signos de morbilidad o mortalidad, incluso después de meses de la colonización. Además, dependiendo de la GBS y cepas de ratón estudiado, los ratones muestran colonización vaginal consistente o transitoria, que es útil para el estudio de factores bacterianos y respuestas inmunes del huésped, respectivamente. En este modelo, algunos ratones muestran la colonización intermitente; actualmente se desconoce si los ratones se vuelven recolonizadas en puntos de tiempo posteriores o si la colonización cae por debajo del límite de detección, por lo general de 50 a 100 CFU, en ciertos puntos de tiempo. Es de destacar que no se ha observado la transmisión entre los ratones cuando se colonizaron y ratones no colonizados están alojados juntos durante varias semanas (datos no mostrados).
Este método utiliza un medio selectivo y diferencial disponible comercialmentede EGB para cuantificar las cargas bacterianas ratón. GBS crece rosa o malva colonias tan brillantes que son fácilmente visibles después de 24 horas de incubación. Este medio se ha demostrado que tienen una mayor sensibilidad para detectar GBS en comparación con otros medios, incluyendo agar sangre y medio Granada 32, y se ha utilizado en combinación con las pruebas de aglutinación perla de látex para confirmar GBS aislados clínicos 18. En este estudio, brillantes de color rosa o malva de colonias no colonizadas por EGB ratones nunca se han recuperado. Algunos flora endógena, por lo general especies de Enterococcus, crecerán como colonias de color azul, y algunas colonias aparecerán blanco rosado, gris, o muy pálido. Es importante destacar que las placas deben ser contados después de 18 a 24 horas de incubación, las colonias como los no-GBS pueden incorporar el pigmento de color rosa si se dejan en la incubadora o en la mesa de trabajo durante períodos más largos. Hemos observado, como se ha informado previamente 32, que algunas cepas de S. pyogenes formarán colonias de color rosa en CHROMagar StrepB, pero estas colonies son más pequeños que las colonias de GBS. S. pyogenes no ha sido aislada de la flora vaginal endógenos de ratones en estos estudios, pero esta observación se deben considerar en el trabajo futuro.
La mayoría de los resultados se obtuvieron a partir de la línea de ratón CD-1 outbred, lo que demuestra robustas respuestas inmunitarias innatas dentro de los primeros días después de la inoculación, con la eliminación de bacterias posterior en la mayoría de los ratones 19. Otros también han probado cepas adicionales de GBS y han observado la persistencia ya veces 33,34. Dado que el desarrollo de este modelo, otros grupos han comenzado a desarrollar modelos similares de ratones de la colonización vaginal por EGB para examinar el impacto de las respuestas inmunes anfitrionas 33,35, 36,37, terapias preventivas y transmisión al feto en el útero 34,38. Estas diferencias pueden explicarse por una variedad de factores, incluyendo los determinantes genéticos que afectan a las respuestas inmunes y tque la composición de la flora vaginal nativas. Hemos compilado una lista de las cepas de GBS y las respectivas líneas de ratones que han sido estudiados hasta la fecha en los estudios de EGB de colonización vaginal (Tabla 1). El número de estudios recientes con modelos animales pone de relieve el interés y la necesidad de este tipo de modelos en el campo de la investigación sobre patogenia GBS.
Dentro del tracto vaginal, inmunidad de la mucosa está estrechamente regulada por hormonas esteroides 44, e incluso una dosis de β-estradiol, como se describe en este modelo, perturba la respuesta inmune del huésped. A pesar de ello, existen sólidas respuestas inmunes innatas dentro de los primeros días de la colonización por GBS 19,25, lo que sugiere que las respuestas inmunes afectados son en gran parte intacto. Los modelos que involucren repetidas inyecciones ß-estradiol puede prolongar la persistencia de GBS vaginal, como se ha demostrado en este estudio (Figura 3) y por otros 33. Sin embargo, la respuesta inmune y physi tracto reproductivología puede ser más confusos, haciendo difícil interpretar los resultados. Es importante destacar que las diferencias que se describen a través de diferentes GBS aislados y cepas de ratón en este estudio pueden ser alterados durante el estro de modelos sostenida y deben ser investigados en el trabajo futuro. Es de destacar que ninguno de fase estro ni serotipo de GBS impactados colonización vaginal en un modelo de rata 22. Además, el pH vaginal ácido humana de 03.06 a 04.05 45 difiere drásticamente del pH vaginal murino más neutral de 6,5 46, lo cual podría afectar la expresión de genes de GBS y los factores que contribuyen a la colonización posteriores. Por último, la flora vaginal materna es distinta entre los humanos y los homólogos modelo murino, y trabajos futuros deben examinar la colonización por GBS en ratones que llevan gnotobióticos flora vaginal humanos.
En resumen, estos estudios han tratado de examinar anfitrionas bacterianas y factores que gobiernan la colonización vaginal por EGB. En primer lugar, el robusto e innovador modelo animal de col vaginal por EGBonization desarrollado en este trabajo se puede utilizar para describir las interacciones huésped-microbio complejos en un entorno vaginal in vivo. La información obtenida de este modelo ya ha aumentado considerablemente el conocimiento de los componentes inmunes del huésped y los genes de GBS específicos que controlan la persistencia vaginal por EGB. Por otra parte, estos resultados han planteado preguntas adicionales y serán útiles para el desarrollo de nuevas terapias para limitar la colonización vaginal materna por GBS y la posterior exposición del recién nacido.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sesame oil | Sigma Aldrich | S3547-250ML | |
| β-Estradiol | Sigma Aldrich | E8875-1G | CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. |
| 200 μl gel loading pipette tips | USA Scientific | 1252-0610 | |
| Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs | Puritan | 25-801 A 50 | |
| CHROMagar StrepB | DRG International | SB282 | |
| Todd Hewitt Broth | Hardy Diagnostics | 7161C | |
| 18 G, 1.5 inch needles | BD | 305199 | |
| 26 G, 0.5 inch needles | BD | 305111 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 1 ml syringes | BD | 309659 | |
| 0.45 μm PVDF syringe filters | Whatman | 6900-2504 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | 21-031-CV |
References
- Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
- Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
- Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
- Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
- Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
- Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
- Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
- Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
- Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
- Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
- Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
- Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
- Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
- Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
- Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
- Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
- Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
- Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
- Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
- Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
- Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
- Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
- Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
- Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
- Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
- Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
- Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
- Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
- Caligioni, C. S.
- Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
- Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
- Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
- Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
- Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
- Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
- Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
- Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
- Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
- Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
- De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
- Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
- Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
- Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).
