Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En musmodell av grupp B Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

Syftet med detta protokoll är att imitera mänskliga grupp B Streptococcus (GBS) vaginal kolonisation i en musmodell. Denna metod kan användas för att undersöka värdimmunsvar och bakteriella faktorer som bidrar till GBS vaginal uthållighet, såväl som för att testa terapeutiska strategier.

Abstract

Streptococcus agalactiae (grupp B-streptokock, GBS), är en grampositiv, asymtomatisk kolonisatör av den humana mag-tarmkanalen och vaginal-tarmkanalen av 10 - 30% av vuxna. I immun äventyras individer, inklusive nyfödda, gravida kvinnor och äldre, kan GBS byta till en invasiv patogen som orsakar sepsis, artrit, lunginflammation, och hjärnhinneinflammation. Eftersom GBS är en ledande bakteriell patogen av nyfödda, är nuvarande profylax består av sen dräktighet screening för GBS vaginal kolonisation och efterföljande peripartumperioden antibiotikabehandling av GBS-positiva mödrar. Tung GBS vaginalt börda är en riskfaktor för både neonatal sjukdom och kolonisering. Tyvärr lite är känt om värden och bakteriella faktorer som främjar eller tillåter GBS vaginal kolonisering. Detta protokoll beskriver en teknik för upprättande av långlivade GBS vaginal kolonisation användning av en enda β-östradiol förbehandling och daglig provtagning för att bestämma bakteriell load. Det ytterligare detaljer metoder för att administrera ytterligare behandlingar eller reagens av intresse och för att samla vaginal lavage och reproduktionsorganen vävnader. Denna musmodell kommer att främja förståelsen av GBS-värd interaktionen i vaginala miljön, vilket kommer att leda till potentiella terapeutiska mål för att kontrollera moderns vaginala kolonisering under graviditet och för att förhindra överföring till utsatta nyfödda. Det kommer också att vara av intresse att öka vår förståelse av allmänna bakterievärdinteraktioner i den kvinnliga vaginan.

Introduction

Streptococcus agalactiae, grupp B-streptokock (GBS), är en inkapslad, grampositiv bakterie som ofta isoleras från tarmen och urogenital-tarmkanalen hos friska vuxna. På 1970-talet, GBS dykt upp som den ledande agent infektiös neonatal dödlighet, med över 7000 fall av neonatal sjukdom årligen 1. Tidig debut GBS sjukdom (EOD) förekommer i de första timmarna eller dagarna i livet, uppstår som lunginflammation eller andnöd, och ofta utvecklas till sepsis, medan sen debut sjukdom (LOD) följer efter flera månader och presenterar med bakteriemi, som ofta avancerar till meningit 2. Från och med 2002, de Centers for Disease Control and Prevention rekommenderar universell rastrering för GBS vaginal kolonisation i sen dräktighet och intrapartal antibiotikaprofylax (IAP) för att GBS-positiva mödrar 1. Trots minskningen av tidig debut av sjukdomen till cirka 1000 fall i USA varje år på grund av IAPGBS förblir den vanligaste orsaken till tidig debut neonatal sepsis, och sen debut händelse förblir opåverkad 1. Vare sig i livmodern, under förlossningen, eller ens i sen debut fall neonatal exponering för GBS kräver överlevnad, tvärgående genom ett antal värdmiljöer och barriärer, immun skatteflykt, och, i fallet med meningit, passage av den starkt reglerade blod- hjärnbarriären 2. Uppströms dessa virulenta interaktioner inom det nyfödda barnet är den första koloniseringen av moderns vaginan. Moderns GBS vaginal kolonisering varierar mellan 8-18% i utvecklade länder och utvecklingsländer, med en beräknad genomsnittlig hastighet av 12,7% 3,4. GBS kolonisering av vaginan under graviditeten kan vara konstant, intermittent, eller övergående natur bland enskilda kvinnor 5. Intressant nog är en moderns ålder> 36 år i samband med ihållande kolonisering 6. Talrika biologiska och socioekonomiska riskfaktorer för GBS vaginal koloniseringhar identifierats. Biologiska faktorer inkluderar gastrointestinala GBS kolonisering och frånvaro av Lactobacillus i tarmen. Emellertid har etnicitet, fetma, hygien, och sexuell aktivitet också förknippats med GBS vaginal vagnen 7.

Även ökända för att orsaka neonatala infektioner GBS orsakar också en mängd av moderns infektioner både peripartumperioden och postpartum. GBS vagnen ökar hos kvinnor som framlägger med vaginit 8 och, i vissa fall kan till och med vara sjukdomen enheten 9. Dessutom kan GBS uppstigning av fortplantningsorganen under graviditeten leda till inom fostervatten infektion eller korioamnionit 10. Dessutom i upp till 3,5% av graviditeter, sprider GBS till urinblåsan för att orsaka en urinvägsinfektion eller asymtomatisk bakteriuri 11. GBS bakteriuri under graviditeten är associerat med en ökad risk för intrapartal feber, korioamnionit, för tidig födsel, och Premature hinnbristning 12. Sammantaget är närvaron av GBS i vaginan kopplat till infektioner i flera värdvävnader, och förmåga att eliminera GBS från denna nisch är viktigt för både mödrar och nyfödda hälsa.

Tills nyligen var de flesta av arbete undersöker GBS interaktioner med cervicovaginal vägarna begränsas till cell in vitro modeller 13-15. Dessa in vitro experiment har visat bakteriella faktorer som är viktiga för efterlevnad, inklusive ytproteiner såsom en pili och serin rika upprepningarna 17,18, samt två-komponent regelsystem 15,19 och den globala transkriptionssvaret hos vaginala epitel till GBS 19. Men för att fullt belysa värd-mikrobinteraktioner inom vaginalkanalen, är det nödvändigt med en robust djurmodell. Tidigt arbete visade att GBS kan utvinnas ur vaginan av ympade möss 20,21 och råttor <sup> 22 i både gravida och icke-gravida förhållanden. År 2005 var kortsiktiga GBS vaginal kolonisation modelleras i möss för att undersöka effekten av en fag lytiskt enzym för att behandla vaginal GBS under en 24 timmarsperiod 23. Flera år senare, var en långsiktig GBS vaginal kolonisering musmodell utvecklats för att studera värd och bakteriella faktorer som styr GBS uthållighet. Denna modell har identifierat ett antal GBS faktorer som bidrar till kolonisering, inklusive ytan bihang 17,18 och GBS tvåkomponentsystem 19,24. Denna modell har bidragit till identifiering av värdsvarsmekanismer 19,25 och användes för att testa flera terapeutiska strategier, bland annat immunmodulerande peptider 26 och probiotika 27. Detta protokoll ger nödvändig vägledning för att ympa GBS i musen vaginan och därefter spåra kolonisering och samla in prover för ytterligare analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur arbete godkändes av Office of Lab Animal Care på San Diego State University och genomförs under vedertagna veterinära normer. Honmöss, ålder 8 - 16 veckor, användes för att utveckla denna metod.

1. Upprättande och intraperitoneal injektion av β-östradiol

  1. Mät upp β-östradiol (0,5 mg / mus) på väga papper iklädd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE). VARNING: β-estradiol kan absorberas genom huden och slemhinnor.
  2. Överföra β-östradiol till en 15-ml koniska rör och virvla tills alla klumpar avlägsnas och β-östradiol är ett fint pulver. Upprätta sesamolja (100 ul / mus) i en 10-ml spruta. Spruta-filtersesamolja i 15-ml koniskt rör innehållande β-östradiol med användning av ett 0,45-pm filter. Virvel 15-ml koniskt rör tills β-östradiol är en homogen suspension i sesamolja.
  3. Upprätta p-estradiol suspensionen i en ny 10-ml spruta. Med en 18 G, 1-in. nål, alikvot 100 | il av suspensionen in i en-ml tuberkulinsprutor. Förbered en spruta för varje mus. Placera en ny, steril 26 G, ½-in. nål på varje tuberkulinspruta.
  4. Administrera 0,5 mg av β-östradiol suspenderat i 100 ul av sesamolja (5 mg / ml) till varje mus 24 h före bakteriell inokulering. Injicera varje mus i bukhålan, i nedre delen av buken kvadranter, precis till höger eller vänster om mittlinjen, som tidigare beskrivits 28.
    OBS: Ingen städning eller klippning av injektionsstället är nödvändig.

2. vaginal Inokulation med GBS

  1. En dag före ympning, växa en 5-ml över natten vätskekultur av en GBS-stam av intresse, såsom A909 (serotyp la), i Todd Hewitt-buljong (THB) vid 37 ° C.
  2. Subkultur GBS natten kultur vid en 01:10 volym in i färskt THB och inkubera vid 37 ° C. odlabakterier till mid-logfas (OD 600 = 0,4-0,5). OBS: Detta tar normalt 2-3 timmar, beroende på stam av GBS.
  3. Överför subkultur till en steril 15 ml koniska rör och pellet bakterier vid 3000 x g under 5 min. Aspirera supernatanten. Resuspendera den bakteriella pelleten i 200 | il av steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  4. Med användning av den återsuspenderade pelleten, ta med 3 - 5 ml PBS (1 ml per 10 möss) för att exakt OD 600 = 0,4 i ett nytt 5-ml odlingsrör. Detta kommer att vara en koncentration av ~ 1 x 10 8 kolonibildande enheter (CFU) / ml. Förflyttas till en ny 15-ml koniska rör och återpelletera bakterierna vid 3000 x g under 5 min. Aspirera supernatanten.
  5. Återsuspendera pelleten i PBS vid 1/10 av den ursprungliga volymen. Till exempel, om 3 ml OD 600 = 0,4 pelletiserades, därefter återsuspendera den i 300 pl PBS. OBS: Detta är det slutliga bakteriesuspension (~ 1 x 10 9 CFU / ml) som används för djur ympning.
  6. Reserve 50 il av denna suspension för seriell utspädning och plätering på THB agar för att bestämma den exakta inokulat.
  7. Inokulera varje mus med 10 pl av den slutliga bakteriesuspensionen så att 1 x 10 7 CFU administreras till varje mus.
    1. Att ympa, hålla musen manuellt genom att säkra den lösa huden vid nackskinnet mellan förarens tumme och pekfinger och sedan immobilisera svansen, som beskrivits tidigare 28.
    2. Upprätta 10 fil av GBS som bereddes i steg 2,6 i en 200-ul gel loading pipettspetsen. In spetsen 5 till 10 mm in i de vaginala lumen och fördela de 10 | il av inokulat.
      OBS: Gel lastning tips föredrages framför standard 200-il tips för att minimera risken för organ trauma eller skada, i synnerhet hos yngre eller mindre möss.
    3. Omedelbart efter inokulering, släpp nackskinnet och lyfta den bakre änden av musen, lyfta musen i svansen och walking de främre tassar på en hård yta för ~ 1 min.
    4. Okulärbesiktiga slidöppningen för varje återflöde av inokulat. Om backflöde observeras, kan en ny pipettspets användas för att manipulera eller förstora slidöppningen, underlättar upptag av backflöde i lumen. Dessutom kan återflöde sugas via pipett och åter ympas.
      OBS: Om administrera aktuella ämnen, probiotiska organismer, eller proteiner av intresse, en volym upp till 20 pl i en fysiologisk buffert kan ges i vaginan.

3. badda den Vaginal Lumen att kvantifiera GBS Load

  1. Förbered en 1,5 ml mikrocentrifugröret per mus genom att tillsätta 100 pl PBS. Strax före pensling, pre-blöt pinnen i PBS.
  2. Hålla musen som beskrivs i steg 2.7.1 och sätter pinnen 10 mm i den vaginala lumen. Rotera försiktigt pinnen 4 gånger medsols och 4 gånger moturs med ett lätt tryck på vaginalväggen.
  3. Överföra pinnen till 1,5-ml mikrocentrifugrör med 100 pl av PBS. Före plätering, virvel mikrocentrifugrör för ~ 15 sekunder för att frigöra bakterier från pinnen. Seriellt späda varje prov i PBS och plattan 20 pl utspädningar 1:10 till 1: 10.000 på differentialmedel agarplattor framställda enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 24 h. GBS kolonier visas antingen ljust rosa eller lila färg. Andra endogena floran kommer att hämmas, eller visas som blå, vit eller grå kolonier.

4. Samla Vaginal lavage

  1. Hålla tillbaka mus såsom beskrivs i steg 2.7.1. Med hjälp av en 200-il gel lastning pipettspetsen, pipett 20 ul PBS i den vaginala lumen. pipettera försiktigt hela volymen upp och ner 4 gånger inom lumen, och sedan dra hela volymen i samma pipettspetsen. OBS: Om sköljvätskan är tjock med slem, en standard 200 mikroliter pipettspetskan användas för att samla in den slutliga sköljvätskan.
  2. Om du sparar sköljvätska för cytokin analys eller CFU kvantifiering, fördela i en 0,7 ml mikrocentrifugrör. Om bestämma stadiet av estrus, fördela minst 5 il sköljvätska på en glasskiva och observera celler under 100 gångers förstoring på ett ljusmikroskop. NOTERA: För exempel på östrus-stadier, se figur 1.

5. Vävnads Dissektion och Homogenisering

  1. För varje mus, förbereda tre 2 ml med skruvkork rör (en för varje vävnad: vagina, livmoderhals och livmoder). Fyll varje rör med riklig (0,4-0,5 g) 1,0 mm zirconia pärlor för att täcka den koniska-formade botten av röret.
  2. Autoklavera de preparerade rören före uppsamling av vävnad för 30 minuter vid 121 ° C, särskilt om kvantifiera bakteriehalten. Tillsätt 500 | il av steril PBS till varje rör. Väg varje rör efter autoklavering och rekord för framtida referens för att beräkna återvunna vävnad vikt.
    3. CO2 kvävning och halsdislokation. Spraya ner ventrala buken med 70% EtOH. Med steril sax, öppna abdominopelvic hålighet, lyft tillbaka huden och bukmusklerna, och förskjuta tarmarna så att fortplantningsorganen utsätts.
  3. Sterilisera saxen med 70% EtOH, torka rent vid behov, och skär båda livmoderhornen halva längden mellan livmoderkroppen och äggstockar. Använda sax och pincett, separat visceralt fett, membran, och urinblåsan bort från reproduktionsorganen, flytta kaudalt.
  4. Sterilisera sax som beskrivs i steg 5,4. Tvären skär slidan så nära vulva som möjligt att separera fortplantningsorganen från kroppen. Lyft och ta bort den intakta fortplantningsorganen och placera den i en steril petriskål.
  5. Med användning av ett nytt rakblad, separera uterus från livmoderhalsen i ett tvärgående snitt. Sterilisera rakblad med 70%EtOH, och därefter separera cervix från vagina i ett tvärgående snitt. OBS: Det kommer att finnas en minimal mängd av livmodervävnad fortfarande sitter i livmoderhalsen. Det kommer att finnas en minimal mängd av vaginala vävnaden fortfarande sitter i livmoderhalsen.
  6. Använda steril pincett, överföra varje vävnaderna i sina respektive två-ml rör innehållande PBS och homogenisering pärlor. Rengör pincett med 70% EtOH i mellan hantering av varje vävnad.
  7. Väga varje 2 ml-skruvkapsylröret och subtrahera den ursprungliga vikten av röret för att bestämma vävnadsvikt. Vävnadsvikten varierar vanligen mellan 20-100 mg. Tätt försegla skruvlock och homogenisera de vävnader för en min vid maximal hastighet i en vävnadshomogenisator.
  8. För att kvantifiera bakteriehalten, seriellt späda 25 il vävnadshomogenat och plattspäd 1:10 genom 1: 10.000 på differentialmedel agarplattor. Inkubera plattorna såsom beskrivs i steg 3,3. För att lagra prover för cytokin kvantifiering, frysa vävnadshomogenat vid -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under utvecklingen av denna modell, har flera observationer gjorts avseende faktorer som påverkar varaktigheten av GBS vaginalt kolonisering. För att avgöra hur brunst scenen på ympning effekter GBS bakteriella uthållighet, möss iscensatt på dagen för ympning via vaginalsköljvätska. Figur 1 visar de fyra stegen i musen Östrogencykeln, som bestäms av wet-mount vaginal lavage, en väletablerad metod 29. Mössen delades in i grupper baserat på detta inledande skede, och GBS uthållighet övervakades över tiden via vaginal svabbar. Möss som ympats på proestrus stadiet koloniserades med GBS längre än något annat skede av brunst, särskilt de i diestrus vid tidpunkten för ympning (Figur 2). Baserat på dessa resultat, i den nuvarande modellen, är möss som behandlats med β-östradiol en dag före GBS ympning för att synkronisera dem i proestrus scenen. Andra musmodeller av infektioner i reproduktionsorganen har visat en ökad förmåga patogena organismen att kvarstå när möss ihållande i estrus scenen genom exogen estradiol behandling 30,31. För att avgöra om detta fenomen inträffade också under vaginal kolonisering med GBS, var GBS uthållighet övervakas under upprepade β-estradiol behandling. Ihållande estrus främjas GBS A909 (American Type Culture CoUection, ATCC # BAA-1138) persistens i CD-1-möss, med 90% kolonisering 2 veckor efter ympning (Figur 3A). I ett typiskt experiment med en dos av β-östradiol före ympning, var endast 40-50% av mössen koloniserat en vecka efter ympning (Figur 4). Medelvärdet GBS CFU återhämtat sig från dessa möss härmar den procentuella andelen av kolonisering (figur 3B). Även om dessa resultat erhölls från oberoende experiment, dessa data demonertrate att upprätthålla kontinuerlig estrus främjar GBS vaginal persistens i de flesta CD-1-möss.

Samtidigt genomför kolonisering experiment med hjälp av olika mänskliga GBS isolat, observerades det att stammar varierade i sin förmåga att framhärda i CD-1-möss, som sträcker sig från några dagar till mer än en månad. Av testade stammar, NCTC 10/84 hade kortast möjliga tid, A909 och COH1 kvarstod under en till två veckor, medan stammen CJB111 framhärdade i de flesta möss i två veckor (Figur 4) och även utanför en månad (data visas ej) . Hittills har det inte funnits någon observerad korrelation av serotyp och förmåga att finnas kvar i mus vaginan; har dock betydande skillnader mellan enskilda GBS-stammar rapporterats 25. Förmågan hos GBS att kolonisera flera inavlade och avlade mus linjer undersöktes också. GBS-stam A909 härdade i vaginalkanalen under ca en vecka i utavlade CD-1möss och inavlade FVB möss (Figur 5). Alternativt, var majoriteten av inavlade BALB / c och C57BL / 6 koloniserade på en vecka (figur 5) och förblev koloniserade under en månad eller längre (data visas ej).

Med hjälp av detta protokoll var GBS vaginal kolonisering in vivo visualiseras genom ympning möss med en plasmid GFP-uttryckande GBS-stammen och samla vävnad för fluorescensmikroskopi. GFP-GBS upptäcktes både följa murin vaginalt epitel (figur 6A) och i nära anslutning till andra inhemska vaginala floran (Figur 6B). Ingen GFP signal detekterades hos möss som hade rensat GFP-GBS vid tidpunkten för vävnadsuppsamlings (data visas ej).

Figur 1
Figur 1: Identifiera scenen av Estrus från Obehandlat Murin Vaginal sköljvätska. (A) proestrus: rikligt kärnskivepitelceller (svarta pilar). (B) Estrus: rikligt cornified skivepitelceller (blå pilar). (C) Metestrus: blandning av kärn och cornified skivepitelcancer epitelceller och främst leukocyter (grå pilar). (D) diestrus: rikligt leukocyter. Förstoring = 100X, skala bar = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: brunst Stage Effekter Vaginal Persistence of GBS. Procent av CD-1-möss koloniserade med 1 x 10 7 CFU GBS A909 över tiden. Möss grupperades (n = 7-11 / grupp) baserat på estrous skede vid tidpunkten för GBS inokulering, enligt bestämning med vaginal lavage vätska. En oberoende experiment visas. Denna siffra har ändrats från tidigare publicerade arbeten och återges med tillstånd 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Fortsatt behandling med β-estradiol främjar GBS Vaginal uthållighet. Procent koloniserad (A) eller återvinns CFU (B) CD-1-möss (n = 10) ympade med 1 x 10 7 CFU GBS A909 och underhållas på β-estradiol behandling. Möss injicerades med β-östradiol en dag före GBS ympning och på dagarna 1, 3 och 5 efter inokulering. En oberoende experiment visas. Linjen i (B) representerar menar återvinnas CFU. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: GBS-stammar skiljer sig åt i sin förmåga att framhärda i vaginan. Utavlade CD-1-möss (n = 10 / grupp) injicerades med en enda dos av β-östradiol en dag före GBS ympning med 1 x 10 7 CFU av de givna GBS-stammar. Experiment med varje stam utfördes självständigt och upprepades minst tre gånger; ett representativt resultat visas. Denna siffra har ändrats från tidigare publicerade arbeten och återges med tillstånd 25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

pload / 54.708 / 54708fig5.jpg "/>
Figur 5: musstammar skiljer sig i sin förmåga att vara koloniserade med GBS i Vaginal Tract. Möss från angivna bakgrunden stammar injicerades med en enda dos av β-östradiol en dag före ympning med 1 x 10 7 CFU av GBS A909. Experiment med varje stam utfördes självständigt och upprepades minst två gånger; ett representativt resultat visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Fluorescerande avbildning av GBS i mus vaginan. Visualisering av GFP- uttrycker GBS (grön) längs den vaginala epitel vid förstoring = 630X, skala bar = 50 m (A), och i nära anslutning till endogenous vaginala mikrober vid förstoring = 1,000X, skala bar = 20 pm (B). Blånad = DAPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1: Sammanställning av GBS-stammar och mus linjer används för vaginal kolonisation studier. GBS bakgrund stammar, mus linjer och dosering av β-östradiol anges. Studier som använder den modell som beskrivs i detta arbete är markerade i grått.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att främja utvecklingen av förståelsen av GBS interaktioner med både värden och andra mikrober i samband med värden, är en djurmodell krävs. Detta arbete beskriver de tekniska aspekterna av upprättandet GBS vaginal kolonisering hos möss. Detta protokoll åstadkommer> 90% kolonisering av möss utan användning av bedövningsmedel för att inokulera bakterier eller för att samla pinnprover, immun-suppressants att möjliggöra kolonisering, vaginal förtvätt, eller tillsatser för att förtjocka inokulat. Dessutom visar denna modell robust reproducerbarhet, med blygsam mellan experimentell variation i både längd GBS uthållighet och bakteriell belastning. De representativa resultat visat i denna studie är sammanställningen av oberoende experiment och bör vara en referens för framtida experimentell design; bör dock direkta jämförelser mellan GBS-stammar och mus linjer göras med omsorg.

Denna modell härmar mänskliga colonizatipå att mucosal vaginala GBS kolonisering av möss tycks vara begränsad till fortplantningsorganen. Även uppstigning i livmoderhalsen och livmodern har observerats med flera GBS-stammar 25, gör möss inte visa tecken på sjuklighet eller dödlighet, även efter månader av kolonisering. Vidare, beroende på GBS och musstammar studeras, möss uppvisar konsekvent eller övergående vaginala kolonisering, vilket är användbart för att studera bakteriella faktorer och värdimmunsvar, respektive. I denna modell, vissa möss visar intermittent kolonisering; det är för närvarande okänt huruvida möss blivit recolonized vid senare tidpunkter eller om kolonisering sjunker under detektionsgränsen, typiskt 50 till 100 CFU, vid vissa tidpunkter. Notera har överföringen mellan möss inte observerats när koloniserade och icke-koloniserade möss inrymda tillsammans under flera veckor (data ej visade).

Denna metod använder en kommersiellt tillgänglig selektivt och differentiellt mediumför GBS att kvantifiera mus bakterie bördor. GBS växer så ljusa rosa eller lila kolonier som är väl synlig efter 24 h inkubation. Detta media har visat sig ha högre känslighet för att detektera GBS jämfört med andra medier, inklusive biodagar och Granada-medium 32, och har använts i kombination med latexpärla agglutinationsprov att bekräfta GBS kliniska isolat 18. I denna studie, ljusa rosa eller lila kolonier från icke-GBS koloniserade möss har aldrig återfunnits. Vissa endogena floran, typiskt Enterococcus arter, kommer att växa som blå kolonier, och vissa kolonier visas vit, grå eller mycket ljusrosa. Viktigt bör plattorna räknades efter 18 till 24 h av inkubation, som icke-GBS-kolonier kan inkorporera den rosa pigment om de lämnas i inkubatorn eller på bänk under längre perioder. Vi har observerat, som tidigare har rapporterats 32, att vissa S. pyogenes isolat bildar rosa kolonier på CHROMagar StrepB, men dessa colonies är vanligtvis mindre än GBS kolonier. S. pyogenes har inte isolerats från de endogena vaginal flora av möss i dessa studier, men denna observation bör övervägas i det fortsatta arbetet.

Majoriteten av resultat erhölls från den utavlade CD-1 mus-linje, vilket visar robusta medfödda immunsvar inom de första dagarna efter inokulering, med efterföljande bakteriell clearance i de flesta möss 19. Andra har också testat andra GBS-stammar och har observerat längre uthållighet gånger 33,34. Eftersom utvecklingen av denna modell, har andra grupper börjat utveckla liknande musmodeller av GBS vaginalt kolonisering att undersöka effekterna av värdimmunsvar 33,35, förebyggande behandlingar 36,37, och överföring till fostret i livmodern 34,38. Dessa skillnader kan förklaras av en mängd olika faktorer, inklusive genetiska faktorer som påverkar immunsvar och than sammansättningen av inhemska vaginalfloran. Vi har sammanställt en lista över de GBS-stammar och respektive mus linjer som har studerats hittills i GBS vaginal kolonisations studier (Tabell 1). Antalet nya studier med djurmodeller understryker vikten och behovet av dessa typer av modeller inom området GBS patogenes forskning.

Inom den vaginala tarmkanalen, är mukosal immunitet hårt reglerad av steroidhormoner 44, och till och med en dos av β-östradiol, såsom beskrivs i denna modell, perturbs värdens immunsvar. Trots detta finns det robusta medfödda immunsvar inom de första dagarna av GBS kolonisering 19,25, vilket tyder på att de berörda immunsvar är i stort sett intakt. Modeller som innebär upprepade p-östradiol injektioner kan förlänga GBS vaginalt uthållighet, vilket framgår i denna studie (Figur 3) och av andra 33. Men immunsvar och reproduktionsorganen physiology kan mer förvirrad, vilket gör resultaten svårtolkade. Viktigt är de skillnader som beskrivs över olika GBS isolat och musstammar i denna studie kan ändras under modeller av ihållande brunst och bör undersökas i det fortsatta arbetet. Notera varken estrus skede eller GBS serotyp påverkat vaginal kolonisation i en råttmodell 22. Dessutom, den mänskliga sura vaginala pH av 3,6-4,5 45 skiljer sig drastiskt från den mer neutrala murina vaginal pH av 6,5 46, vilket kan påverka GBS genuttryck och efterföljande faktorer som bidrar till kolonisering. Slutligen är infödd vaginal flora distinkt mellan människor och musmodell motsvarigheter, och det framtida arbetet bör undersöka GBS kolonisering i gnotobiotiska möss som bär humana vaginala flora.

Sammanfattningsvis har dessa studier var att undersöka värd och bakteriella faktorer som styr GBS vaginal kolonisation. I första hand den robusta, innovativa djurmodell av GBS vaginalt colonization utvecklats i detta arbete kan utnyttjas för att beskriva komplexa värd-mikrob interaktioner i en in vivo-vaginal miljö. Den information som erhålls från denna modell har redan ökat kraftigt kunskap om värdimmun komponenter och specifika GBS gener som styr GBS vaginalt uthållighet. Dessutom har dessa resultat höjt ytterligare frågor och kommer att vara användbart för vidareutveckling av nya läkemedel för att begränsa moderns GBS vaginal kolonisation och efterföljande exponering av det nyfödda barnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Tags

Infektion grupp B GBS, Vaginal kolonisation modell murin modell bakteriellt-värdinteraktion
En musmodell av grupp B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine … More

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter