Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

B Grubu bir murin modelinde Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

Bu protokolün amacı bir murin modelinde insan Grup B Streptococcus (GBS), vajinal kolonizasyonu taklit etmektir. Bu yöntem konak bağışıklık yanıtlarını ve GBS vajinal sebat katkıda bakteriyel faktörleri araştırmak için, yanı sıra tedavi stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Abstract

Yetişkin% 30 - Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus, GBS), insan mide-bağırsak sistemi ve 10 vajinal kanalın bir Gram-pozitif asemptomatik colonizer olup. Bağışıklık tehlikeye bireyler de dahil olmak üzere yenidoğanlar, hamile kadınlar ve yaşlılar, GBS sepsis, artrit, pnömoni, ve menenjite neden olan istilacı patojene geçebilir. GBS yenidoğanlarda lider bakteriyel patojen olduğu için, mevcut profilaksi GBS vajinal kolonizasyon ve GBS-pozitif annelerin sonraki peripartum antibiyotik tedavisi için geç gebelik taraması oluşur. Ağır GBS vajinal yük yenidoğan hastalık ve kolonizasyon her ikisi için de risk faktörüdür. Ne yazık ki, çok az ev sahibi ve teşvik veya vajinal kolonizasyon GBS izin bakteriyel faktörler hakkında bilinmektedir. Bu protokol, bakteriyel uzunlu belirlemek için tek bir β-estradiyol, tedavi öncesi ve günlük olarak örnekleme yöntemiyle sürekli GBS vajinal kolonizasyonu kurulması için bir yöntem açıklanırd. Ayrıca ayrıntılar yöntemleri ek tedaviler veya ilgi reaktifler yönetmek ve vajinal lavaj sıvısı ve üreme yolu dokuları toplamak için. Bu fare modeli gebelik sırasında annenin vajinal kolonizasyonu kontrol etmek ve savunmasız bebeğe bulaşmasını önlemek için potansiyel terapötik hedeflere götürecek vajinal ortamında GBS-host etkileşimi, anlaşılması daha fazla olacaktır. Aynı zamanda kadın vajinal kanalın genel bakteriyel-konak etkileşimleri anlayışımızı artırmak ilgi olacaktır.

Introduction

Streptococcus agalactiae Grup B Streptococcus (GBS), sıklıkla bağırsak ve sağlıklı yetişkin genitoüriner izole bir kapsüllenmiş, Gram pozitif bir bakteridir. 1970'li yıllarda, GBS yılda yenidoğan hastalık 7.000 durumlarda 1 ile bulaşıcı neonatal mortalitenin önde gelen ajan olarak ortaya çıkmıştır. Erken başlangıçlı GBS hastalığı (EOD) pnömoni veya solunum sıkıntısı doğar, ilk saatlerde veya yaşam günlerinde ortaya çıkar ve genellikle geç başlangıçlı hastalık (LOD) ise, sepsis içine geliştirir birkaç ay sonra gelişir ve sıklıkla bakteriyemi, ile ortaya 2 menenjit ilerler. 2002 yılı itibariyle, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri GBS-pozitif annelere 1 geç gebelik ve intrapartum antibiyotik profilaksisi (IAP) GBS vajinal kolonizasyon için evrensel tarama önermektedir. yıllık IAP nedeniyle Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1.000 durumlarda erken başlangıçlı hastalık azalmaya rağmen,GBS erken başlangıçlı neonatal sepsis başta gelen nedenidir ve geç başlangıçlı olay 1 etkilenmez. rahimde olsun, doğum sırasında, hatta geç başlangıçlı olgularda, GBS için yenidoğan maruz menenjit, yüksek düzenlenmiş kan-kesiştiği durumunda, ev sahibi ortamları ve engelleri, bağışıklık kaçırma bir numara ile hayatta kalma, enine gerektirir ve beyin bariyeri 2. Yenidoğanda olan bu öldürücü etkileşimlerin Memba anne vajinal kanalın ilk kolonizasyonu olduğunu. GBS vajinal kolonizasyon oranları% 12.7 3,4 olarak tahmin ortalama oranı ile gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde 8-18% aralığında anne. Gebelik sırasında vajinal kanalın GBS kolonizasyonu bireysel kadınlar 5 arasında doğada, sabit aralıklı veya geçici olabilir. İlginçtir, bir anne yaşı> 36 yıl kalıcı kolonizasyon 6 ile ilişkilidir. GBS vajinal kolonizasyon için çok sayıda biyolojik ve sosyo-ekonomik risk faktörleritespit edilmiştir. Biyolojik faktörler gastrointestinal GBS kolonizasyonu ve bağırsak içinde Lactobacillus yokluğunu içerir. Bununla birlikte, etnik köken, obezite, hijyen ve cinsel aktivitesi GBS vajinal taşıyıcı 7 ile ilişkilendirilmiştir.

Yenidoğan enfeksiyonlara neden için kötü şöhretli olsa da, GBS de anne enfeksiyonları hem peripartum ve postpartum çeşitli neden olur. GBS taşıyıcılığı bile hastalık varlık 9 olabilir, bazı durumlarda, vajinit 8 ile başvuran kadınlarda artmış ve. Buna ek olarak, gebelik sırasında üreme sisteminin GBS yükseliş içi amniyotik enfeksiyon veya korioamnionit 10 ile sonuçlanabilir. Ayrıca, gebeliklerin% 3.5'e varan, GBS bir idrar yolu enfeksiyonu ya da asemptomatik bakteriüri 11 neden mesaneye yaymaktadır. Hamilelik sırasında GBS bakteriüri İntrapartum ateş, korioamnionit, erken doğum ve prematür riski ile ilişkilidirmembranların 12 e rüptürü. Birlikte ele alındığında, vajinal kanalın içinde GBS varlığı birden çok ana bilgisayar dokuların enfeksiyona bağlı ve bu niş GBS ortadan kaldırmak için yeteneği hem anne ve yenidoğan sağlığı açısından zorunludur edilir.

Yakın zamana kadar, servikovaginal yolu ile GBS etkileşimlerini incelemek çalışma çoğunluğu in vitro hücre modellerinin 13-15 sınırlıydı. Bu in vitro deneyler dahil olmak üzere yüzey proteinleri yapışma için önemli olan bakteriyel faktörler ortaya çıkarmıştır bir pili ve serin bakımından zengin tekrarlar 17,18 yanı sıra, iki bileşenli düzenleyici sistemler 15,19 ve vajinal epitelinin genel transkripsiyon yanıtı GBS 19. Bununla birlikte, tam olarak vajina yolu içinde ana Mikrop Etkileşimleri aydınlatmak için, sağlam bir hayvan modeli gereklidir. Erken çalışma GBS inoküle edilmiş fareler, 20,21 ve sıçanların vajinal kanalın elde edilebilir olduğunu göstermiştir <sup> hem gebe ve gebe olmayan koşullarda 22. 2005 yılında, kısa vadeli GBS vajinal kolonizasyon 24 saat süre üzerinde 23 vajinal GBS tedavisinde bir faj litik enzimin etkinliğini incelemek için farelerde modellenmiştir. Birkaç yıl sonra, uzun vadeli bir GBS vajinal kolonizasyon fare modeli GBS sebat yöneten ana ve bakteriyel faktörleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu model yüzey uzantıları 17,18 ve GBS iki bileşenli sistemlerde 19,24 dahil kolonizasyon katkıda sayısız GBS faktörleri tespit etmiştir. Bu model konak yanıtı mekanizmalarının 19,25 belirlenmesine katkıda bulunmuş ve immünomodülatör peptidler 26 ve probiyotikler 27 dahil olmak üzere birçok tedavi stratejilerinin, test etmek için kullanıldı. Bu protokol, fare vajinal kanalın içine GBS aşılamak için ve daha sonra kolonizasyonu izlemek ve daha fazla analizler için numune toplamak için gerekli yönlendirmeyi verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, San Diego Eyalet Üniversitesi Lab Hayvan Bakım Dairesi tarafından onaylanmış ve kabul edilmiş veteriner standartlar altında gerçekleştirilmiştir. Dişi fareler, yaş 8-16 hafta, bu yöntemin geliştirilmesi için kullanılmıştır.

β-estradiyol hazırlanması 1. ve periton içi enjeksiyon

  1. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek kağıt tartmak üzerinde β-estradiol (0.5 mg / fare) dışarı ölçün. DİKKAT: β-estradiyol deri ve mukoza yüzeylerinden absorbe edilebilir.
  2. Tüm topaklar kaldırıldı ve β-östradiol ince bir toz kadar 15 ml konik tüp ve vorteks β-östradiol aktarın. 10 ml'lik bir şırınga içine susam yağı (100 ul / fare) hazırlayın. 0.45 um filtre kullanılarak β-estradiol ihtiva eden 15 ml'lik konik bir tüp içine şırınga filtresi susam yağı. β-estradiyol susam yağı içinde, homojen bir süspansiyon olana kadar 15 ml konik tüp vorteksleyin.
  3. β-es çizinYeni 10 ml'lik enjektöre tradiol süspansiyon. 18 G, 1-in ile. İğne, kısım 1 ml tüberkülin şırınga içine süspansiyon 100 ul. Her fare için bir şırınga hazırlayın. Yeni, steril 26 G ½-in yerleştirin. Her tüberkülin şırınga iğnesi.
  4. önce bakteriyel aşılama için her bir fare, 24 saat için, susam yağı (5 mg / ml) 100 ul içinde süspansiyon haline β-estradiyol 0.5 mg yönetme. Sadece sağa, alt karın kadran, periton boşluğuna içinde her fare enjekte veya daha önce 28 açıklandığı gibi, orta hat bıraktı.
    NOT: enjeksiyon yerinde hiçbir temizlik ya da kırpma gereklidir.

GBS ile 2. Vajinal aşılama

  1. Bir gün inokülasyondan önce, 37 ° C'de, Todd Hewitt brotu (THB), bu tür A909 (serotip Ia) halinde çıkar, bir GBS soyunun 5 ml gece boyunca sıvı bir kültürün büyür.
  2. Taze THB içine 1:10 hacimde GBS gecede kültür altkültürü ve 37 ° C'de inkübe edin. büyümekorta log fazına bakteriler (= 0.4-0.5 OD 600). NOT: - GBS gerginlik bağlı olarak, 3 saat Bu genellikle 2 alacaktır.
  3. 5 dakika için 3000 x g 'de, steril bir 15 mL konik tüp ve topak bakterilere alt kültür aktarın. süpernatant aspire. Steril bir fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 200 ul bakteri pelletini.
  4. Yeni 5-ml kültür tüpü içinde 5 ml PBS (10 fare başına 1 mi) tam olarak OD 600 = 0.4 - topak, yeniden süspanse kullanılarak, 3 getir. Bu yaklaşık 1 x 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / ml bir konsantrasyon olacaktır. Yeni 15-ml konik tüp ve transfer 5 dakika boyunca 3.000 x g'de bakteri yeniden pelet. süpernatant aspire.
  5. 1/10 orijinal ses PBS içinde pelletini. Örneğin, OD 600 = 0.4, 3 ml pellet haline getirilmiştir, daha sonra PBS, 300 ul içinde tekrar süspansiyon. NOT: Bu hayvan aşılama için kullanılan nihai bakteriyel süspansiyon (~ 1 × 10 9 CFU / ml) 'dir.
  6. RSeri seyreltme için bu süspansiyondan 50 ul eserve THB agar üzerine kaplama tesisinin inokulum belirlenmesi.
  7. Bu durum, 1 x 10 7 cfu her fareye tatbik edilir, böylece nihai bakteriyel süspansiyonun 10 | il her bir fare inoküle.
    1. , Aşılamak, daha önce 28 açıklandığı gibi, eylemcinin başparmak ve işaret parmağı ve sonra kuyruk immobilize arasındaki ensesinden gevşek cilt güvence altına alarak elle fareyi dizginlemek için.
    2. 200 ul jel yükleme pipet içine adım 2.6 hazırlanan GBS 10 ul hazırlayın. bir uca vajinal lümen içine 5 ila 10 mm takın ve inokulum 10 ul dağıtmak.
      NOT: Jel yükleme ipuçları özellikle genç veya daha küçük farelerde, organ travma ya da yaralanma riskini en aza indirmek için standart 200-ul ipuçları tercih edilir.
    3. Hemen aşılama ardından kuyruk ve w ile fare kaldırma, boyun ense bırakın ve fare arka ucunu yükseltmek~ 1 dakika süreyle sert bir yüzeye ön pençeleri alking.
    4. Görme inokulum herhangi backflow vajinal açıklık inceleyin. Geri tepme görülürse, taze bir pipet lümenine backflow alımını kolaylaştıran, manipüle veya vajinal açılış büyütmek için kullanılabilir. Ayrıca, geri tepme pipet aracılığıyla aspire edilebilir ve yeniden aşılandı.
      Not: topik maddeler, probiyotik organizmalar ya da ilgi duyulan proteinlerin tatbik için, fizyolojik tampon içinde 20 ul hacme kadar vajina sistemine verilebilir.

3. GBS Load belirlememize Vajinal Lumen Swabbing

  1. 100 ul PBS ilave edilerek fare başına bir 1.5 ml mikro santrifüj tüpü hazırlayın. Sadece sürüntü önce, PBS içinde çubukla önceden ıslatın.
  2. Adım 2.7.1 de açıklandığı gibi fare kısıtlamaktadır ve vajinal lümen içine çubukla 10 mm yerleştirin. Yavaşça 4 kez saat yönünde bez döndürmek ve 4 kez vajinal duvarın hafif baskı uygulayarak, saat yönünün aksine.
  3. 100 ul PBS ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bezi aktarın. kaplama öncesi, girdap sürüntü bakterilerin serbest bırakmak için 15 sn ~ için mikrosantrifüj tüpü. Seri olarak 1:10 ila 1 arasında, her PBS numune ve plaka dilüsyonları 20 ul seyreltilmiş: 10.000, üretici talimatlarına göre hazırlanmış farklı ortam agar plakaları üzerinde. 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. GBS kolonileri renkli parlak pembe veya leylak ya görünecektir. Diğer endojen florası inhibe olacak, ya da mavi, beyaz veya gri koloniler olarak görünecektir.

4. Toplama Vajinal Lavaj Sıvısı

  1. Adım 2.7.1 de açıklandığı gibi fare kısıtlamaktadır. 200 ul jel yükleme pipet, pipet vajinal lümen içine PBS 20 ul kullanma. Yavaşça lümen içinde tüm hacim yukarı ve aşağı 4 kez pipetlemeyin ve daha sonra aynı pipet tüm hacmi çekilme. NOT: lavaj sıvısı mukoza ile kalınsa, standart bir 200 ul pipetNihai lavaj sıvısı toplamak için kullanılabilir.
  2. sitokin analizi veya CFU ölçümü için lavaj sıvısı tasarruf ise, 0,7 ml mikrosantrifüj tüp içine dağıtmak. kızışma aşamasını belirleyen ise, cam slayt üzerine lavaj sıvısının en az 5 ul dağıtmak ve bir ışık mikroskobu üzerinde 100X büyütme altında hücreleri gözlemlemek. NOT: östrus aşamalarında örnekler için bakınız Şekil 1.

5. Doku Diseksiyon ve Homojenizasyon

  1. Her fare için, üç 2 ml vidalı kapaklı tüpler (: vajina, serviks ve rahim her doku için bir tane) hazırlar. tüpünün konik şekilli alt kapak - (0.5 g 0,4) 1,0 mm zirkonyum boncukları geniş her tüp doldurun.
  2. Bakteriyel yük miktarının, özellikle de 121 ° C 'de 30 dakika boyunca doku toplama öncesinde hazırlanan borular Otoklav. Her tüpe, steril PBS'nin 500 ul ekle. kazanılan doku ağırlığını hesaplamak için ileride başvurmak üzere otoklav ve kayıt sonra her tüp tartılır.
    3. 2 boğulma ve servikal dislokasyon olarak kabul kurumsal yöntemler kullanılarak fare Kurban. % 70 EtOH ile ventral karın aşağı püskürtün. Steril makas, abdominopelvik boşluğu açmak arka deri ve karın kasları kaldırın ve üreme yolu açıkta kalacak şekilde bağırsakları yerinden.
  3. % 70 EtOH ile makas sterilize gerekirse temizleyin ve her iki rahim boynuzları uterus gövdesi ve yumurtalıkların arasında orta uzunlukta kesilir. makas ve forseps, ayrı viseral yağ, membranlar ve uzak üreme yolundan mesane kullanarak, kaudal hareket.
  4. Adım 5.4 açıklandığı gibi makas sterilize edin. Enine bedenden üreme yolu ayırmak için mümkün olduğunca vulva kadar yakın vajina kesti. Kaldırın ve bozulmamış üreme yolu kaldırmak ve steril Petri kabı yerleştirin.
  5. Yeni bir jilet kullanarak, bir çapraz kesme serviks rahim ayırın. % 70 ile jilet sterilizeDaha sonra EtOH ve bir enine kesim vajinadan rahim ağzı ayırın. NOT: Hala serviks bağlı rahim dokusunun az miktarda olacaktır. hala serviks bağlı vajinal doku az miktarda olacaktır.
  6. Steril forseps kullanarak, kendi 2-ml tüpler PBS içeren ve boncuk homojenize içine dokuların her aktarın. Her bir doku taşıma arasında% 70 EtOH ile forseps temizleyin.
  7. Her bir 2-ml'lik vida başlıklı bir tüp içerisinde tartılır ve doku ağırlığı belirlemek için borunun orijinal ağırlığının çıkartılması. 100 mg - Doku ağırlıkları tipik olarak 20 arasında değişmektedir. Sıkıca vidalı kapaklı tüp sızdırmaz bir doku homojenleştirici maksimum hızda 1 dakika boyunca doku homojen hale getirilir.
  8. 10.000 diferansiyel orta agar plakaları üzerinde: bakteri yükü ölçmek için, seri doku Homojenat ve plaka seyreltileri 01:10 1 ile 25 ul sulandırmak. Adım 3.3 açıklandığı gibi inkübe edin. doku homojenatları dondurmak, sitokin ölçümü için numune saklamak için -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu modelin geliştirilmesi sırasında, birden gözlemler GBS vajinal kolonizasyon süresini etkileyen faktörler konusunda yapılmıştır. Aşılama etkiler GBS bakteriyel kalıcılık de nasıl östrus evresini belirlemek için, fareler vajinal lavaj sıvısının yoluyla aşılama günü sahnelenmiştir. Şekil 1 ile belirlendiği gibi, fare östrus döngüsü dört aşamadan göstermektedir ıslak montaj vajinal lavaj sıvısı, iyi kurulmuş bir yöntem 29. Fareler bu ilk aşamasına göre gruplara ayrıldı ve GBS kalıcılık vajinal svapları ile zaman içinde izlenmiştir. Proestrus aşamasında aşılanmış fareler kızışma başka aşamada, aşılama sırasında (Şekil 2), en diöstrüste özellikle daha uzun GBS ile kolonize edildi. Bu sonuçlara göre, mevcut modelde, fareler, Proestrus aşamasına senkronize bir gün önce, GBS aşılamadan β-estradiyol ile tedavi edilir. Üreme yolu enfeksiyonlarının diğer fare modelleri fareler eksojen östradiol tedavisi 30,31 ile östrus aşamasında sürekli zaman devam etmek patojenik organizmanın bir artış yeteneğini göstermiştir. Bu olgu aynı zamanda GBS ile vajinal kolonizasyon sırasında oluşup oluşmadığını belirlemek için, GBS sebat tekrarlanan β-östradiol tedavisi sırasında izlendi. Sürekli östrus% 90 kolonizasyon sonrası aşılama (Şekil 3A) 2 hafta ile CD-1 farelerinde GBS A909 (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu, ATCC No BAA-1138) kalıcılığı teşvik etti. Aşılamadan önce β-estradiyol bir doz tipik bir deneyde, fareler, sadece% 40-50 bir hafta sonrası aşılama (Şekil 4) kolonize. GBS CFU Bu farelerden kazanılan ortalama koloni yüzdesi (Şekil 3B) taklit eder. Bu sonuçlar, bağımsız deneyler, bu veriler cinler elde edilmiştir, ancakSürekli östrus muhafaza CD-1 farelerinde çoğunda GBS vajinal kalıcılığını arttırdığı Trate.

GBS izole farklı insan kullanılarak kolonizasyon deneyler birlikte, bu suşlar birkaç günden bir ay ötesine uzanan, bir CD-1 farelerinde devam etme yeteneği değişik olduğu gözlenmiştir. Suşları test edilen, NCTC 10/84 kısa süre, A909 vardı ve gerilme CJB111 (veriler gösterilmemiştir) bir ay bile aşan iki hafta içinde (Şekil 4) ve farelerde çoğunda devam ise COH1, bir ila iki hafta içinde kalıcı . Bugüne kadar, serotip ve fare vajinal kanalda devam yeteneği hiçbir gözlenen korelasyon olmuştur; Bununla birlikte, tek tek GBS soyları arasında anlamlı bir fark 25 bildirilmiştir. Birden fazla kendilenmiş ve outbred fare hatları kolonize GBS yeteneği de incelenmiştir. GBS soyu A909 Dışarıda gelişen CD-1, yaklaşık bir hafta boyunca vajinal kanalın kalıcıfareler ve doğuştan FVB fareler (Şekil 5). Seçenek olarak ise, doğal BALB / c ve C57BL / 6 çoğunluğu bir hafta (Şekil 5) kolonize ve bir ay ya da (veriler gösterilmemiştir) dışına kolonize kalmıştır.

Bu protokol kullanılarak, in vivo olarak GBS vajinal kolonizasyonu bir plazmid GFP-ifade GBS soyu farelere inoküle ve flüoresan mikroskopi için doku toplama ile görünür hale getirildi. GFP-GBS Hem vajinal epitel (Şekil 6A) ve diğer yerel vajinal bitki (Şekil 6B) yakın murin kalarak tespit edildi. Hiçbir GFP sinyali doku toplama zamanında, GFP-GBS temizlenmiş farelerde tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir).

Şekil 1
Şekil 1: boyanmamış Fare Vajinal Lavaj Fluid gelen östrüsün Sahne belirlenmesi. (A) Proestrus: bol çekirdekli skuamöz epitel hücreleri (siyah oklar). (B) östrus: bol boynuzlaşan skuamöz epitel hücreleri (mavi oklar). (C) ostrus: çekirdekli ve boynuzlaşan skuamöz epitel hücrelerinin karışımı ve ağırlıklı olarak lökositler (gri oklar). (D) diöstrüste: bol lökosit. Büyütme = 100X, ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: GBS Östrus Sahne Etkileri Vajinal Sebat. CD-1 fareleri yüzdesi zaman 1 x 10 7 cfu GBS A909 kolonize. Vajinal lavaj ile saptandığı haliyle, GBS aşılama sırasında estrojen aşamasına göre - (11 / grup, n = 7) fareler gruplandı sıvı. Bir bağımsız deney gösterilmiştir. Bu rakam daha önce yayınlanan iş değiştirilmiş ve izni 19 yeniden basıldı olmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: β-östradiol ile devam Tedavi GBS Vajinal Sebat arttırır. Yüzde kolonize (A) ya da CFU 1 x 10 7 cfu GBS A909 ile aşılanır ve β-estradiyol tedavi muhafaza CD-1 fareleri (n = 10), (B) iyileşti. Fareler bir gün önce GBS aşılama ve gün 1, 3 β-östradiol enjekte ve 5 sonrası aşılama bulundu. Bir bağımsız deney gösterilmiştir. (B) çizgi CFU kurtarıldı ortalama temsil eder. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: GBS suşlar Vajinal Kanalında Persist Onların yeteneği farklıdır. Outbred CD-1 fareleri (n = 10 / grup), belirli bir GBS soylarının 1 x 10 7 CFU ile bir gün önce GBS aşılamadan β-estradiyol tek bir doz enjekte edilmiştir. Her cins ile deneyler bağımsız olarak yapılmış ve en az üç kez tekrar edilmiştir; bir temsilci sonuç gösterilir. Bu rakam daha önce yayınlanan iş değiştirilmiş ve izni 25 ile yeniden basıldı olmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Güncelle / 54708 / 54708fig5.jpg "/>
Şekil 5: Fare suşlar Onların yeteneği de Farklı Vajinal Kanalında GBS ile kolonize olma. Belirtilen arka suşlarından Fareler 1 x 10 7 cfu GBS A909, bir gün boyunca inokülasyondan önce β-estradiyol tek bir doz enjekte edilmiştir. Her cins ile deneyler bağımsız olarak yapılmış ve en az iki kez tekrarlandı; bir temsilci sonuç gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: Fare Vajinal Yolu içinde GBS Floresan Görüntüleme. Büyütmede vajinal epiteli boyunca GBS (yeşil) GFP ifade eden görselleştirme = 630X, ölçek çubuğu 50 mikron (A) ve yakın endogenou için =büyütmede s vajinal mikroplar = 1,000X, = 20 mikron (B) Ölçek çubuğu. Mavi leke = DAPI. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tablo 1
Tablo 1: Vajinal Kolonizasyon Çalışmaları Kullanılan GBS SUŞLARINA ve Fare Hatları derlenmesi. GBS arka suşu fare hatları ve β-estradiyol dozajı gösterilir. Bu çalışmada tarif modeli kullanılarak yapılan çalışmalar gri vurgulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ev sahibi kapsamında ana ve diğer mikropların iki GBS etkileşimlerinin anlaşılması ilerletilir, bir hayvan modeli gereklidir. Bu çalışma farelerde GBS vajinal kolonizasyonu kuran teknik yönlerini açıklar. Bu protokol, bakterilerin aşılanması veya aşının kalınlaşmasına vajinal ön yıkama ya da katkı maddeleri kolonizasyon etkinleştirme çubukla örnekleri, immün gidericiler toplamak için anestezi kullanılmadan farelerin>% 90 kolonizasyon elde edilir. Ayrıca, bu model GBS sebat uzunluğu ve bakteriyel yükü hem de mütevazı arası deneysel değişkenliği ile sağlam tekrarlanabilirliği, göstermektedir. Bu çalışmada gösterilmiştir temsilcisi sonuçları bağımsız deneyler derlenmesi ve gelecek deneysel tasarım için bir referans olmalıdır; Ancak, GBS suşları ve fare hatları üzerinden doğrudan karşılaştırmalar dikkatle yapılmalıdır.

Bu model, insan colonizati taklitFarelerin bu mukozal vajinal GBS kolonizasyonu üzerinde üreme sisteminde sınırlı görünmektedir. Serviks ve rahim içine yükseliş birden GBS 25 suşları gözlenmiştir rağmen, fareler bile kolonizasyon ay sonra, morbidite ve mortalite belirtileri göstermez. Ayrıca, GBS bağlı ve fare suşları okudu, fareler bakteriyel faktörleri incelemek ve sırasıyla immün yanıtları ev sahipliği için yararlıdır tutarlı ya da geçici vajinal kolonizasyonu, görüntüler. Bu modelde, bazı fareler aralıklı kolonizasyonu gösterir; fareler, daha sonraki zaman noktalarında recolonized hale olup, şu anda bilinmeyen veya kolonizasyon belirli zaman noktalarında tipik olarak 50 ila 100 CFU saptama sınırının, altına düşerse. kolonize olan ve olmayan kolonize fareler birlikte birkaç hafta içinde yerleştirilmiştir zaman notun, fareler arasındaki iletim gözlenmemiştir (veriler gösterilmemiştir).

Bu yöntem piyasada bulunan seçici ve diferansiyel orta kullanırGBS fare bakteri yükünü ölçmek için. GBS inkübasyon 24 saat sonra kolayca görülebilir parlak pembe ya da leylak rengi koloniler yetişir. Bu ortam, kan agar Granada ortamı 32 de dahil olmak üzere diğer ortamlara kıyasla GBS tespit edilmesi için daha yüksek bir duyarlılığa sahip olduğu gösterilmiştir ve klinik GBS 18 izole teyit etmek için, lateks boncuk aglutinasyon testi ile kombinasyon halinde kullanılmaktadır. Bu çalışmada, sigara GBS Parlak pembe veya leylak rengi koloniler fareler kurtarıldı asla kolonize. Bazı endojen florası, genellikle Enterococcus türleri, mavi koloniler olarak büyüyecek ve bazı koloniler, beyaz, gri ya da çok soluk pembe görünür. Önemli olarak, plakalar kuluçka makinesi içinde ya da daha uzun süre için masa üstü bırakılırsa olmayan GBS koloniler pembe pigment dahil edilebilir, kuluçkadan 18 ila 24 saat sonra sayılmalıdır. Daha önce 32 bildirilmiştir gibi S. pyogenes izolatlar CHROMagar StrepB pembe koloniler oluşturur ki, gözlemlenen, ama bu Cıolonies GBS koloniler genellikle daha küçüktür. S. pyogenes, bu çalışmalarda, farelerin endojen vajinal floradan izole edilmemiştir ancak bu gözlem gelecek çalışmalarında dikkate alınmalıdır.

Sonuçların çoğunluğu fareler 19 çoğunda daha sonra bakteriyel aralık ile, ilk birkaç gün içinde sonradan aşılama sağlam doğal bağışıklık tepkilerini gösterir Dışarıda gelişen CD-1 fare hattı, elde edilmiştir. Diğerleri de ek GBS suşlarının test ettik ve daha uzun kalıcılığı süreleri 33,34 gözlemledik. Bu modelin geliştirilmesi yana, diğer gruplar utero 34,38 fetüs için konak immün yanıtların 33,35, önleyici tedaviler 36,37 ve iletim etkisini incelemek için GBS vajinal kolonizasyon benzer fare modellerini geliştirmeye başlamışlardır. Bu farklılıklar, bağışıklık karşılıklarının ve t etki genetik belirleyiciler de dahil olmak üzere, çeşitli faktörlere açıklanabiliryerli vajinal floranın o kompozisyon. Biz GBS vajinal kolonizasyon çalışmaları (Tablo 1) Bugüne kadar çalışılmıştır GBS suşları ve ilgili fare hatları bir listesini derledik. Hayvan modelleri son çalışmaların sayısı GBS patogenezi araştırma alanında modelleri, bu tür ilgi ve gerektiğini belirtmektedir.

Vajinal kanalın içinde, mukozal bağışıklığın sıkı bu modelde tarif edildiği gibi, bağışıklık tepkisini bozan, steroid hormonları 44 ve β-estradiyol bile bir doz ile düzenlenir. Öyle olsa bile, etkilenen immün yanıtları büyük ölçüde sağlam olduğunu öne sürerek GBS kolonizasyon 19,25 ilk birkaç gün içinde sağlam doğuştan gelen bağışıklık yanıtları vardır. Bu çalışmada (Şekil 3) ve diğerleri 33 ile gösterildiği gibi, GBS vajinal sebat uzatabilir β-östradiol enjeksiyonu tekrarlanan barındırır modelleri. Ancak bağışıklık tepkileri ve üreme yolu fiziksel durumlarıology daha yorumlamak sonuçları zorlaştırır şaşırmış olabilir. Önemlisi, farklı GBS genelinde açıklanan farklılıklar izole eder ve bu çalışmada fare suşları sürekli kızışma modelleri sırasında değişmiş olabilir ve gelecekteki çalışma araştırılmalıdır. Notun, kızgınlık sahne ne GBS serotipi ne sıçan modelinde 22 vajinal kolonizasyonu etkiledi. Buna ek olarak, 3,6 45 ila 4.5 arasında, insan asidik vajinal pH ölçüde GBS gen ekspresyonunu ve kolonizasyon katkıda sonra faktörler etkileyebilir 6.5 46 daha nötr sıçangil vajinal pH farklıdır. Son olarak, doğal vajinal floranın insan vajinal florayı taşıyan gnotobiyotik farelerde GBS kolonizasyonu incelemek gerekir insanlar ve fare modeli meslektaşları ve gelecekte yapılacak çalışmalar arasında farklıdır.

Özetle, bu çalışmalar GBS vajinal kolonizasyonu yöneten ana ve bakteriyel faktörleri incelemek için çalışmışlardır. Öncelikle, GBS vajinal col sağlam, yenilikçi bir hayvan modeliBu çalışmada geliştirilen onization in vivo vajinal ortamda kompleks konak Mikrop Etkileşimleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu modelde elde edilen bilgiler zaten büyük ölçüde konağın immün bileşenleri ve GBS vajinal kalıcılığı kontrol belirli GBS genlerinin bilgi artmıştır. Dahası, bu sonuçlar ek soruları artırdı ve yeni tedavilerin daha da geliştirilmesi anne GBS vajinal kolonizasyon ve yenidoğan sonraki maruz kalma sınırı için yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Tags

Enfeksiyon Sayı 117 B Grubu GBS, Vajinal kolonizasyon modeli fare modeli bakteriyel konak etkileşimi
B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine … More

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter