Summary
Der Zweck dieses Protokolls ist die menschliche Gruppe B Streptococcus (GBS) vaginale Besiedlung in einem Mausmodell zu imitieren. Dieses Verfahren kann verwendet werden, Wirtsimmunantworten und bakterielle Faktoren zu untersuchen, um GBS vaginal Persistenz beitragen, sowie therapeutische Strategien testen.
Abstract
Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus, GBS) ist ein Gram-positive, asymptomatische Besiedler des menschlichen Magen - Darm - Trakt und vaginalen Trakt von 10 - 30% der Erwachsenen. In immungeschwächten Personen, einschließlich Neugeborene, Schwangere und ältere Menschen, wechseln kann GBS zu einem invasiven Erreger der Sepsis, Arthritis, Pneumonie und Meningitis. Da GBS ein führender bakterielle Erreger von Neugeborenen ist, wird der Strom Prophylaxe von späten Schwangerschaft Screening umfasste für GBS vaginale Besiedlung und die anschließende peripartum Antibiotika-Behandlung von GBS-positiven Müttern. Schwere GBS vaginale Belastung ist ein Risikofaktor für beide Neugeborenen Krankheit und Kolonisation. Leider ist wenig über den Host und bakterielle Faktoren bekannt, die zu fördern oder GBS erlauben vaginale Besiedlung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ermittlung persistent GBS vaginal Kolonisierung eine einzelne β-Estradiol Vorbehandlung und tägliche Probennahme unter Verwendung von bakterieller loa zu bestimmen,d. Es weitere Details Methoden zusätzliche Therapien oder Reagenzien von Interesse zu verwalten und vaginalen Lavage und Fortpflanzungstraktes Gewebe zu sammeln. Dieses Mausmodell wird das Verständnis des GBS-Wirt-Interaktion in der vaginalen Umgebung fördern, die potentielle therapeutische Targets führen mütterliche vaginale Besiedlung während der Schwangerschaft zu kontrollieren und Übertragung an den gefährdeten Neugeborenen zu verhindern. Es wird auch von Interesse sein, zu unserem Verständnis der allgemeinen Bakterien-Wirt-Interaktionen in der weiblichen vaginalen Trakt erhöhen.
Introduction
Streptococcus agalactiae, Streptococcus Gruppe B (GBS), ist eine gekapselte, Gram-positives Bakterium , das häufig aus dem Darm und Urogenitaltrakt von gesunden Erwachsenen isoliert. In den 1970er Jahren entstand GBS als führende Mittel von Infektionsneugeborenensterblichkeit, mit mehr als 7.000 Fälle von Neugeborenen Krankheit jährlich 1. Frühem Beginn GBS Krankheit (EOD) tritt in den ersten Stunden oder Tage des Lebens, stellt sich eine Lungenentzündung oder Atemnot, und entwickelt sich oft in Sepsis, während late-onset-Krankheit (LOD) erfolgt nach mehreren Monaten und präsentiert mit Bakteriämie, die häufig Fortschritte 2 bis Meningitis. Ab 2002 empfiehlt die Centers for Disease Control and Prevention Universal-Screening für GBS vaginale Besiedlung im späten Schwangerschaft und intrapartum Antibiotikaprophylaxe (IAP) zu GBS-positiven Müttern 1. Trotz der Reduktion der early-onset Krankheit auf etwa 1.000 Fälle in den Vereinigten Staaten jährlich aufgrund von IAP,GBS bleibt die häufigste Ursache für früh einsetzende neonatale Sepsis und late-onset Auftreten bleibt unberührt 1. Ob in utero, während der Arbeit oder sogar in late-onset Fällen erfordert neonatale Exposition gegenüber GBS Überleben, quer durch eine Reihe von Host-Umgebungen und Barrieren, Immunevasion, und, im Fall von Meningitis, Überquerung der stark regulierten blut- Hirn - Schranke 2. Upstream dieser virulenten Wechselwirkungen innerhalb des Neugeborenen ist die erste Besiedlung des mütterlichen vaginalen Trakt. Mütterliche GBS vaginale Besiedlung Preise von 8-18% reichen in Industrie- und Entwicklungsländern, mit einer geschätzten durchschnittlichen Rate von 12,7% 3,4. GBS Besiedlung des vaginalen Trakt während der Schwangerschaft kann bei einzelnen Frauen 5 in der Natur konstant, intermittierend, oder vorübergehend sein. Interessanterweise ist ein mütterliches Alter> 36 Jahren mit anhaltenden Kolonisation 6. Zahlreiche biologische und sozioökonomische Risikofaktoren für GBS vaginale Besiedlungwurde identifiziert. Biologische Faktoren gehören Magen - Darm - GBS Besiedlung und das Fehlen von Lactobacillus im Darm. Allerdings, der ethnischen Zugehörigkeit, Fettleibigkeit, Hygiene und sexuelle Aktivität auch mit GBS vaginal Wagen 7 in Verbindung gebracht worden.
Obwohl berüchtigt für neonatale Infektionen verursacht, verursacht GBS auch eine Vielzahl von Infektionen der Mutter sowohl peripartum und nach der Geburt. GBS Schlitten ist bei Frauen erhöhte sich mit Vaginitis präsentiert 8 und, in einigen Fällen kann sogar der Krankheitseinheit 9 sein. Zusätzlich GBS Aufstieg des Fortpflanzungstraktes während der Schwangerschaft im innerFrucht Infektion oder chorioamnionitis 10 führen kann. Darüber hinaus kann in bis zu 3,5% der Schwangerschaften, verbreitet GBS in die Harnblase 11 mit einer Infektion der Harnwege oder asymptomatische Bakteriurie zu verursachen. GBS bacteriuria während der Schwangerschaft ist mit einem erhöhten Risiko von intrapartum Fieber, chorioamnionitis, Frühgeburt verbunden sind, und premature Bruch von Membranen 12. Zusammengenommen ist das Vorhandensein von GBS innerhalb der vaginalen Trakt, um Infektionen von mehreren Wirtsgewebe verbunden sind, und die Fähigkeit, GBS aus dieser Nische zu beseitigen ist zwingend notwendig, sowohl von Müttern und Neugeborenen Gesundheit.
Bis vor kurzem war der Großteil der Arbeit untersuchen GBS Wechselwirkungen mit dem zervikovaginalen Trakts beschränkt auf in vitro Zellmodellen 13-15. Diese in vitro - Experimente haben bakterielle Faktoren ergeben , dass für die Einhaltung von Bedeutung sind, einschließlich der Oberflächenproteine eine solche Pili und Serin--rich repeats 17,18 sowie Zweikomponentenregulierungssysteme 15,19 und die globale Transkriptionsantwort des vaginalen Epithels GBS 19. Um jedoch alle die Wirt-Mikroben-Interaktionen innerhalb der vaginalen Trakt aufzuklären, ein robustes Tiermodell notwendig. Frühe Arbeiten zeigten , dass GBS kann aus dem vaginalen Trakt von geimpften Mäusen und Ratten 20,21 gewonnen werden <sup> 22 in beiden schwangeren und nicht schwangeren Bedingungen. Im Jahr 2005 wurde kurzfristige GBS vaginale Besiedlung bei Mäusen modelliert , um die Wirksamkeit eines Phagen lytisches Enzym zu untersuchen , vaginale GBS über einen Zeitraum von 24 h 23 zu behandeln. Einige Jahre später wurde ein Modell vaginale Besiedlung Maus GBS Langzeit entwickelt Wirt und bakterielle Faktoren Persistenz Regierungs GBS zu studieren. Dieses Modell hat zahlreiche GBS Faktoren einen Beitrag zur Besiedlung, einschließlich der Oberflächen Anhängsel identifiziert 17,18 und GBS Zweikomponentensysteme 19,24. Dieses Modell wurde zur Identifizierung von Wirtsreaktionsmechanismen beigetragen 19,25 und wurde verwendet , um mehrere therapeutische Strategien zu testen, einschließlich immunmodulatorische Peptide 26 und 27 Probiotika. Dieses Protokoll gibt die notwendige Führung GBS in die Maus vaginalen Trakt zu impfen und anschließend Besiedlung zu verfolgen und sammeln Proben für weitere Analysen.
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Protocol
Alle Tier Arbeit wurde durch das Amt für Lab Animal Care in San Diego State University und führte unter anerkannten Veterinär Standards zugelassen. Weibliche Mäuse, Alter 8 bis 16 Wochen wurden für die Entwicklung dieser Methode verwendet.
1. Herstellung und intraperitoneale Injektion von β-Östradiol
- Messen Sie β-Estradiol (0,5 mg / Maus) auf dem Papier wiegen, während geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen (PPE). ACHTUNG: β-Östradiol durch die Haut und der Schleimhäute absorbiert werden.
- Übertragen β-Estradiol in ein 15-ml konischen Röhrchen und Wirbel, bis alle Klumpen entfernt und das β-Estradiol ist ein feines Pulver. Zeichnen Sie up Sesamöl (100 ul / Maus) in einen 10-ml-Spritze. Spritzenfilter Sesamöl in den 15-ml konischen Röhrchen, enthaltend das β-Östradiol unter Verwendung eines 0,45-um-Filter. Vortex, um die 15-ml konischen Röhrchen, bis das β-Estradiol eine homogene Suspension in dem Sesamöl ist.
- Zeichnen Sie auf die β-estradiol Suspension in eine neue 10-ml-Spritze. Mit einer 18 G, 1-in. Nadel Aliquot 100 ul der Suspension in 1 ml-Tuberkulin-Spritze. Bereiten Sie eine Spritze für jede Maus. Legen Sie eine neue, sterile 26 G, ½-in. Nadel auf jeder Tuberculinspritze.
- Verabreichen 0,5 mg des β-Estradiol in 100 ul Sesamöl suspendiert (5 mg / ml) in jede Maus 24 Stunden vor der bakteriellen Inokulation. Injizieren jede Maus innerhalb der Bauchhöhle, in den unteren Bauch Quadranten, gerade nach rechts oder links von der Mittellinie, wie zuvor beschrieben 28.
HINWEIS: Keine Reinigung oder Clipping von der Injektionsstelle notwendig ist.
2. Vaginal Inokulation mit GBS
- Einen Tag vor der Inokulation wachsen, um eine 5-ml über Nacht Flüssigkultur eines GBS-Stamm von Interesse, wie A909 (Serotyp Ia), in Todd Hewitt-Brühe (THB) bei 37 ° C.
- Subkultur der GBS über Nacht Kultur bei 1:10 Volumen in frisches THB und Inkubation bei 37 ° C. wachsen dieBakterien bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD 600 = 0,4-0,5). HINWEIS: Dies dauert normalerweise 2 - 3 Stunden, abhängig von der Belastung von GBS.
- Übertragen Sie die Subkultur in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und Pellet-Bakterien bei 3000 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren der Bakterienpellet in 200 & mgr; l steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
- Unter Verwendung des resuspendierten Pellets, bringen 3-5 ml PBS (1 ml pro 10 Mäuse) genau OD 600 = 0,4 in einem neuen 5-ml - Kulturröhrchen. Dadurch wird eine Konzentration von ~ 1 × 10 8 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml sein. Transfer in ein neues 15 ml konischen Röhrchen und erneut pelletieren, die Bakterien bei 3.000 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren.
- Resuspendieren des Pellets in PBS das ursprüngliche Volumen bei 1/10. Wenn beispielsweise 3 ml OD 600 = 0,4 wurde pelletiert, resuspendiert dann in 300 ul PBS. ANMERKUNG: Dies ist der letzte Bakteriensuspension (~ 1 × 10 9 CFU / ml) für die Tierimpfung verwendet.
- Reserve 50 ul dieser Suspension für die serielle Verdünnung und Plattierung auf THB Agar die genaue Inokulum zu bestimmen.
- Beimpfen jeder Maus mit 10 ul der endgültigen Bakteriensuspension so dass 1 × 10 7 CFU an jede Maus verabreicht.
- Die Maus manuell zu impfen, zurückhalten , indem die lose Haut am Genick zwischen der Handler Daumen und Zeigefinger und dann Immobilisierung der Schwanz zu sichern, wie zuvor 28 beschrieben.
- Zeichnen bis 10 ul der GBS, hergestellt in Schritt 2.6 in einen 200-ul Gel Ladepipettenspitze. Legen Sie die Spitze 5 bis 10 mm in die Vaginallumen und verzichtet die 10 ul Inokulum.
HINWEIS: Um das Risiko von Organtrauma oder Verletzungen zu minimieren, vor allem bei jüngeren oder kleineren Mäuse Gel Ladespitzen werden über Standard-200-ul-Tipps bevorzugt. - Unmittelbar Impfung folgenden, lassen Sie die Schopfe und heben das Hinterende der Maus, die Maus am Schwanz heben und walking den Vorderpfoten auf einer harten Oberfläche für ca. 1 min.
- Sichtprüfung für jede Rückfluss von Inokulum die vaginale Öffnung. Wenn Rückstau beobachtet wird, kann eine frische Pipettenspitze verwendet werden, zu manipulieren oder die vaginale Öffnung vergrößern, erleichtert die Aufnahme des Rückstau in das Lumen. Zusätzlich über eine Pipette und erneut inokuliert kann Rückstau abgesaugt werden.
HINWEIS: Bei Verabreichung von topischen Mitteln, probiotischer Organismen oder Proteine von Interesse, ein Volumen von bis zu 20 & mgr; l in einem physiologischen Puffer kann in den vaginalen Trakt gegeben werden.
3. Abtupfen die Vaginallumen zu GBS laden Quantifizieren
- Bereiten Sie eine 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pro Maus durch Zugabe von 100 ul PBS. Unmittelbar vor dem Abtupfen, den Tupfer in PBS vorbefeuchtenden.
- Begrenze die Maus, wie in Schritt 2.7.1 und legen Sie den Tupfer 10 mm in das Vaginallumen beschrieben. Vorsichtig drehen Sie den Tupfer 4-mal im Uhrzeigersinn und 4-mal gegen den Uhrzeigersinn, leichten Druck auf die Scheidenwand anwenden.
- Bringen Sie den Tupfer auf die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 ul PBS. Vor dem Beschichten, Wirbel der Mikrozentrifugenröhrchen für ~ 15 Sekunden, die Bakterien aus dem Tupfer zu lösen. verdünnen Abwechselnd jede Probe in PBS und Platte 20 ul-Verdünnungen 01.10 bis 1: 10.000 auf Differenzierungsmedium-Agar-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 24 Std. GBS Kolonien entweder hell rosa oder lila in Farbe erscheinen. Andere endogene Flora wird gehemmt, oder wird als blau, weiß oder grau Kolonien erscheinen.
4. Sammeln Vaginal Lavage
- Begrenze die Maus, wie in Schritt 2.7.1 beschrieben. Mit Hilfe eines 200-ul Gel Ladepipettenspitze, pipettieren 20 ul PBS in das Vaginallumen. Pipettieren vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 4-mal innerhalb des Lumens, und dann das gesamte Volumen in der gleichen Pipettenspitze zurückziehen. HINWEIS: Wenn die Spülflüssigkeit mit Schleim ist dick, ein Standard 200 ul Pipettenspitzekann die endgültige Spülflüssigkeit zu sammeln verwendet werden.
- Lavage für Zytokin-Analyse oder CFU Quantifizierung verzichtet werden in einem 0,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen Wenn sparen. Wenn die Bestimmung der Phase der Brunst, verzichtet werden mindestens 5 & mgr; l Waschflüssigkeit auf einen Glasträger und beobachten Sie die Zellen unter 100-facher Vergrößerung auf einem Lichtmikroskop. HINWEIS: Für die Beispiele von estrous Stufen siehe Abbildung 1.
5. Gewebe Dissection und Homogenisieren
- Für jede Maus, bereiten drei 2-ml-Schraubverschluss Röhrchen (eine für jedes Gewebe: Vagina, Gebärmutterhals und Gebärmutter). Füllen Sie jedes Röhrchen mit reichlich (0,4-0,5 g) 1,0 mm Zirkoniaperlen die kegelförmigen Boden des Röhrchens zu decken.
- Autoclave die vorbereiteten Röhrchen vor dem Sammeln von Gewebe für 30 Minuten bei 121 ° C, vor allem, wenn bakterielle Belastung zu quantifizieren. Hinzufügen 500 ul sterilem PBS in jedes Röhrchen. Wiegen Sie jedes Röhrchen nach dem Autoklavieren und Aufzeichnung zum späteren Nachschlagen gewonnen Gewebegewicht zu berechnen.
- Sterilisieren Sie die Schere mit 70% EtOH, sauber wischen, wenn nötig, und schneiden beide Uterushörner halber Länge zwischen der Gebärmutterkörper und der Ovarien. Mit einer Schere und Pinzette, separates viszerale Fett, Membranen und die Harnblase entfernt von der Fortpflanzungsorgane, bewegen kaudal.
- Sterilisieren Schere, wie in Schritt 5.4 beschrieben. Transversely schneiden die Vagina so nah an der Vulva wie möglich auf die Fortpflanzungsorgane vom Körper zu trennen. Heben und entfernen Sie die intakte Fortpflanzungstrakt und legen Sie sie in einer sterilen Petrischale.
- Mit Hilfe einer neuen Rasierklinge, trennen Sie die Gebärmutter aus dem Gebärmutterhals in einem Querschnitt. Sterilisieren Sie die Rasierklinge mit 70%EtOH, und trennen sich dann die Zervix von der Vagina in einem Querschnitt. HINWEIS: Es wird immer noch eine minimale Menge an uterine Gewebe des Gebärmutterhalses angebracht sein. Es wird eine minimale Menge von vaginalen Gewebe immer noch auf den Gebärmutterhals angebracht.
- Mit einer sterilen Pinzette, übertragen jede der Gewebe in ihre jeweiligen 2-ml-Röhrchen, die PBS und Homogenisieren Perlen. Reinigen Sie die Zange mit 70% EtOH zwischen den einzelnen Gewebe Handhabung.
- Wiegen Sie jede 2-ml Schraubdeckel Rohr und subtrahieren das ursprüngliche Gewicht des Glases, das Gewebe Gewicht zu bestimmen. Gewebegewichte variieren typischerweise zwischen 20 bis 100 mg. die Schraubkappe Rohre dicht versiegeln und die Gewebe für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit in einem Gewebe-Homogenisator homogenisiert.
- Bakterienbelastung, verdünnte seriell 25 ul Gewebehomogenat und Platte Verdünnungen 01.10 bis 1 zu quantifizieren: 10.000 auf Differenzierungsmedium-Agar-Platten. Inkubieren Sie die Platten, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Zum Speichern von Proben für die Zytokin-Quantifizierung, gefrier Gewebehomogenisate bei -20 ° C.
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Representative Results
Bei der Entwicklung dieses Modells wurden mehrere Beobachtungen in Bezug auf Faktoren, welche die Dauer von GBS vaginale Besiedlung beeinflussen. Um zu bestimmen, wie estrous Stufe bei der Impfung Auswirkungen GBS bakterielle Persistenz, Mäuse wurden am Tag der Impfung über vaginalen Lavage in Szene gesetzt. Abbildung 1 zeigt die vier Stufen der Maus Östrocyclus, bestimmt durch nass-Mount vaginalen Lavage, ein gut etabliertes Verfahren 29. Mäuse wurden in Gruppen eingeteilt, basierend auf dieser ersten Phase und GBS Persistenz wurde im Laufe der Zeit über vaginale swabbing überwacht. Mäuse am Proöstrus Stufe beimpft wurden mit GBS kolonisiert länger als jede andere Stufe des Östrus, insbesondere solche , in Diöstrus zum Zeitpunkt der Inokulation (Abbildung 2). Basierend auf diesen Ergebnissen, in dem aktuellen Modell werden Mäuse mit β-Estradiol einen Tag vor der Inokulation GBS behandelte sie in die Proöstrus Stufe zu synchronisieren. Andere murine Modelle von Infektionen der Fortpflanzungsorgane haben eine erhöhte Fähigkeit des pathogenen Organismus nachgewiesen bestehen bleiben , wenn Mäuse in der Brunst Stadium durch exogene Östradiolbehandlung 30,31 aufrechterhalten werden. Zu bestimmen, ob dieses Phänomen auch bei vaginal Besiedlung mit GBS auftrat, wurde GBS Persistenz während wiederholter β-Estradiol Behandlung überwacht. Sustained Brunst gefördert GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC # BAA-1138) Persistenz in CD-1 - Mäuse, mit 90% Kolonisation 2 Wochen nach der Inokulation (3A). In einem typischen Experiment mit einer Dosis von β-Estradiol vor der Inokulation wurden nur 40-50% der Mäuse eine Woche nach der Inokulation (Abbildung 4) besiedelt. Die mittlere GBS CFU aus diesen Mäusen gewonnen nachahmt den Prozentsatz der Kolonisation (3B). Obwohl diese Ergebnisse wurden aus unabhängigen Experimenten erhalten, diese Daten Dämonentrate, dass kontinuierliche Östrus aufrechterhalten in den meisten CD-1-Mäuse GBS vaginal Persistenz fördert.
Während Kolonisierung Durchführung von Experimenten unter Verwendung von verschiedenen menschlichen GBS-Isolaten, wurde beobachtet, dass in ihrer Fähigkeit variiert Stämme in CD-1-Mäusen zu persistieren, von einigen Tagen bis hin einen Monat hinaus. Der Stämme getestet, 10/84 NCTC hatte die kürzeste Dauer, A909 und COH1 für ein bis zwei Wochen anhielt, während Stamm CJB111 zwei Wochen in den meisten Mäusen bestand (Figur 4) und auch über einen Monat (Daten nicht gezeigt) . Bis heute hat es keine beobachteten Korrelation des Serotyps und die Fähigkeit, in der Maus vaginalen Trakt zu bestehen; jedoch signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen GBS - Stämme wurden 25 gemeldet. Die Fähigkeit von GBS auf mehrere ingezüchteten und Auszucht Mauslinien kolonisieren wurde ebenfalls untersucht. GBS-Stamm A909 fort in den vaginalen Trakt für etwa eine Woche in outbred CD-1Mäuse und inbred FVB - Mäusen (Abbildung 5). Alternativ wurden die meisten durch Inzucht erzeugten BALB / c und C57BL / 6 in einer Woche (5) kolonisiert und blieb kolonisierten für einen Monat oder darüber hinaus (Daten nicht gezeigt).
Unter Verwendung dieses Protokolls, GBS vaginale Besiedlung in vivo sichtbar gemacht wurde von Mäusen , die mit einem Plasmid GFP-exprimierenden GBS - Stamm und Sammeln von Gewebe für die Fluoreszenzmikroskopie Inokulation. GFP-GBS wurde nachgewiesen sowohl vaginal Epithel (6A) und in unmittelbarer Nähe zu anderen einheimischen Vaginalflora (6B) murinen haften. Keine GFP-Signal wurde bei Mäusen nachgewiesen, die die GFP-GBS zum Zeitpunkt der Gewebesammel gelöscht war (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 1: Die Identifizierung der Phase der Brunst aus Unstained Murine Vaginal Lavage. (A) Voröstrus: reichlich nukleierten Plattenepithelzellen (schwarze Pfeile). (B) Brunst: reichlich verhornten Plattenepithel Epithelzellen (blaue Pfeile). (C) Metöstrus: Mischung von nukleierten und verhornten Plattenepithel Epithelzellen und überwiegend Leukozyten (graue Pfeile). (D) Diöstrus: reichlich Leukozyten. Vergrößerung = 100X, Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: estrous Stufe Auswirkungen Vaginal Persistenz von GBS. Prozent der CD-1 - Mäuse mit 1 × 10 7 CFU GBS A909 über die Zeit kolonisiert. Mäuse wurden gruppiert (n = 7 bis 11 / Gruppe) basierend auf Östrus Stufe zum Zeitpunkt des GBS Inokulation bestimmt durch vaginale lavage Flüssigkeit. Ein unabhängiges Experiment gezeigt. Diese Zahl wurde von zuvor veröffentlichten Arbeit modifiziert und nachgedruckt mit Genehmigung 19. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Fortsetzung der Behandlung mit β-Estradiol Fördert GBS Vaginal Persistenz. Prozent kolonisiert (A) oder zurückgewonnen CFU (B) von CD-1 - Mäuse (n = 10) mit 1 × 10 7 CFU GBS A909 beimpft und auf β-Estradiol - Behandlung aufrechterhalten. Die Mäuse wurden mit β-Estradiol einen Tag vor der GBS Impfung injiziert und an den Tagen 1, 3 und 5 nach Inokulation. Ein unabhängiges Experiment gezeigt. Die Linie in (B) repräsentiert CFU gewonnen bedeuten. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: GBS - Stämme in ihrer Fähigkeit unterscheiden sich in der Vaginal - Darm - Trakt zu bestehen bleiben. Outbred CD-1 - Mäuse (n = 10 / Gruppe) wurden mit 1 × 10 7 CFU der gegebenen GBS - Stämme mit einer Einzeldosis von β-Estradiol einen Tag vor der Inokulation GBS injiziert. Experimente mit jedem Stamm wurden unabhängig voneinander durchgeführt und wurden mindestens dreimal wiederholt werden; ein repräsentatives Ergebnis gezeigt. Diese Zahl wurde von zuvor veröffentlichten Arbeit modifiziert und nachgedruckt mit Genehmigung 25. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 5: Mausstämme in ihrer Fähigkeit , variiert je nach Projekt mit GBS in den vaginalen Trakt kolonisiert. Mäuse aus angezeigt Hintergrund - Stämme wurden mit einer Einzeldosis von β-Estradiol einen Tag vor der Impfung injiziert mit 1 × 10 7 CFU von GBS A909. Experimente mit jedem Stamm wurden unabhängig voneinander durchgeführt und wurden mindestens zweimal wiederholt wird; ein repräsentatives Ergebnis gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Fluorescent Imaging von GBS in der Maus - Vaginal - Trakt. Visualisierung von GFP- exprimierenden GBS (grün) entlang des vaginalen Epithels bei einer Vergrößerung = 630X, Skala bar = 50 & mgr; m (A) und in unmittelbarer Nähe zu endogenous vaginale Mikroben bei Vergrößerung = 1,000x, Skala bar = 20 & mgr; m (B). Blauer Fleck = DAPI. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Zusammenstellung von GBS - Stämme und Mauslinien Verwendetes für Vaginal Colonization Studies. GBS Hintergrund Zerrungen, Mauslinien und Dosierung von β-Estradiol angegeben. Studien das Modell in dieser Arbeit beschriebenen sind grau hinterlegt.
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Discussion
Um die Förderung des Verständnisses von GBS Wechselwirkungen mit der sowohl dem Host und andere Mikroben im Rahmen des Host Ferner ist ein Tiermodell erforderlich. Diese Arbeit beschreibt die technischen Aspekte bei Mäusen GBS vaginale Besiedlung zu etablieren. Dieses Protokoll erreicht> 90% Kolonisierung von Mäusen ohne die Verwendung von Anästhetika Bakterien zu beimpfen, oder Abstrichproben, immununterdrück zu sammeln Kolonisierung, vaginal Vorwaschen zu aktivieren, oder Zusätze, um die Impfkultur zu verdicken. Darüber hinaus zeigt dieses Modell robust Reproduzierbarkeit, mit bescheidenen inter experimentellen Variabilität sowohl in der Länge von GBS die Persistenz und die bakterielle Belastung. Die repräsentativen Ergebnisse in dieser Studie gezeigt, sind die Erstellung von unabhängigen Experimenten und sollte als Referenz für weitere experimentelle Design sein; jedoch sollten direkte Vergleiche zwischen den GBS-Stämme und Mauslinien mit Sorgfalt vorgenommen werden.
Dieses Modell imitiert menschliche colonizatiauf in diesem Schleimhaut erscheint vaginal GBS Kolonisierung von Mäusen auf die Fortpflanzungsorgane beschränkt werden. Obwohl Aufstieg in den Gebärmutterhals und Gebärmutter hat mit mehreren GBS - Stämme 25 beobachtet worden, Mäuse zeigen keine Anzeichen von Morbidität oder Mortalität, auch nach Monaten der Besiedlung. Weiterhin, abhängig von der GBS und Mausstämmen untersucht, zeigen Mäuse konsistent oder transient vaginal Kolonisierung, die zur Untersuchung von Bakterienfaktoren nützlich ist und Immunreaktionen hosten, respectively. In diesem Modell zeigen einige Mäuse intermittierenden Besiedlung; Es ist derzeit nicht bekannt, ob Mäuse zu späteren Zeitpunkten wieder besiedelt werden oder wenn Kolonisierung unter die Nachweisgrenze, die typischerweise 50 bis 100 CFU, zu bestimmten Zeitpunkten. Bemerkenswert ist, die Übertragung zwischen Mäusen nicht, wenn kolonisiert und nicht-kolonisierten Mäusen zusammen über mehrere Wochen untergebracht sind, beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Dieses Verfahren verwendet eine im Handel erhältliche selektive und Differenzierungsmediumfür GBS Maus bakteriellen Belastungen zu quantifizieren. GBS wächst so hell rosa oder lila Kolonien, die gut sichtbar nach 24 Stunden Inkubation sind. Dieses Medium wurde auf andere Medien gezeigt , eine höhere Empfindlichkeit haben GBS zur Detektion verglichen, einschließlich Blut - Agar und Granada Medium 32 und hat in Kombination mit Latexkügelchen Agglutinationstests verwendet GBS 18 klinischen Isolaten zu bestätigen. In dieser Studie, hell rosa oder lila Kolonien aus Nicht-GBS kolonisierten Mäusen haben nie geborgen worden. Einige endogene Flora, in der Regel Enterococcus Spezies, wird wachsen als blaue Kolonien und einige Kolonien erscheinen weiß, grau, oder sehr blass rosa. Wichtig ist, dass Platten nach 18 bis 24 Stunden Inkubation gezählt werden, als nicht-GBS Kolonien das rosa Pigment in dem Inkubator oder am Prüfplatz wenn links für längere Zeiträume beinhalten kann. Wir haben beobachtet, wie zuvor 32 berichtet worden, daß einige S. pyogenes Isolate rosa Kolonien auf CHROMagar StrepB bilden, aber diese colonies sind typischerweise kleiner als GBS Kolonien. S. pyogenes wurde von den endogenen Vaginalflora von Mäusen isoliert in diesen Studien nicht, aber diese Beobachtung sollte in zukünftigen Arbeit berücksichtigt werden.
Der Großteil der Ergebnisse wurden aus der outbred CD-1 - Maus Linie erhalten, die robust angeborenen Immunantworten innerhalb der ersten Tage nach der Inokulation mit anschließender bakteriellen Clearance in der Mehrzahl der Mäuse 19 veranschaulicht. Andere haben auch weitere GBS - Stämme getestet und haben mehr Ausdauer mal 33,34 beobachtet. Da die Entwicklung dieses Modells haben andere Gruppen begonnen ähnliche Mausmodelle von GBS vaginale Besiedlung zu entwickeln , um die Auswirkungen der Wirtsimmunantworten 33,35, präventive Therapien 36,37 und die Übertragung auf den Fötus in utero 34,38 zu untersuchen. Diese Unterschiede können durch eine Vielzahl von Faktoren erklärt werden, einschließlich genetischer Faktoren, die Immunantwort beeinflussen und ter Zusammensetzung der einheimischen Vaginalflora. Wir haben eine Liste der GBS - Stämme und entsprechende Mauslinien zusammengestellt , die bisher in GBS vaginale Besiedlung Studien (Tabelle 1) wurden untersucht. Die Anzahl der jüngsten Studien mit Tiermodellen unterstreicht das Interesse und die Notwendigkeit dieser Art von Modellen im Bereich der GBS Pathogenese Forschung.
Innerhalb des vaginalen Trakt wird Schleimhautimmunität streng reguliert durch Steroidhormone 44, und selbst eine Dosis des β-Östradiol, wie in diesem Modell beschrieben, stört die Immunantwort des Wirts. Trotzdem gibt es robust angeborenen Immunantworten innerhalb der ersten paar Tage der GBS Kolonisierung 19,25, was darauf hindeutet , dass die betroffenen Immunreaktionen weitgehend intakt sind. Modelle , die β-Estradiol Injektionen können verlängern GBS vaginale Persistenz beinhalten wiederholt, wie in dieser Studie nachgewiesen (Abbildung 3) und von anderen 33. Allerdings Immunreaktionen und Fortpflanzungsorgane physiology kann mehr vermischt werden, Ergebnisse schwierig zu interpretieren. die Unterschiede in den verschiedenen GBS beschrieben isoliert und Mausstämme in dieser Studie bei Modellen der nachhaltigen Brunst kann verändert werden und sollte in die künftige Arbeit Wichtig ist, untersucht werden. Zu beachten ist , weder Brunst Stadium noch GBS Serotyp 22 vaginale Besiedlung in einem Rattenmodell beeinflusst. Darüber hinaus unterscheidet sich der menschliche saure vaginalen pH - Wert von 3,6 bis 4,5 45 drastisch von der neutralere murine vaginalen pH - Wert von 6,5 46, die die Expression GBS - Gen auswirken können und nachfolgende Faktoren einen Beitrag zur Kolonisation. Schließlich nativen Vaginalflora unterscheidet zwischen Mensch und Maus-Modell Kollegen, und die zukünftige Arbeit sollte GBS Besiedlung in gnotobiotischer Mäusen, die menschliche Vaginalflora untersuchen.
Zusammenfassend haben diese Studien gesucht Host und bakterielle Faktoren zu untersuchen, die GBS vaginal Kolonisierung regeln. In erster Linie die robuste, innovative Tiermodell der GBS vaginal colonization in dieser Arbeit entwickelt wurden, können komplexe Wirt-Mikroben - Interaktionen in einem in - vivo vaginalen Umgebung zu beschreiben verwendet werden. Die Informationen aus diesem Modell erhalten hat, bereits stark das Wissen der Wirtsimmunkomponenten und spezifische GBS Gene erhöht, die GBS vaginale Ausdauer Kontrolle zu bringen. Darüber hinaus haben diese Ergebnisse weitere Fragen aufgeworfen und nützlich sein wird für die weitere Entwicklung neuartiger Therapeutika mütterlichen GBS vaginale Besiedlung und anschließende Exposition des Neugeborenen zu begrenzen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sesame oil | Sigma Aldrich | S3547-250ML | |
| β-Estradiol | Sigma Aldrich | E8875-1G | CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. |
| 200 μl gel loading pipette tips | USA Scientific | 1252-0610 | |
| Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs | Puritan | 25-801 A 50 | |
| CHROMagar StrepB | DRG International | SB282 | |
| Todd Hewitt Broth | Hardy Diagnostics | 7161C | |
| 18 G, 1.5 inch needles | BD | 305199 | |
| 26 G, 0.5 inch needles | BD | 305111 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 1 ml syringes | BD | 309659 | |
| 0.45 μm PVDF syringe filters | Whatman | 6900-2504 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | 21-031-CV |
References
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