Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Murine modell av gruppe B Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54708
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Host-Microbe Systems & Therapeutics, University of California San Diego School of Medicine, 2Department of Biology and Center for Microbial Sciences, San Diego State University

Summary

Hensikten med denne protokollen er å etterligne humant gruppe B Streptococcus (GBS) vaginal kolonisering i en murin modell. Denne fremgangsmåten kan brukes til å undersøke vertsimmunresponser og bakterielle faktorer som bidrar til GBS vaginal utholdenhet, så vel som for å teste terapeutiske strategier.

Abstract

Streptococcus agalactiae (gruppe B Streptococcus, GBS), er en Gram-positiv, asymptomatisk colonizer av den humane mage-tarmkanalen og vaginal skrift av 10 - 30% av voksne. I svekket immunforsvar personer, inkludert nyfødte, gravide og eldre, kan GBS bytte til en invasiv patogen forårsaker sepsis, leddgikt, lungebetennelse og hjernehinnebetennelse. Fordi GBS er en ledende bakteriell patogen av nyfødte, er aktuell profylakse består av sent i svangerskapet screening for GBS vaginal kolonisering og påfølgende peripartum antibiotikabehandling av GBS-positive mødre. Heavy GBS vaginal byrde er en risikofaktor for både neonatal sykdom og kolonisering. Dessverre er lite kjent om verten og bakterielle faktorer som fremmer eller tillater GBS vaginal kolonisering. Denne protokollen beskriver en teknikk for å etablere vedvarende vaginal GBS kolonisering ved hjelp av et enkelt β-østradiol forbehandling og daglig sampling for å bestemme bakterie load. Det videre detaljer metoder for å administrere flere behandlinger eller reagenser av interesse og for å samle vaginal lavage væske og reproduktive veis vev. Denne musen modellen vil fremme forståelsen av GBS-host samhandling innen vaginal miljøet, noe som vil føre til potensielle terapeutiske mål å kontrollere mors vaginal kolonisering under graviditet og for å hindre overføring til den sårbare nyfødte. Det vil også være av interesse å øke vår forståelse av generelle bakterie-vert interaksjoner i den kvinnelige vaginal kanalen.

Introduction

Streptococcus agalactiae, gruppe B Streptococcus (GBS), er en innkapslet, grampositiv bakterie som ofte isoleres fra tarmen og urogenitalsystem hos friske voksne. På 1970-tallet GBS dukket opp som den ledende agent for smittsomme neonatal dødelighet, med over 7000 tilfeller av neonatal sykdom årlig 1. Tidlig innsettende GBS-sykdom (EOD) oppstår i de første timene eller dagene av livet, oppstår som lungebetennelse eller pustevansker, og ofte utvikler seg til sepsis, mens sent oppstått sykdom (LOD) følger etter flere måneder, og presenterer med bakteriemi, som ofte avanserer til meningitt to. Per 2002, Centers for Disease Control and Prevention anbefaler universell screening for GBS vaginal kolonisering i slutten av svangerskapet og intrapartum antibiotikaprofylakse (IAP) for å GBS-positive mødre 1. Til tross for reduksjon av tidlig debut av sykdommen til ca 1000 tilfeller i USA hvert år på grunn av IAP,GBS er fortsatt den ledende årsak til tidlig debut neonatal sepsis, og sent innsettende forekomst forblir upåvirket en. Enten i utero, under fødselen, eller til og med sen debut tilfeller neonatal eksponering for GBS krever overlevelse, tverrgående gjennom en rekke vertsmiljøer og barrierer, immune evasion, og i tilfelle av hjernehinnebetennelse, kryssing av sterkt regulert blod- hjerne barrieren to. Upstream av disse virulente interaksjoner i det nyfødte barnet er den første kolonisering av morens vaginal kanalen. Mors GBS vaginal koloniserings priser varierer 8-18% i utviklede og utviklingsland, med en anslått gjennomsnittlig rente på 12,7% 3,4. GBS kolonisering av vaginal skrift under svangerskapet kan være konstant, intermitterende, eller forbigående blant enkelte kvinner 5. Interessant er en mors alder> 36 år i forbindelse med vedvarende kolonisering 6. Mange biologiske og sosioøkonomiske risikofaktorer for GBS vaginal koloniseringDet er identifisert. Biologiske faktorer omfatter gastrointestinalt GBS kolonisering og fravær av Lactobacillus i tarmen. Imidlertid har etnisk, fedme, hygiene, og seksuell aktivitet har også blitt assosiert med GBS vaginal vogn 7.

Selv beryktet for å forårsake neonatal infeksjoner, GBS fører også en rekke mors infeksjoner både peripartum og postpartum. GBS vogn er økt hos kvinner som opplever vaginitt 8 og, i enkelte tilfeller kan til og med være sykdom enhet 9. I tillegg kan GBS himmelfart skjede under svangerskapet fører til intra-fostervann infeksjon eller korioamnionitt 10. Videre, i opp til 3,5% av alle svangerskap, GBS formidler til urinblæren til å forårsake en urinveisinfeksjon eller asymptomatisk bakteriuri 11. GBS bakteriuri under svangerskapet er forbundet med økt risiko for intrapartal feber, korioamnionitt, prematur fødsel, og premature vannavgang 12. Tatt sammen, er nærværet av GBS innenfor vaginal kanalen koblet til infeksjoner av flere verts vev, og evnen til å eliminere GBS fra denne nisjen er viktig for både mor og neonatal helse.

Inntil nylig var det meste av arbeidet undersøker GBS interaksjoner med cervicovaginal kanalen begrenset til in vitro cellemodeller 13-15. Disse in vitro forsøk har avdekket bakterielle faktorer som er viktige for etterlevelse, inkludert overflateproteiner slik en pili og serin-rich gjentar 17,18, samt to-komponent regelverk 15,19 og den globale transcriptional responsen av vaginal Epitel til GBS 19. Men for å fullt ut belyse host-mikrobe interaksjoner innenfor skjedekanalen, er en robust dyremodell nødvendig. Tidlig arbeid vist at GBS kan utvinnes fra vaginal skrift av inokulerte mus 20,21 og rotter <sup> 22 i både gravide og ikke-gravide betingelser. I 2005 ble kortvarig GBS vaginal kolonisering modellert på mus for å undersøke effekten av et fag lytisk enzym for å behandle vaginal GBS over en 24 timers periode 23. Flere år senere, ble en langsiktig GBS vaginal kolonisering musemodell utviklet for å studere verts og bakterielle faktorer som styrer GBS utholdenhet. Denne modellen har identifisert en rekke GBS faktorer som bidrar til kolonisering, inkludert overflate vedheng 17,18 og GBS to-komponent systemer 19,24. Denne modellen har bidratt til identifisering av vertsresponsmekanismer 19,25 og ble brukt til å teste flere terapeutiske strategier, inkludert immunmodulerende peptider 26 og probiotika 27. Denne protokollen gir nødvendig veiledning for å vaksinere GBS i musen vaginal kanalen og deretter å spore kolonisering og samle inn prøver for videre analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble godkjent av Office of Lab Animal Care i San Diego State University og gjennomført under aksepterte veterinær standarder. Hunnmus, alder 8 - 16 uker, ble anvendt for utvikling av denne fremgangsmåte.

1. Forberedelse og intraperitoneal injeksjon av β-østradiol

  1. Mål opp β-østradiol (0,5 mg / mus) på veier papir mens iført egnet personlig verneutstyr (PVU). FORSIKTIG: β-østradiol kan absorberes gjennom huden og slimhinneoverflater.
  2. Overfør β-østradiol i et 15 ml konisk rør og virvle inntil alle klumper er fjernet og den β-østradiol er et fint pulver. Utarbeide sesamolje (100 ul / mus) i en 10 ml sprøyte. Sprøyte-filter sesamolje i 15 ml konisk rør inneholdende β-østradiol ved anvendelse av en 0,45-um filter. Vortex 15 ml konisk rør inntil β-østradiol er en homogen suspensjon i sesamolje.
  3. Tegn opp p-estradiol suspensjon inn i en ny 10-ml sprøyte. Med en 18 G, 1-in. nål, alikvoter 100 ul av suspensjonen inn i en ml av tuberkulin sprøyter. Forbered en sprøyte for hver mus. Plasser en ny, steril 26 G, ½-in. nål på hver tuberkulin sprøyte.
  4. Administrere 0,5 mg av β-østradiol suspendert i 100 ul sesamolje (5 mg / ml) til hver mus 24 timer før bakterie inokulering. Injisere hver mus inne i bukhulen, i de nederste mage kvadranter, rett til høyre eller venstre for midtlinjen, som tidligere beskrevet 28.
    MERK: Ingen rengjøring eller klipping av injeksjonsstedet er nødvendig.

2. Vaginal Inoculation med GBS

  1. En dag før inokulering, dyrke en 5 ml over natten flytende kultur av en GBS stamme av interesse, slik som A909 (serotype Ia) i Todd Hewitt medium (THB) ved 37 ° C.
  2. Subkultur GBS-natten kultur ved en 1:10 volum i frisk THB og inkuber ved 37 ° C. Growbakterier til midt-log fase (OD 600 = 0,4-0,5). MERK: Dette vil typisk ta 2-3 timer, avhengig av belastningen av GBS.
  3. Overfør subkultur til et sterilt 15 ml konisk rør og pellets bakterier ved 3000 x g i 5 min. Aspirer supernatanten. Resuspender den bakterielle pellet i 200 mikroliter sterilt fosfatbufret saltvann (PBS).
  4. Ved hjelp av den resuspenderte pellet, ta med 3 - 5 ml PBS (1 ml pr 10 mus) til nøyaktig OD 600 = 0,4 i en ny 5-ml dyrkningsrør. Dette vil være en konsentrasjon på ~ 1 x 10 8 kolonidannende enheter (CFU) / ml. Overføring til en ny 15-ml konisk rør og re-pellet bakterier på 3000 × g for 5 min. Aspirer supernatanten.
  5. Resuspender pelleten i PBS ved 1/10 av det opprinnelige volum. For eksempel, hvis 3 ml OD 600 = 0,4 ble pelletert, så det resuspender i 300 ul PBS. MERK: Dette er det siste bakteriell suspensjon (~ 1 × 10 9 CFU / ml) som brukes for dyr vaksinasjon.
  6. Reserve 50 ul av denne suspensjonen for seriell fortynning og utsåing på THB-agar for å bestemme den eksakte inokulum.
  7. Inokuler hver mus med 10 pl av den endelige bakteriesuspensjonen, slik at en 10 x 7 CFU blir administrert til hver mus.
    1. Å inokulere, begrense mus manuelt ved å feste den løse huden på nakken mellom førers tommelen og pekefingeren, og deretter immobilisering av halen, slik som beskrevet tidligere 28.
    2. Tegn opp 10 mL av GBS utarbeidet i trinn 2.6 til en 200-mL gel lasting pipette. Sett spissen 5 til 10 mm inn i skjeden lumen og dispensere 10 mL av podestoff.
      MERK: Gel lasting tips er å foretrekke i forhold til standard 200-mL tips for å minimere risikoen for organ traumer eller skader, spesielt hos yngre eller mindre mus.
    3. Umiddelbart etter vaksinasjon, slipper nakkeskinnet og løfte bakenden av musen, løfter musen ved halen og walking forlabbene på en hard overflate for ~ 1 min.
    4. Inspiser skjedeåpningen for noen tilbakestrømning av podestoff. Ved tilbakestrømning observeres, kan en ny pipettespiss brukes til å manipulere eller forstørre vaginalåpningen, tilrettelegging opptak av tilbakestrømning inn i hulrommet. I tillegg kan tilbakestrømning suges via pipette og re-inokulert.
      MERK: Hvis administrering av aktuelle agenter, probiotiske organismer, eller proteiner av interesse, et volum opp til 20 pl i en fysiologisk buffer kan gis i vaginal skrift.

3. Swabbing Vaginal Lumen å kvantifisere GBS Load

  1. Fremstille en 1,5-ml mikro-sentrifugerør per mus ved tilsetning av 100 ul PBS. Like før pensling, pre-fukte dott i PBS.
  2. Beherske musen som beskrevet i trinn 2.7.1 og sett pinnen 10 mm inn i skjeden lumen. Forsiktig rotere pinnen 4 ganger med klokken og 4 ganger mot urviseren, å trykke lett vaginal veggen.
  3. Overfør pinnen til 1,5 ml mikrosentrifugerør med 100 mL PBS. Før plating, vortex den mikrosentrifugerør for ~ 15 sek å frigjøre bakterier fra pinnen. Serielt fortynne hver prøve i PBS og plate 20 ul fortynninger 01:10 gjennom 1: 10.000 på differensial medium agarplater utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber platene ved 37 ° C i 24 timer. GBS kolonier vises enten lyse rosa eller lilla i fargen. Andre endogene flora vil bli hemmet, eller vises som blå, hvite eller grå kolonier.

4. Samle Vaginal Lavage Fluid

  1. Beherske musen som beskrevet i trinn 2.7.1. Ved hjelp av en 200-mL gel lasting pipette, pipette 20 mL PBS inn i vaginal lumen. Forsiktig pipettér hele volumet opp og ned 4 ganger i lumen, og deretter trekke tilbake hele volumet i samme pipette tips. MERK: Hvis vaskevæske er tykk med slimete, en standard 200 mL pipette tipskan benyttes til å samle den siste vaskevæske.
  2. Hvis du lagrer vaskevæske for cytokinanalyse eller CFU kvantifisering, dispensere i en 0,7 ml mikrosentrifugerør. Hvis bestemme stadium av estrus, dispensere minst 5 mL vaskevæske på en glassplate og observere cellene under 100X forstørrelse på et lysmikroskop. MERK: For eksempler på østrogen stadier, se figur 1.

5. Tissue Dissection og Homogenisering

  1. For hver mus, forberede tre 2-ml skrukork (ett for hvert vev: vagina, cervix og livmor). Fylle hvert rør med omfattende (0,4 til 0,5 g) 1,0 mm zirkonia perler for å dekke den kjegleformede bunnen av røret.
  2. Autoklav de fremstilte rør før innsamling av vev i 30 minutter ved 121 ° C, særlig hvis kvantifisere bakteriemengde. Legge til 500 mikroliter sterilt PBS til hvert rør. Vei hvert rør etter autoklave og rekord for fremtidig referanse for å beregne gjenopprettet vev vekt.
    3. 2 kvelning og halshugging. Spray ned ventrale abdomen med 70% EtOH. Med steril saks, åpne abdominopelvic hulrom, løfter ryggen huden og magemusklene, og fortrenge tarmen slik at skjede blir utsatt.
  3. Steril saksen med 70% EtOH, tørk om nødvendig, og kuttet både livmor horn mid-lengde mellom livmorkroppen og eggstokker. Ved hjelp av saks og pinsett, separat visceral fett, membraner, og urinblæren fra skjede, flytting caudally.
  4. Steriliser saks som beskrevet i trinn 5.4. Transversalt snitt i vagina så nær vulva som mulig for å separere skjede fra kroppen. Løft og fjern intakt skjede og legg den i en steril petriskål.
  5. Ved hjelp av en ny barberblad, separere livmor fra livmorhalsen i en tverrgående snitt. Sterilisere barberblad med 70%EtOH, og deretter separere cervix fra vagina i en tverrgående snitt. MERK: Det vil være en minimal mengde av livmorvev fremdeles er festet til livmorhalsen. Det vil være en minimal mengde av vaginal vev fremdeles er festet til livmorhalsen.
  6. Ved hjelp av sterile pinsetter, overfører hver av vevet inn i sine respektive 2 ml rør inneholdende PBS og homogenisering perler. Rengjør pinsett med 70% EtOH i mellom håndtering av hver vev.
  7. Veie hver 2 ml skrukork og subtrahere den opprinnelige vekt av røret for å bestemme vev vekt. Tissue vekter typisk variere mellom 20-100 mg. Tett forsegle skrukork rør og homogen vev for en min ved maksimal hastighet i en vev homogenisator.
  8. For å kvantifisere bakteriemengde, serielt fortynnet 25 ul av vevhomogenat og plate fortynninger 01:10 gjennom 1: 10.000 på differensial medium agarplater. Inkuber platene som beskrevet i trinn 3.3. For å lagre prøver for cytokin kvantifisering, fryse vevshomogenater på -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under utviklingen av denne modellen, ble flere observasjoner gjort om faktorer som påvirker varigheten av GBS vaginal kolonisering. For å finne ut hvordan estrous scenen på inokulasjon konsekvenser GBS bakteriell utholdenhet, ble musene iscenesatt på dagen for vaksinasjon via vaginal lavage væske. Figur 1 viser de fire faser av mus brunst, bestemt ved hjelp av våt-typen vaginal vaskevæske, en veletablert metode 29. Musene ble delt inn i grupper basert på denne innledende fasen, og GBS utholdenhet ble overvåket over tid via vaginal swabbing. Mus inokulert ved proestrus fasen ble kolonisert med GBS lenger enn noen annen fase av estrus, spesielt de i diestrus på tidspunktet for inokulasjonen (figur 2). Basert på disse resultatene, i dagens modell blir mus behandlet med β-østradiol en dag før GBS inokulering å synkronisere dem inn i proestrus scenen. Andre murine modeller av reproduktive veisinfeksjoner har vist en økt evne til patogene organismen til å vedvare når mus er vedvarende i estrus scenen gjennom eksogent østradiol behandling 30,31. For å finne ut om dette fenomenet skjedde også under vaginal kolonisering med GBS ble GBS utholdenhet overvåket under gjentatte β-østradiol behandling. Vedvarende estrus fremmet GBS A909 (American Type Culture Collection, ATCC # BAA-1138) utholdenhet i CD-1 mus, med 90% kolonisering 2 uker etter inokulasjon (figur 3A). I et typisk forsøk med en dose av β-østradiol før inokulering, var bare 40-50% av musene kolonis en uke etter inokuleringen (figur 4). Den midlere GBS CFU gjenvunnet fra disse mus etterligner prosentdelen av koloniseringen (figur 3B). Selv om disse resultatene ble oppnådd fra uavhengige eksperimenter, disse data demonertrate at å opprettholde kontinuerlig estrus fremmer GBS vaginal utholdenhet i de fleste CD-1 mus.

Mens gjennomføre kolonisering forsøk under anvendelse av forskjellige humane GBS isolater, ble det observert at påkjenningen variert i deres evne til å vedvare i CD-1 mus, som strekker seg fra flere dager til mer enn en måned. Av de stammer testet, NCTC 10/84 hadde den korteste varighet, A909 og COH1 vedvarte i en til to uker, mens belastningen CJB111 vedvarte i de fleste mus for to uker (figur 4) og også utover i måneden (data ikke vist) . Hittil har det ikke vært observert noen sammenheng mellom serotype og evne til å vedvare i musen vaginal skrift; har imidlertid betydelige forskjeller mellom de enkelte GBS-stammer som er rapportert 25. Muligheten av GBS å kolonisere flere innavlede og utav mus linjer ble også undersøkt. GBS belastning A909 vedvarte i vaginal skrift i ca en uke i outbred CD-enmus og innavlet FVB mus (figur 5). Alternativt, ble hoveddelen av innavlede BALB / c og C57BL / 6 kolonisert på en uke (figur 5) og forble kolonisert for en måned eller utover (data ikke vist).

Ved hjelp av denne protokollen, ble GBS vaginal kolonisering in vivo visualisert ved inokulering mus med et plasmid GFP-uttrykke GBS belastning og samle vev for fluorescerende mikroskopi. GFP-GBS ble påvist både holde murine vaginal epitel (figur 6A) og i umiddelbar nærhet til andre innfødte vaginal flora (Figur 6b). Ingen GFP signal ble påvist i mus som hadde ryddet GFP-GBS ved vev samling (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1: Identifisere Stage av Estrus fra Ufarget Murine Vaginal Lavage Fluid. (A) proestrus: rikelig med kjerne squamous epitelceller (svarte piler). (B) Estrus: rikelig forhornede squamous epitelceller (blå piler). (C) Metestrus: blanding av kjerneinneholdende og forhornede squamous epitelceller og i hovedsak leukocytter (grå piler). (D) diestrus: rikelig leukocytter. Forstørrelse = 100X, skala bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Brunst Stage Konsekvenser Vaginal Persistence of GBS. Prosent av CD-1 mus kolonisert med 1 x 10 7 CFU GBS A909 over tid. Mus ble gruppert (n = 7-11 / gruppe) på grunnlag av brunst stadium ved tidspunktet for inokulering GBS, som bestemt ved vaginal utskylling væske. En uavhengig forsøk er vist. Dette tallet har blitt forandret fra tidligere publiserte arbeid og gjengitt med tillatelse 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Fortsatt Behandling med β-østradiol Fremmer GBS Vaginal Persistence. Prosent kolonis (A) eller gjenvinnes CFU (B) av CD-1 mus (n = 10) inokulert med 1 x 10 7 CFU GBS A909 og vedlikeholdes på β-østradiol behandling. Mus ble injisert med β-østradiol en dag før GBS inokulering og på dag 1, 3 og 5 etter inokulering. En uavhengig forsøk er vist. Linjen i (B) representerer betyr gjenvunnet CFU. 708fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: GBS Stammer ulik evne til å vedvare i Vaginal Tract. Outbred CD-1 mus (n = 10 / gruppe) ble injisert med en enkelt dose av β-østradiol en dag før GBS inokulasjon med 1 x 10 7 CFU av de gitte GBS stammer. Forsøk med hver stamme ble gjennomført uavhengig av hverandre, og ble gjentatt minst tre ganger; en representativt resultat er vist. Dette tallet har blitt forandret fra tidligere publiserte arbeid og gjengitt med tillatelse 25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

pload / 54708 / 54708fig5.jpg "/>
Figur 5: musestammer ulik evne til å bli kolonisert med GBS i Vaginal Tract. Mus fra angitte bakgrunns-stammer ble injisert med en enkelt dose av β-østradiol en dag før inokulasjon med 1 x 10 7 CFU av GBS A909. Forsøk med hver stamme ble gjennomført uavhengig av hverandre og ble gjentatt minst to ganger; en representativt resultat er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Fluorescent Imaging av GBS i Mus Vaginal Tract. Visualisering av GFP- uttrykker GBS (grønn) langs vaginal Epitel ved forstørrelse = 630x, skala bar = 50 mikrometer (A), og i umiddelbar nærhet til endogenous vaginal mikrober ved forstørrelse = 1,000X, skala bar = 20 mikrometer (B). Blåved = DAPI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1: Sammenstilling av GBS Stammer og mus linjer brukes til vaginal kolonisering Studies. GBS bakgrunn stammer, mus linjer, og dosering av β-østradiol er indikert. Studier ved hjelp av modellen beskrevet i dette arbeidet er markert i grått.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å fremme utvikling av forståelsen av GBS-interaksjoner med både verts og andre mikrober innenfor rammen av verten, er en dyremodell nødvendig. Dette arbeidet beskriver de tekniske aspektene ved å etablere GBS vaginal kolonisering hos mus. Denne protokollen oppnår> 90% koloniseringen av musene uten bruk av bedøvelse for å inokulere bakterier eller for å samle inn penselprøver, immun-undertrykkende midler for å muliggjøre kolonisering, vaginal forvask eller additiver for å fortykke inokulum. Dessuten viser denne modellen robust reproduserbarhet, med beskjedne inter-eksperimentell variabilitet i både lengden av GBS utholdenhet og den bakterielle belastningen. De representative resultatene vist i denne studien er sammenstillingen av uavhengige eksperimenter og bør være en referanse for fremtidig eksperimentell design; men bør direkte sammenligninger på tvers av GBS stammer og mus linjer gjøres med forsiktighet.

Denne modellen etterligner menneske colonizatipå i det slimhinne vaginal GBS koloniseringen av mus synes å være begrenset til den skjede. Selv oppstigning inn i livmorhalsen og livmoren har blitt observert med flere GBS stammer 25, trenger mus ikke viser tegn til sykelighet eller dødelighet, selv etter måneder med kolonisering. Videre, avhengig av GBS og musestammer studert, mus viser konsekvent eller forbigående vaginal kolonisering, som er nyttig for å studere bakterielle faktorer og vertens immunresponser, respektivt. I denne modellen, noen mus viser periodisk kolonisering; Det er foreløpig ukjent om mus bli recolonized på senere tidspunkt, eller om kolonisering faller under deteksjonsgrensen, vanligvis 50 til 100 CFU, på visse tidspunkter. Av notatet, har overføring mellom mus ikke blitt observert når koloniserte og ikke-kolonis mus er plassert sammen over flere uker (data ikke vist).

Denne metoden benytter en kommersielt tilgjengelig selektivt og differensielt mediumfor GBS å kvantifisere muse bakterielle byrder. GBS vokser som lyse rosa eller lilla kolonier som er lett synlig etter 24 timers inkubasjon. Dette mediet har vist seg å ha høyere sensitivitet for påvisning av GBS i forhold til andre medier, inkludert blod-agar og Granada medium 32, og har vært brukt i kombinasjon med latexkule agglutinasjon tester for å bekrefte GBS kliniske isolater 18. I denne studien, lyse rosa eller lilla kolonier fra ikke-GBS kolonis mus har aldri kommet til rette. Noen endogene flora, typisk Enterococcus arter, vil vokse som blå kolonier, og noen kolonier blir hvit, grå eller blek rosa. Viktigere, plater skal telles etter 18 til 24 timers inkubasjon, som ikke-GBS kolonier kan innlemme den rosa pigment hvis venstre i kuvøsen eller på den stasjonære maskiner for lengre perioder. Vi har observert, som har blitt rapportert tidligere 32, at noen S. pyogenes isolater vil danne kolonier på rosa CHROMagar StrepB, men disse colonies er vanligvis mindre enn GBS kolonier. S. pyogenes har ikke blitt isolert fra de endogene vaginal flora av mus i disse studiene, men denne observasjonen bør vurderes i det videre arbeidet.

Hoveddelen av resultatene ble oppnådd fra outbred CD-1 mus linje, noe som viser robuste medfødte immunresponser i løpet av de første få dager efter inokulering, med påfølgende bakterie klaring i de fleste mus 19. Andre har også testet flere GBS stammer og har observert lengre utholdenhet ganger 33,34. Siden utviklingen av denne modellen, er andre grupper begynt å utvikle lignende musemodeller av GBS vaginal kolonisering for å undersøke virkningen av vertens immunresponser 33,35, preventive terapier 36,37, og overføring til fosteret i livmoren 34,38. Disse forskjellene kan forklares med en rekke faktorer, inkludert genetiske determinanter som påvirker immunresponser og than sammensetningen av innfødte vaginal flora. Vi har satt sammen en liste over de GBS stammer og respektive mus linjer som har blitt studert hittil i GBS vaginal kolonisering studier (tab 1). Antallet nylige studier med dyremodeller fremhever interesse og nødvendigheten av slike modeller innen GBS patogenesen forskning.

Innenfor vaginal-tarmkanalen, er slimhinneimmunitet strengt regulert av steroidhormoner 44, og til og med en dose av β-østradiol, slik det er beskrevet i denne modellen, perturbs vertens immunrespons. Likevel, det er robuste medfødte immunresponser i løpet av de første dagene av GBS kolonisering 19,25, noe som tyder på at berørte immunresponser er stort sett intakt. Modeller som involverer gjentatt p-østradiol injeksjoner kan forlenge GBS vaginal utholdenhet, som vist i denne studien (figur 3) og ved andre 33. Men immunresponser og skjede physiology kan bli mer forvirres, noe som gjør resultatene vanskelig å tolke. Viktigere, forskjellene er beskrevet på tvers av ulike GBS isolerer og musestammer i denne studien kan bli endret i løpet av modeller av vedvarende estrus og bør undersøkes i det videre arbeidet. Av notatet, verken estrus scenen eller GBS serotype påvirket vaginal kolonisering i en rottemodell 22. I tillegg er drastisk forskjellig human sure vaginal pH-verdi på 3.6 til 4.5 45 fra den mer nøytral murine vaginal pH-verdi på 6,5 46, noe som kan påvirke GBS genekspresjon og etterfølgende faktorer som bidrar til kolonisering. Endelig er innfødt vaginal flora tydelig mellom mennesker og murine modell kolleger, og det videre arbeidet bør undersøke GBS kolonisering i gnotobiotiske mus som bærer menneskelige vaginale flora.

I sammendraget har disse studiene søkt å undersøke verts og bakterielle faktorer som styrer GBS vaginal kolonisering. Primært, den robuste, nyskapende dyremodell av GBS vaginal colonization utviklet i dette arbeidet kan benyttes for å beskrive komplekse vert-mikrobe interaksjoner i en in vivo vaginalt miljø. Den oppnådde fra denne modellen har allerede betydelig økt kjennskap til vertsimmun komponenter og spesifikke for GBS-gener som kontrollerer GBS vaginal utholdenhet. Videre har disse resultatene reist flere spørsmål, og vil være nyttig for videre utvikling av nye behandlingsformer for å begrense mors GBS vaginal kolonisering og påfølgende eksponering av den nyfødte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sesame oil  Sigma Aldrich S3547-250ML
β-Estradiol  Sigma Aldrich E8875-1G CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces. 
200 μl gel loading pipette tips  USA Scientific 1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs Puritan 25-801 A 50
CHROMagar StrepB DRG International SB282
Todd Hewitt Broth Hardy Diagnostics 7161C
18 G, 1.5 inch needles BD 305199
26 G, 0.5 inch needles BD 305111
10 ml syringes BD 309604
1 ml syringes BD 309659
0.45 μm PVDF syringe filters Whatman 6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning 21-031-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verani, J. R., McGee, L., Schrag, S. J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC. MMWR. Recomm. Rep. 59 (RR-10), 1-36 (2010).
  2. Maisey, H. C., Doran, K. S., Nizet, V. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence. Expert Rev. Mol. Med. 10, e27 (2008).
  3. Regan, J. A., Klebanoff, M. A., Nugent, R. P. The epidemiology of group B streptococcal colonization in pregnancy. Vaginal Infections and Prematurity Study Group. Obstet. Gynecol. 77 (4), 604-610 (1991).
  4. Stoll, B. J., Schuchat, A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 17 (6), 499-503 (1998).
  5. Brzychczy-Wloch, M., et al. Dynamics of colonization with group B streptococci in relation to normal flora in women during subsequent trimesters of pregnancy. New Microbiol. 37 (3), 307-319 (2014).
  6. Manning, S. D., Lewis, M. A., Springman, A. C., Lehotzky, E., Whittam, T. S., Davies, H. D. Genotypic diversity and serotype distribution of group B streptococcus isolated from women before and after delivery. Clin. Infect. Dis. 46 (12), 1829-1837 (2008).
  7. Le Doare, K., Heath, P. T. An overview of global GBS epidemiology. Vaccine. 31 (Suppl 4), D7-D12 (2013).
  8. Jensen, N. E., Andersen, B. L. The prevalence of group B streptococci in human urogenital secretions. Scand. J. Infect. Dis. 11 (3), 199-202 (1979).
  9. Honig, E., Mouton, J. W., van der Meijden, W. I. Can group B streptococci cause symptomatic vaginitis? Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7 (4), 206-209 (1999).
  10. Muller, A. E., Oostvogel, P. M., Steegers, E. A., Dorr, P. J. Morbidity related to maternal group B streptococcal infections. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 85 (9), 1027-1037 (2006).
  11. Ulett, K. B., et al. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults. J. Clin. Microbiol. 47 (7), 2055-2060 (2009).
  12. Kessous, R., et al. Bacteruria with group-B streptococcus: is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes? J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 25 (10), 1983-1986 (2012).
  13. Jelìnková, J., Grabovskaya, K. B., Rýc, M., Bulgakova, T. N., Totolian, A. A. Adherence of vaginal and pharyngeal strains of group B streptococci to human vaginal and pharyngeal epithelial cells. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 262 (4), 492-499 (1986).
  14. Zarate, G., Nader-Macias, M. E. Influence of probiotic vaginal lactobacilli on in vitro adhesion of urogenital pathogens to vaginal epithelial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (2), 174-180 (2006).
  15. Johri, A. K., et al. Transcriptional and proteomic profiles of group B Streptococcus type V reveal potential adherence proteins associated with high-level invasion. Infect. Immun. 75 (3), 1473-1483 (2007).
  16. Park, S. E., Jiang, S., Wessels, M. R. CsrRS and environmental pH regulate group B streptococcus adherence to human epithelial cells and extracellular matrix. Infect. Immun. 80 (11), 3975-3984 (2012).
  17. Sheen, T. R., Jimenez, A., Wang, N. Y., Banerjee, A., van Sorge, N. M., Doran, K. S. Serine-rich repeat proteins and pili promote Streptococcus agalactiae colonization of the vaginal tract. J. Bacteriol. 193 (24), 6834-6842 (2011).
  18. Wang, N. Y., et al. Group B streptococcal serine-rich repeat proteins promote interaction with fibrinogen and vaginal colonization. J. Infect. Dis. 210 (6), 982-991 (2014).
  19. Patras, K. A., et al. Group B Streptococcus CovR regulation modulates host immune signalling pathways to promote vaginal colonization. Cell. Microbiol. 15 (7), 1154-1167 (2013).
  20. Furtado, D. Experimental group B streptococcal infections in mice: hematogenous virulence and mucosal colonization. Infect. Immun. 13 (5), 1315-1320 (1976).
  21. Cox, F. Prevention of group B streptococcal colonization with topically applied lipoteichoic acid in a maternal-newborn mouse model. Pediatr. Res. 16 (10), 816-819 (1982).
  22. Ancona, R. J., Ferrieri, P. Experimental vaginal colonization and mother-infant transmission of group B streptococci in rats. Infect. Immun. 26 (2), 599-603 (1979).
  23. Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, S., Fischetti, V. A. Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (1), 111-117 (2005).
  24. Faralla, C., et al. Analysis of two-component systems in group B Streptococcus shows that RgfAC and the novel FspSR modulate virulence and bacterial fitness. mBio. 5 (3), e00870-e00814 (2014).
  25. Patras, K. A., Rösler, B., Thoman, M. L., Doran, K. S. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by. Group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 8 (6), 1339-1348 (2015).
  26. Cavaco, C. K., et al. A novel C5a-derived immunobiotic peptide reduces Streptococcus agalactiae colonization through targeted bacterial killing. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (11), 5492-5499 (2013).
  27. Patras, K. A., Wescombe, P. A., Rösler, B., Hale, J. D., Tagg, J. R., Doran, K. S. Streptococcus salivarius K12 limits group B Streptococcus vaginal colonization. Infect. Immun. 83 (9), 3438-3444 (2015).
  28. Shimizu, S. Routes of administration. The Laboratory Mouse. Chapter. 32, Elsevier Press. Amsterdam, Netherlands. 534-535 (2004).
  29. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. 48, A.4I.1-A.4I.8 (2009).
  30. Furr, P. M., Hetherington, C. M., Taylor-Robinson, D. The susceptibility of germ-free, oestradiol-treated, mice to Mycoplasma hominis. J. Med. Microbiol. 30 (3), 233-236 (1989).
  31. Mosci, P., et al. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia. 175 (1-2), 1-11 (2013).
  32. Poisson, D. M., Chandemerle, M., Guinard, J., Evrard, M. L., Naydenova, D., Mesnard, L. Evaluation of CHROMagar StrepB: a new chromogenic agar medium for aerobic detection of Group B Streptococci in perinatal samples. J. Microbiol. Methods. 82 (3), 238-242 (2010).
  33. Carey, A. J., et al. Infection and cellular defense dynamics in a novel 17beta-estradiol murine model of chronic human group B streptococcus genital tract colonization reveal a role for hemolysin in persistence and neutrophil accumulation. J. Immunol. 192 (4), 1718-1731 (2014).
  34. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. J. Infect. Dis. 210 (2), 265-273 (2014).
  35. Gendrin, C., et al. Mast cell degranulation by a hemolytic lipid toxin decreases GBS colonization and infection. Sci Adv. 1 (6), e1400225 (2015).
  36. Santillan, D. A., Rai, K. K., Santillan, M. K., Krishnamachari, Y., Salem, A. K., Hunter, S. K. Efficacy of polymeric encapsulated C5a peptidase-based group B streptococcus vaccines in a murine model. Am. J. Obstet. Gynecol. 205 (3), e1-e8 (2011).
  37. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Nader-Macìas, M. E. Immunomodulation of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus Vaginal Colonization in a Murine Experimental Model. Am. J. Reprod. Immunol. 75 (1), 23-35 (2016).
  38. Whidbey, C., et al. A streptococcal lipid toxin induces membrane permeabilization and pyroptosis leading to fetal injury. EMBO Mol. Med. 7 (4), 488-505 (2015).
  39. Santillan, D. A., Andracki, M. E., Hunter, S. K. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (1), e1-e6 (2008).
  40. Cheng, Q., Fischetti, V. A. Mutagenesis of a bacteriophage lytic enzyme PlyGBS significantly increases its antibacterial activity against group B streptococci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 (6), 1284-1291 (2007).
  41. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. In vitro and in vivo effects of beneficial vaginal lactobacilli on pathogens responsible for urogenital tract infections. J. Med. Microbiol. 63 (Pt 5), 685-696 (2014).
  42. De Gregorio, P. R., Juárez Tomás, M. S., Leccese Terraf, M. C., Nader-Macìas, M. E. Preventive effect of Lactobacillus reuteri CRL1324 on Group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J. Appl. Microbiol. 118 (4), 1034-1047 (2015).
  43. Carey, A. J., et al. Interleukin-17A Contributes to the Control of Streptococcus pyogenes Colonization and Inflammation of the Female Genital Tract. Sci. Rep. 31 (6), 26836 (2016).
  44. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88 (2), 185-194 (2011).
  45. Boskey, E. R., Telsch, K. M., Whaley, K. J., Moench, T. R., Cone, R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. Infect. Immun. 67 (10), 5170-5175 (1999).
  46. Meysick, K. C., Garber, G. E. Interactions between Trichomonas vaginalis and vaginal flora in a mouse model. J. Parasitol. 78 (1), 157-160 (1992).

Tags

Infeksjon gruppe B GBS, Vaginal kolonisering modell murine modell bakteriell-vert interaksjon
En Murine modell av gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine … More

Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (117), e54708, doi:10.3791/54708 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter