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Biology

Analyse von SCAP doi: 10.3791/54709 Published: November 8, 2016

Summary

Wir beschreiben eine modifizierte Methode zur Membranfraktion isoliert von menschlichen Zellen und die Probenvorbereitung für den Nachweis von SCAP N -glycosylation und Gesamtprotein durch Western - Blot verwendet wird . Wir stellen ferner eine GFP-Markierungsverfahren SCAP Handel mittels konfokaler Mikroskopie zu überwachen. Dieses Protokoll kann in regelmäßigen biologischen Laboratorien verwendet werden.

Introduction

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Deregulation des Fettstoffwechsels ist ein gemeinsames Merkmal von Krebs und Stoffwechselerkrankungen 1-6. Bei diesen Verfahren Sterol regulatorische Element-bindende Proteine (SREBPs), eine Familie von Transkriptionsfaktoren, eine wichtige Rolle spielen , um die Expression von Genen , wichtig für die Aufnahme und die Synthese von Cholesterin, Fettsäuren bei der Kontrolle und Phospholipide 7-10.

SREBPs, einschließlich SREBP-1a, SREBP-1c und SREBP-2, werden als inaktive Vorstufen synthetisiert, 7 durch zwei Transmembrandomänen an das endoplasmatische Retikulum (ER) -Membran binden. Der N-Terminus von SREBPs enthält eine DNA-Bindungsdomäne für die Transaktivierung von Zielgenen 11. Der C-Terminus von SREBP Vorläufer bindet an SREBP Spaltungs-aktivierendes Protein (SCAP) 12,13, einem polytopen Membranprotein , das eine zentrale Rolle in der Regulation der SREBP Stabilität und Aktivierung spielt 14-16.

Die Umsettation der Transkriptionsfunktion erfordert die Translokation des SCAP / SREBP - Komplexes aus dem ER zum Golgi, wo zwei Proteasen sequentiell SREBP spalten und dessen N-terminales Fragment freizusetzen, die dann in den Kern 7 für die Transaktivierung von Genen lipogenic eintritt. Bei diesen Verfahren steuern die Pegel von Sterolen in der ER - Membran den Ausgang des SCAP / SREBP - Komplexes aus dem ER 7,17. Unter hohem Sterin Bedingungen bindet Sterin SCAP oder ER-resident Insulin-induzierte Gen-Protein-1 (Insig-1) oder -2 (Insig-2), die Verbesserung der Vereinigung von SCAP mit Insigs, die die SCAP / SREBP-Komplex in der Retain ER 18-20. Wenn Sterin-Spiegel senken, distanziert SCAP mit Insigs. Dies führt zu einer SCAP Konformationsänderung, die SCAP Wechselwirkung mit gemeinsamen Hüllproteine ​​(COP) II-Komplexes ermöglicht. Der Komplex vermittelt die Einbindung des SCAP / SREBP Komplexes in die angehenden Bläschen und lenkt seinen Transport aus dem ER zum Golgi 21,22. Nach TransLocation zum Golgi, SREBPs sequentiell von Standort 1 und Standort-2 - Proteasen gespalten, was zur Freisetzung des N-Terminus 7,23-29.

SCAP Protein trägt drei N -verknüpftem Oligosaccharide an Asparagin (N) positioniert N263, N590 und N641 15. Wir vor kurzem ergeben , dass Glukose-vermittelten N -glycosylation von SCAP in diesen Seiten eine Vorbedingung ist für SCAP / SREBP Handel vom ER zum Golgi unter niedrigen Sterin Bedingungen 30-32. Der Verlust der SCAP Glykosylierung über Mutation aller drei Asparagin Glutamin (NNN zu QQQ) deaktiviert den Handel des SCAP / SREBP komplex und führt zur Instabilität der SCAP - Protein und die Verringerung der SREBP Aktivierung 31. Unsere jüngsten Daten zeigen auch , dass SREBP-1 ist stark in Glioblastoma aktiviert und reguliert durch SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Targeting SCAP / SREBP-1-Signalisierung zeichnet sich als eine neue Strategie malignen Erkrankungen und Stoffwechsel s zu behandelnyndromes 1,3,35-38. Daher ist es wichtig , eine effektive Methode zu entwickeln SCAP - Protein und N -glycosylation Ebenen und überwachen ihre Handels mit menschlichen Zellen und Geweben Patienten zu analysieren.

Die luminalen Bereich von SCAP - Protein (Aminosäuren 540-707) in der ER enthält zwei N -glycosylation Stellen (N590 und N641) , die von Proteolyse geschützt sind , wenn intakten Membranen mit 15 Trypsin behandelt werden. Dieses luminalen Fragment ein Molekulargewicht von ~ 30 kDa , das klein genug ist , um die Auflösung der einzelnen glykosylierten Varianten SCAP durch Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 15,31 zu ermöglichen. Hier stellen wir ein Verfahren N -glycosylation von SCAP und das Gesamtprotein in menschlichen Zellen zu detektieren. Dieses Protokoll wird von der Methode in den Publikationen von der Brown und Goldstein Labor beschrieben abgeleitet 15 und unsere jüngste Veröffentlichung 31. Das Protokoll kann in t verwendet werdener studieren von SCAP-Protein aus Säugerzellen.

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Protocol

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1. Nachweis von Endogene SCAP Protein in menschlichen Zellen

  1. Zellkultur und Behandlung
    1. Seed ~ 1 × 10 6 U87 - Zellen in einer 10 cm - Schale mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , supplementiert mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 h vor der Behandlung.
    2. Wasche die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), dann schaltet Zellen frisches DMEM-Medium mit oder ohne Glucose (5 mM) für 12 Stunden.
  2. Herstellung von Zellmembranfraktionen und Kernextrakten
    1. Wasche die Zellen einmal mit PBS, schaben in 1 ml PBS und Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C.
    2. Die Zellen in einem eiskalten Puffer , enthaltend 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM Natrium - Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Natrium Ethylenglycol tetraessigsäure (EGTA), 250 mM Saccharose, und eine Mischung von Proteaseinhibitoren (5 μg / ml Pepstatin A, 10 & mgr; g / ml Leupeptin 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 25 ug / ml N-Acetyl-Leu-Leu-Norleu-al (ALLN)) für 30 min auf Eis.
    3. Passieren Zellextrakten durch eine 22 G x 1 1/2 Nadel 30mal und Zentrifuge bei 890 × g bei 4 ° C für 5 min, zu isolieren Kernen.
    4. Verwenden Sie den Überstand zur Abtrennung von Membranfraktionen (Schritt 1.2.7). Resuspendieren Kernpellet in 0,1 ml Puffer C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (v / v) Glycerol, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM Natrium - EDTA, 1 mM Natrium - EGTA und eine Mischung aus Protease-Inhibitoren (5 ug / ml Pepstatin A, 10 & mgr; g / ml Leupeptin, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, und 25 & mgr; g / ml ALLN)).
    5. Drehen, um die Suspension bei 4 ° C für 60 min und zentrifugieren bei 20.000 xg in einer Mikrozentrifuge für 20 min bei 4 ° C. Der Überstand wird als "Kernextrakte" bezeichnet.
    6. Erhitzen Sie die Kernextrakten bei 100 ° C für 10 min mit 5-fach-Ladepuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 12,5% β-Mercaptoethanol und 0,05% Bromphenolblau) vor einer SDS-PAGE unterzogen wird.
    7. Zentrifugieren Sie den Überstand von der ursprünglichen 890 × g Spin bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Für die anschließende Western Blot-Analyse, um das Pellet in 0,1 ml SDS-Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (v / v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM Natrium-EDTA, lösen und 1 mM Natrium EGTA). Dies wird als "Membranfraktion" bezeichnet.
      HINWEIS: Wir verwenden 20.000 × g für 20 min Membranen zu pelletieren. 100.000 × g für 10 - 20 min wurde in den Zeitungen von der Brown und Goldstein Labor 15 verwendet.
    8. Inkubieren der Membranfraktion bei 37 ° C für 30 min und bestimmen, um die Proteinkonzentration durch Bradford-Protein-Assay. 1 & mgr; l 100x Bromphenolblau-Lösung, bevor die Proben SDS-PAGE unterzogen wird.
    9. Last 25-50 ug Gesamt - Membranproteine auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 39. Führen Sie das Gelbei 80 V für 15 min, dann auf 130 V zu ändern und für eine weitere 115 min laufen. Übertragen bei 140 mA für 130 min 39.
      1. Für die Western-Blot-Analyse, verwenden anti-SCAP Antikörper die gesamte SCAP Protein nachzuweisen. Verwenden Protein (PDI), ein ER- lokalisiertes Protein 40, als eine interne Kontrolle. Verwenden anti-SREBP-1-Antikörper die N-terminale Bande von SREBP-1 zu erkennen. Verwenden Sie Lamin A als interne Kontrolle für Kernextrakten 31.

2. Analyse der SCAP N -glycosylation in menschlichen Zellen

  1. Zellkultur, Transfektion und Behandlung
    1. Für Membrananalyse, seed ~ 1 × 10 6 HEK293T - Zellen in einer 10 cm - Schale mit DMEM ergänzt mit 5% FBS und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden vor der Transfektion.
    2. Verdünnen Sie 4 - 8 ug GFP-SCAP - Plasmid (ein Geschenk von Dr. Peter Espenshade) 22 in 1 ml Serum Medium reduziert und vorsichtig mischen.
    3. In 8-16 & mgr; l DNA-Transfektionsreagenz durch direktes Pipettieren in die 1 ml reduziert Serum Medium Plasmide enthalten, und vorsichtig mischen.
    4. Inkubieren des Transfektionsreagenz / Plasmid-Komplex für 25 min bei Raumtemperatur.
    5. Hinzufügen Transfektionskomplex zu den Zellen mit frischem Medium und weiterhin Kultur für 24 Stunden bei 5% CO 2 und 37 ° C.
    6. Wasche einmal mit PBS und zu behandeln , die Zellen für 12 h mit oder ohne Glucose (5 mM) in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin (1 ug / ml), eine n -glycosylation Inhibitor.
  2. Bereiten Sie Zellmembran Pellets wie in den Schritten 1.2.1 beschrieben, 1.2.2, 1.2.3 und 1.2.7.
  3. Der Nachweis von SCAP N -glycosylation
    1. Trypsin Proteolyse
      1. Resuspendieren der Membranpellets aus Zellen GFP-SCAP in 114 ul Puffer , enthaltend 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4) überexprimieren, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM Natrium - EDTA und 100 mM NaCl.
      2. Inkubiere 5781; l Aliquots von Membranproteinen in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 & mgr; l Trypsin (1 ug / ul) in einem Gesamtvolumen von 58 & mgr; l für 30 min bei 30 ° C.
      3. Stop Reaktionen durch Zugabe von 2 ul (400 Einheiten) von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor.
    2. Deglycosylation von Peptid- N- Glycosidase F (PNGase F)
      1. Für eine nachfolgende Behandlung mit PNGase F, mit 10 ul Lösung mit 3,5% (wt / vol) SDS und 7% (Vol / Vol) 2-Mercaptoethanol zu jeder Probe enthält.
      2. Nach dem Erhitzen bei 100 ° C für 10 min, fügen sequentiell 7 ul 0,5 M Natriumphosphat (pH 7,5), 7 ul 10% (v / v) Nonidet P-40 mit 12 × Protease-Inhibitoren, und 2 & mgr; l (0,5 U / & mgr; l) von PNGase F.
      3. Nach Inkubation bei 37 ° C für 3 h, Stopp Reaktionen durch die Zugabe von 5x Ladepuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 12,5% β-Mercaptoethanol und 0,05% Bromphenolblau). Erhitzen Sie die Mischungen bei 100 ° C für 10 min und nach SDS-PAGE. Last 25-50 ug Gesamt - Membranproteine auf einem 10% SDS-PAGE - Gel 39. Führen Sie das Gel bei 80 V für 15 min, dann auf 130 V für einen weiteren 115 min ändern. Übertragen bei 140 mA für 130 min.
      4. Für die Western - Blot, verwenden 10 ug / ml anti-SCAP (9D5) Antikörper -glycosylation N und Gesamt SCAP Protein nachzuweisen.

3. Nachweis von SCAP Handel von ER zum Golgi durch Verwendung von GFP-SCAP in menschlichen Zellen

  1. Seed 2,5 × 10 5 U87 - Zellen in einer 60 mm Schale mit DMEM ergänzt mit 5% FBS und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 h vor der Transfektion.
  2. Verdünnen Sie 4 ug GFP-SCAP-Plasmid in 0,5 ml reduziert Serum Medium und mischen.
  3. In 8 ul DNA-Transfektionsreagenz durch Pipettieren direkt in 0,5 ml reduziert Serum Medium Plasmide enthalten, und vorsichtig mischen.
  4. Inkubieren des Transfektionsreagenz / Plasmid-Komplex für 25 min bei RaumTemperatur.
  5. Hinzufügen Transfektionskomplex zu den Zellen mit frischem Medium und weiterhin Kultur für 24 Stunden bei 5% CO 2 und 37 ° C.
  6. Reseed 5 - 10 × 10 4 Zellen in einer 6-Well - Platte , die eine Glasdeckglas (22 mm × 22 mm) und weiter zur Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden enthält.
  7. Wasche einmal mit PBS und zu behandeln, die Zellen für 12 h mit oder ohne Glucose (5 mM) in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin (1 ug / ml).
  8. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fixieren in 4% Formaldehyd für 10 min.
  9. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, kehren Sie die Deckgläser, montieren Sie auf Objektträger zusammen mit Antifade Reagenz und versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack.
  10. Überprüfen Sie die GFP-SCAP Handel mit einem 63X -Ölimmersionsobjektiv in einem Laser - Scanning - konfokalen Mikroskop 41.

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Representative Results

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Figur 1 zeigt den Nachweis von endogenem SCAP Protein und SREBP-1 Kernform in humanen Glioblastom U87 - Zellen als Reaktion auf Glucose - Stimulation durch Western - Blot verwendet wird . Das Membranprotein SCAP ist in der "Membranfraktion" detektiert. Der Kern Form (N-terminal) von SREBP-1 ist in den "Kernextrakten" erkannt. Die Höhe der SCAP Protein (PDI dient als eine interne Kontrolle der ER-Membran-Proteine) und SREBP-1 Kernform werden durch Glukose Stimulation deutlich verbessert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Protokoll der Lage ist, die endogene SCAP Protein in menschlichen Zellen zu detektieren.


Figur 2 zeigt die Analyse der SCAP N -glycosylation und insgesamt GFP-SCAP Proteinspiegel in Reaktion Stimulation und Tunicamycin - Behandlung in HEK293T - Zellen in Glucose GFP-markiertem hamster SCAP exprimieren. Figure N -glycosylation Standorten. Das Fragment enthält SCAP aa 540-707, in dem in der ER 6 th luminalen Schleife angeordnet ist Trypsin-resistente 15 und ist für die Analyse von N -glycosylation auf den Seiten N590 und N641 verwendet. Wie in 2B (obere Tafel) gezeigt wird , nach der Behandlung Trypsin, das höhere Gewicht Bänder (enthaltend aa 540-707) zeigen SCAP Protein mit einem oder zwei N -verknüpfte Oligosaccharide (N590 und N641) in Gegenwart von Glucose und Abwesenheit von PNGase oder Tunicamycin (nachgewiesen durch IgG-Antikörper 9D5). In Gegenwart von PNGase F, N-verknüpfte Oligosaccharide wurden aus dem SCAP Protein entfernt, wodurch das Fragment (aa 540-707) schneller in SDS-PAGE zu bewegen. Konsequent, schaffte die N -glycosylation Initiationsprozess blockiert durch Tunicamycin vollständig SCAP N -glycosylation, durch das Auftreten einer niedrigeren angezeigtBande von SCAP - Fragment (2B, oberes Feld). Außerdem wurde die gesamte GFP-SCAP Protein (nachgewiesen durch einen Antikörper gegen GFP) in Abwesenheit von Glucose reduzierte oder über Tunicamycin - Behandlung (2B, unteres Feld). Diese Ergebnisse zeigen , dass das Protokoll für die Analyse von SCAP N -glycosylation geeignet ist.


3 zeigt , dass GFP-SCAP Handel vom ER zum Golgi in Reaktion Stimulation auf Glucose wurde durch Tunicamycin - Behandlung in U87 - Zellen unterdrückt. Wie in 3A gezeigt, Konfokalmikroskopie Bilder zeigen , dass GFP-SCAP Protein in Abwesenheit von Glukose im ER residiert, wie durch seine Kolokalisation mit PDI, eine ER-resident - Protein (rot) dargestellt. Im Gegensatz dazu bewegt sich in der Gegenwart von Glucose, GFP-SCAP zum Golgi, durch die Co-Lokalisierung mit dem Golgi Proteinmarker Giantin (rot) (3B) gezeigt ist . Außerdem TunicamycinBehandlung durch Glucose induzierte Handel von GFP-SCAP vom ER zum Golgi (3A und B) unterdrückt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Nachweis endogener SCAP Protein und SREBP-1 Nuclear Formular in U87 - Zellen. Western - Blot - Analyse von Membran- und Kernextrakten aus menschlichen primären Glioblastomen U87 - Zellen, die in serumfreiem Medium mit oder ohne Glucose (5 mM) für 12 Stunden. Anti-SCAP Antikörper gegen humanes SCAP aa 450-500 verwendet wurde, die endogene SCAP in menschlichen Zellen zu detektieren. 407-Fragment von humanem SREBP-1 - die aktive Form (N-terminal) von SREBP-1 in der "Kernextrakten" Antikörper gegen den aa 301 unter Verwendung festgestellt. Diese Zahl wurde von 31 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier um einen größeren versi anzuzeigenauf dieser Figur.

Figur 2
Abbildung 2. Western - Blot - Analyse von SCAP N -glycosylation und GFP-SCAP Proteinmengen. A) Schematische Darstellung der SCAP Struktur Spanning überqueren die ER - Membran zeigt. Es gibt drei Asparagin (N) -Resten in SCAP, die alle in das ER-Lumen befinden und durch N-verknüpfte Oligosaccharide modifiziert. Das Fragment von SCAP Aminosäuren 540-707 ist resistent gegen Trypsin Verdauung. Es enthält zwei N-gebundene Oligosaccharid - Modifikation Ställen, N590 und N641, die durch IgG-9D5 Antikörper gegen den aa 540 nachgewiesen werden kann - durch Western - Blot 707 von Hamster SCAP B) Western - Blot - Analyse von SCAP N -glycosylation (oben:. Mit Trypsin-Behandlung) oder GFP-SCAP-Proteinspiegel (niedriger: keine Behandlung Trypsin) aus HEK293T-Zellen transiently mit GFP-transfizierten SCAP für 24 h und dann in serumfreiem Medium mit oder ohne Glucose (5 mM) in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin (1 ug / ml), ein N -glycosylation Inhibitor für 12 hr. Die Zahlen auf der linken Seite des Blots zeigen die Anzahl von N -glycosylation Stellen auf SCAP Protein (N590 und N641 sites) (obere, detektiert durch IgG-9D5 - Antikörpers). Das untere Feld für GFP-SCAP wurde durch einen Antikörper gegen GFP-Protein nachgewiesen. Diese Zahl hat sich von 31 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Der Nachweis von SCAP Handel vom ER zum Golgi. A, B) konfokale Mikroskopie - Aufnahmen zeigen , dass die GFP-SCAP befindet sich in der Notaufnahme oder bewegt sich auf ter Golgi in Abwesenheit oder in Gegenwart von Glucose (5 mM) mit / ohne Tunicamycin (1 ug / ml) Behandlung in U87-Zellen für 12 Std. PDI zeigt ER - Färbung (rot) (A). Giantin, der Golgi - Marker (rot) (B). DAPI (blau) Flecken in den Zellkern. Die Skalenbalken stellen 10 & mgr; m. 3A ist neue Daten und bisher nicht publiziert worden. 3B mit freundlicher Genehmigung geändert wurde von 31. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von Membranfraktionen in menschlichen Zellen und für die Herstellung der Proben für den Nachweis von SCAP N -glycosylation und Gesamtprotein durch Western - Blot verwendet wird . Wir bieten weiterhin ein Verfahren SCAP Handel zu überwachen, indem GFP-Markierung und der konfokalen Mikroskopie. Das Verfahren ist speziell verwendete Membranprotein zu analysieren und ist ein wichtiges Instrument SCAP N -glycosylation und Menschenhandel zu untersuchen.

Verglichen mit dem Verfahren verschiedene Lectine unter Verwendung verschiedener N - Glycan - Ketten zu erkennen und zu identifizieren , N -glycosylated Proteine 42, beschrieben unserer Methode , die hier verwendet PNGase F - Protein-verknüpften N - Glycan und detektiert die Migrationsverschiebung zu entfernen , die Glykosylierung von SCAP Proteinfragment zu identifizieren , aa 540-707. Die Begrenzung des Lektins Verfahren ist abhängig von der Identifizierung des entsprechenden Typs von Lektin die spezifische zu erkennen N -glycosylation zu analysieren. Weiterhin kann das Verfahren auch 2 in menschlichen Patienten oder tierischen Geweben nach der Homogenisierung zu analysieren SCAP N -glycosylation und Proteinebene angewendet werden. Unsere Studie hat ein neues Werkzeug, um die Unterschrift des Lipidstoffwechsels bei Krebs und Stoffwechselerkrankungen zu analysieren.

In dieser Studie wurde das Plasmid von GFP-markierten SCAP zur Analyse von N -glycosylation und den Handel mit menschlichen Zellen verwendet wird , Hamster-Herkunft. SCAP - Antikörper (IgG-9D5) , die gegen die Aminosäuren 540-707 angehoben Fragment SCAP Protein nur das Protein und N -glycosylation des Hamsters SCAP, wie in der chinesischen Hamster Eierstock- (CHO) Zellinie , 15 erfassen kann. Der Antikörper gegen die Aminosäuren 450-500 von humanem SCAP der Lage ist , die endogene SCAP Protein in menschlichen Zellen zu detektieren, wie in Figur 1 gezeigt SCAP N -glyco zu detektieren.sylation in menschlichen Zellen oder Geweben, müssen wir einen spezifischen Antikörper gegen die Aminosäuren 540 zu entwickeln - 707 Fragment des menschlichen SCAP. Zusätzlich Identifizierung eines spezifischen Lektin zu erkennen SCAP gebundenen N - Glycan ist eine alternative Möglichkeit menschlichen SCAP N -glycosylation 42 zu analysieren. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung und Struktur jedes N - Glycan Kette definiert , in SCAP - Bindung (N263, N590 und N641) wird unser Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismus der SCAP Handel vom ER zum Golgi erleichtern.

Darüber hinaus die besten Ergebnisse für den Nachweis von SCAP N -glycosylation zu erhalten, passten wir einige Reaktionsparameter entsprechend unseren experimentellen Bedingungen, die von den Methoden in den Publikationen von der Brown und Goldstein Laboratory 15 beschrieben modifiziert sind. Um erfolgreich SCAP Protein und seine N -glycosylation detektieren, die Qualität der Membranfraktionen und Kernextrakte sind sehr wichtig ,. Wir stellten fest, direkt auf die Proteinkonzentration nach der Membranfraktionen bei 37 ° C inkubiert, die Vermeidung der Probe Setzen auf Eis zurück. Das Verfahren kann dabei weitgehend auf verschiedenen Gebieten der angewandten Forschung beschrieben werden, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und Fettleibigkeit.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent Roche 6366236001
Opti-MEMI medium Life Technologies 31985-070
trypsin  Sigma T6567
soybean trypsin inhibitor Sigma T9777
PNGase F  Sigma P7367
Anti-SCAP (9D5) antibody   Santa Cruz sc-13553
GFP antibody  Roche 11814460001
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) BD Pharmingen 557036
PDI Antibody (H-17) Santa Cruz sc-30932
Lamin A Antibody (H-102) Santa Cruz sc-20680
SCAP antibody (a.a 450-500) Bethyl Laboratories, Inc. A303-554A
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine   Cellgro 17-207-CV Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use
22 G x 1 1/2 needle BD 305156
pepstatin A Sigma P5318
leupeptin Sigma L2884
PMSF Sigma P7626
DTT Sigma 43819
ALLN Sigma A6185
Nitrocellulose membrane GE RPN3032D
EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml VWR 82023-102
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml Fisher Scentific 50255956
HyClone FBS Thermo scientific SH3007103
glycerol Sigma G5516
β-mercaptoethanol  Sigma M3148
bromophenol blue Sigma B8026
prolong gold antifade reagent with dapi Life Technologies P36935
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081
sodium pyruvate Life Technologies 11360-070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Analyse von SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Und Handel in menschlichen Zellen
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Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).More

Cheng, C., Guo, J. Y., Geng, F., Wu, X., Cheng, X., Li, Q., Guo, D. Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells. J. Vis. Exp. (117), e54709, doi:10.3791/54709 (2016).

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