Summary
我々は、ヒト細胞およびウェスタンブロットを用いてSCAP N -glycosylationおよび総タンパク質の検出のためのサンプル調製物からの膜画分を単離するための改良法を記載します。我々はさらに、共焦点顕微鏡を用いてSCAPの人身売買を監視するために、GFP-標識法をご紹介します。このプロトコルは、通常の生物学実験室で使用することができます。
Introduction
脂質代謝の規制緩和は、癌および代謝性疾患1-6の一般的な特徴です。これらの方法では、ステロール調節エレメント結合タンパク質（SREBPs）、転写因子のファミリーは、コレステロールの取り込みおよび合成のための重要な遺伝子の発現の制御に重要な役割を果たし、脂肪酸、及びリン脂質7-10。
SREBP-1aを、SREBP-1C、およびSREBP-2を含むSREBPsは、2つの膜貫通ドメイン7によって小胞体（ER）膜に結合し不活性前駆体として合成されます。 SREBPsのN末端は、標的遺伝子11のトランスのためのDNA結合ドメインが含まれています。 SREBP前駆体のC末端は、SREBP切断活性化タンパク質（SCAP）12,13、SREBPの安定性及び活性化14-16の調節において重要な役割を果たしているポリトピック膜タンパク質に結合します。
implemen転写機能のテーションは、2つのプロテアーゼが順次SREBPを切断した後、脂質生成遺伝子7のトランスのための核に入り、そのN末端断片を、解放ゴルジへの小胞体からSCAP / SREBP複合体の転座を必要とします。これらのプロセスでは、ER膜中のステロールのレベルは、ER 7,17からSCAP / SREBP複合体の出口を制御します。高ステロール条件下では、ステロールはでSCAP / SREBP複合体を保持InsigsとSCAPの関連性を高め、SCAPまたはERに存在するインスリン誘導遺伝子タンパク質-1（Insig-1）または-2（Insig-2）に特異的に結合しますER 18-20。ステロールのレベルが減少すると、SCAPはInsigsで解離します。これは一般的なコートタンパク質（COP）II複合体とSCAPの相互作用を可能にするSCAPコンホメーション変化をもたらします。複合体は、出芽小胞にSCAP / SREBP複合体の取り込みを仲介し、ゴルジ体21,22にERからの輸送を指示します。 transloc時にゴルジ体へエーション、SREBPsを順次N末端7,23-29の放出をもたらす、サイト1とサイト-2プロテアーゼによって切断されています。
SCAPタンパク質は、Nはアスパラギンでオリゴ糖を-結合3運ぶ（N）は、N263、N590、N641および15を位置決めします 。我々は最近、これらのサイトにおけるSCAPのグルコース媒介Nの -glycosylationが低いステロール条件30-32の下でERからゴルジへのSCAP / SREBP輸送のための必須条件であることを明らかにしました。 （QQQへNNN）グルタミンにすべての3つのアスパラギンの変異を介したSCAPグリコシル化の損失は、SCAPタンパク質とSREBPの活性化31の減少が不安定でSCAP / SREBP複合体と結果の人身売買を無効にします。私たちの最近のデータはまた、SREBP-1は非常に神経膠芽腫で活性化し、SCAPのN -glycosylation 4,31,33,34によって規制されることを示します。 SCAP / SREBP-1シグナル伝達が悪性腫瘍を治療するための新たな戦略および代謝秒として浮上しているターゲティングyndromes 1,3,35-38。したがって、SCAPタンパク質およびN -glycosylationレベルを分析し、ヒト細胞と患者組織における輸送を監視する有効な方法を開発することが重要です。
ERにおけるSCAPタンパク質（アミノ酸540から707）の管腔領域は、無傷の膜をトリプシン15で処理した場合にタンパク質分解から保護された2つのN -glycosylationサイト（N590およびN641）が含まれています。この管腔フラグメントは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）15,31によってSCAPの個々のグリコシル化バリアントの解決を可能にするのに十分に小さい〜30kDaの分子量を有します。ここでは、N個の SCAPの-glycosylationおよびヒト細胞中の全タンパク質を検出するための方法を提供します。このプロトコルはブラウンとゴールドスタイン実験室15と我々の最近の刊行物31からの刊行物に記載された方法に由来します。プロトコルは、Tで使用することができ彼は、哺乳動物細胞からSCAPタンパク質の研究します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ヒト細胞における内因性SCAPタンパク質の1検出
- 細胞培養および治療
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて10cmディッシュでシード〜1×10 6個のU87細胞を、5％ウシ胎児血清（FBS）を補充し、処理前に24時間37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を1回洗浄し、その後12時間（5ミリモル）を伴うまたはグルコースを含まない新鮮なDMEM培地に細胞を切り替えます。
- 細胞膜画分と核抽出物の調製
- PBSで細胞を1回洗浄し、1mlのPBSにこすり、そして4℃で5分間1,000×gで遠心。
- 10mMのHEPES-KOH（pHは7.6）、10 mMの塩化カリウム、1.5ミリモルのMgCl 2、1mMのナトリウムエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1mMのナトリウム、エチレングリコール四酢酸（EGTA）、250mMのを含有する氷冷緩衝液中で細胞を再懸濁しスクロース、およびプロテアーゼ阻害剤の混合物（5μグラム/ mlのペプスタチンA、10 / mlのロイペプチン、0.5mMのフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）、1mMジチオスレイトール（DTT）、および25μg/ mlのN-アセチルロイシン - ロイシン - Norleuアル30分間（ALLN））冷やして。
- 核を単離するための5分間、4℃で890×gでのx 1 1/2ニードル30回と遠心22 Gを介して細胞抽出物を渡します。
- 膜画分（ステップ1.2.7）の分離のために上清を使用してください。緩衝液C（20mMのHEPES / KOH液pH 7.6、0.42 M塩化ナトリウム、2.5％（v / v）のグリセロール、1.5のMgCl 2、1mMのナトリウムEDTA、1mMのナトリウムEGTAとの混合物を0.1ml核ペレットを再懸濁プロテアーゼ阻害剤（5μg/ mlのペプスタチンA、10 / mlのロイペプチン、0.5mMのPMSF、1mMのDTT、および25μg/ mlのALLN））。
- 4℃で20分間マイクロ遠心20,000×gで60分間遠心4℃でサスペンションを回転させます。上清を、「核抽出物」として指定されます。
- 31（5×ローディング緩衝液で10分間、100℃の核抽出物を加熱2.5 mMのトリス-HCl pH6.8の、10％SDS、50％グリセロール、12.5％のβメルカプトエタノール、および0.05％ブロモフェノールブルー）をSDS-PAGEに供する前に。
- 4℃で20分間20,000×gで、元の890×gでスピンからの上清を遠心します。その後のウェスタンブロット分析のために、10mMのトリス塩酸pH6.8の、100mMのNaCl、1％（v / v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1mMのナトリウムEDTA、及び1（SDS溶解緩衝液0.1 ml中にペレットを溶解しますmMのナトリウムEGTA）。これは「膜画分」と指定されています。
注：我々は、ペレット膜に20分間20,000×gでを使用しています。 10 100,000×gで- 20分はブラウンとゴールドスタイン実験室15からの論文で使用されてきました。 - 30分間37℃で膜画分をインキュベートし、Bradfordタンパク質アッセイによってタンパク質濃度を決定します。 SDS-PAGEにサンプルを供する前に1μlの100倍のブロモフェノールブルー溶液を追加します。
- 10％SDS-PAGEゲル39の総膜タンパク質50μgの-負荷25。ゲルを実行します。80 Vで15分間、その後130 Vに変更し、別の115分間実行します。 130分39、140 mAで転送します。
- ウエスタンブロット分析のために、総SCAPタンパク質を検出するために、抗SCAP抗体を使用しています。内部対照として、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）、ER-常駐タンパク質40を使用してください。 SREBP-1のN末端のバンドを検出するために、抗SREBP-1抗体を使用してください。ラミンAは、核抽出物31の内部対照として使用します。
ヒト細胞におけるSCAP N -glycosylation 2.分析
- 細胞培養、トランスフェクション、および治療
- 膜解析のために、DMEMで10cmディッシュ中にシード〜1×10 6 HEK293T細胞を、5％FBSを補充し、トランスフェクション前に24時間37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。
- 血清培地を低減し1ミリリットルで8μgのGFP-SCAPプラスミド（ピーター・Espenshadeからの贈り物）22、穏やかに混合- 4を希釈します。
- プラスミドを含む血清培地を低減し、穏やかに混合する1ミリリットル中に直接ピペッティングして16μlのDNAトランスフェクション試薬 - 8を追加します。
- 室温で25分間トランスフェクション試薬/プラスミド複合体をインキュベートします。
- 新鮮な培地での細胞へのトランスフェクション複合体を追加し、5％CO 2、37℃で24時間培養を続けます。
- PBSで1回洗浄し、またはツニカマイシン（1 / mlの）、N個の -glycosylation阻害剤の存在下または非存在下でのグルコース（5 mM）のなしで12時間細胞を処理します。
- ステップ1.2.1、1.2.2、1.2.3、および1.2.7で説明したように、細胞膜ペレットを準備します。
- SCAP N -glycosylationの検出
- トリプシンタンパク質分解
- 10mMのHEPES・KOH（pH7.4）中、10mMの塩化カリウム、1.5ミリモルのMgCl 2、1mMのナトリウムEDTA、及び100mMのNaClを含む緩衝液114μlのGFP-SCAPを過剰発現する細胞からの膜ペレットを再懸濁します。
- 57をインキュベート81; 30℃で30分間、58μLの総容量中のトリプシンを1μl（1μgの/μL）の非存在下または存在下での膜タンパク質のLアリコート。
- 大豆トリプシンインヒビターの2μlの（400単位）の添加により反応を停止します。
- ペプチド- N-グリコシダーゼF（PNGアーゼF）によって脱グリコシル化
- PNGアーゼFとのその後の処理のために、3.5％（重量/容量）SDS、7％（容量/容量）を含む溶液10μlを各試料に2-メルカプトエタノールを追加します。
- 10分間100℃で加熱した後、順次、12×プロテアーゼ阻害剤（v / v）のノニデットP-40を10％の7μlの、0.5 Mリン酸ナトリウム（pH7.5）を7μlを添加し、2μlの（0.5 U PNGアーゼFの/μL）
- 3時間37℃でインキュベートした後、5×ローディング緩衝液（312.5 mMトリス塩酸pH6.8の、10％SDS、50％グリセロール、12.5％のβメルカプトエタノール、および0.05％ブロモフェノールブルー）を添加することによって反応を停止させます。 10メートル、100℃で混合物を加熱およびSDS-PAGEを受けます。 10％SDS-PAGEゲル39の総膜タンパク質の負荷25〜50μgの。別の115分間130 Vに変更した後、15分間80 Vでゲルを実行します。 130分間、140ミリアンペアで転送します。
- ウェスタンブロットのために、N個の -glycosylationと総SCAPタンパク質を検出するために10μg/ mlの抗SCAP（9D5）抗体を使用しています。
- トリプシンタンパク質分解
ヒト細胞におけるGFP-SCAPを用いた検出ERからゴルジへのSCAPの人身売買の3
- DMEMで60ミリメートルシャーレ内での種子2.5×10 5 U87細胞は、5％FBSを補充し、トランスフェクション前に24時間、37℃で細胞を、5％CO 2をインキュベートします。
- 0.5ミリリットルの4μgのGFP-SCAPプラスミド減少血清培地を希釈し、混合します。
- プラスミドを含む血清培地を低減し、穏やかに混合する0.5ミリリットルに直接ピペットで8μlのDNAトランスフェクション試薬を追加します。
- 室温で25分間トランスフェクション試薬/プラスミド複合体をインキュベート温度。
- 新鮮な培地での細胞へのトランスフェクション複合体を追加し、5％CO 2、37℃で24時間培養を続けます。
- ガラスカバースリップ（22ミリメートル×22ミリメートル）を含む6ウェルプレートに10×10 4細胞と24時間37℃、5％CO 2で培養を継続- 5を再シード。
- PBSで1回洗浄し、またはツニカマイシン（1μg/ ml）の存在下または非存在下でのグルコース（5 mM）のなしで12時間細胞を処理します。
- PBSで細胞を1回洗浄し、10分間、4％ホルムアルデヒド中で固定します。
- PBSで細胞を3回洗浄し、カバースリップを反転、退色防止試薬と一緒にスライド上にマウントし、マニキュアを使用してカバースリップをシール。
- レーザー走査共焦点顕微鏡41で63X油浸対物レンズを使用して、GFP-SCAPの人身売買を確認してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1は、ウエスタンブロットを使用して、グルコース刺激に応答したヒト神経膠芽腫U87細胞における内因性SCAPタンパク質およびSREBP-1の核形態の検出を示します。膜タンパク質のSCAPを「膜画分」で検出されます。 SREBP-1の核型（N末端）は、「核抽出物」で検出されます。 SCAPタンパク質のレベルは顕著にグルコース刺激によって増強され、SREBP-1の核形態（PDIはER膜タンパク質の内部対照として役立ちます）。これらの結果は、プロトコルが、ヒト細胞中の内因性SCAPタンパク質を検出することができることを示しています。
図2は、GFP標識したハムスターのSCAPを発現するHEK293T細胞における刺激およびツニカマイシン処理をグルコースに応答して、SCAPのNの -glycosylationおよび総GFP-SCAPタンパク質レベルの分析を示す。 図
図3は 、グルコース刺激に応答したERからゴルジへのGFP-SCAPの人身売買は、U87細胞におけるツニカマイシン処理により抑制されたことを示しています。 図3Aに示すように、共焦点顕微鏡画像は、PDI、ER常駐タンパク質（赤）との共局在によって示されるように、GFP-SCAPタンパク質は、グルコースの非存在下でERに存在することを示しています。これとは対照的に、グルコースの存在下で、GFP-SCAPは、ゴルジ体タンパク質マーカーGiantin（赤）（ 図3B）との共局在によって示される、ゴルジに移動します。また、ツニカマイシン治療は、ゴルジ体（ 図3AおよびB）にERからのGFP-SCAPのグルコース誘導性輸送を抑制しました。
図1. 検出内因性SCAPタンパク質およびSREBP-1 U87細胞における原子力フォーム。膜および12時間（5ミリモル）との、またはグルコースを含まない無血清培地で培養したヒト初代神経膠芽腫U87細胞からの核抽出物のウエスタンブロット分析の 。ヒトSCAPのAA 450に対する抗SCAP抗体 - 500は、ヒト細胞における内因性SCAPを検出するために使用されました。ヒトSREBP-1の407断片 - SREBP-1の活性型（N末端）のアミノ酸301に対する抗体を使用して「核抽出物」で検出されます。この図は、31から許可を得て変更されている。 より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の上。
図2. SCAP Nの -glycosylationとGFP-SCAPタンパク質レベル のウェスタンブロット分析 。A）SCAP構造のスパニングは、ER膜を通過示す模式図。 ER内腔に存在し、N結合型オリゴ糖によって修飾されているすべてがSCAP三アスパラギン（N）残基が存在します。 SCAPを含むアミノ酸540から707までの断片をトリプシン消化に耐性です。これは、アミノ酸540に対するIgG-9D5抗体によって検出することができる2つのN結合オリゴ糖修飾sties、N590およびN641、含まれています-ウエスタンブロットによってハムスターSCAPの707 B）上部SCAP のN -glycosylationのウエスタンブロット分析（：としHEK293T細胞のトランスから無トリプシン処理）：トリプシン処理）またはGFP-SCAPタンパク質レベル（下iently 12時間、ツニカマイシンの存在下または非存在下で（5 mMの）（1μg/ ml）を、N個の -glycosylation阻害剤またはグルコースを含まない無血清培地で培養し、その後24時間GFP-SCAPでトランスフェクトし、。ブロットの左側の数字は、SCAPタンパク質上のN個の -glycosylationサイトの数（N590およびN641サイト）抗体（IgG-9D5抗体によって検出された、上部）を示しています。 GFP-SCAP用の下部パネルは、GFPタンパク質に対する抗体によって検出しました。この図は、31から許可を得て変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。A、B）共焦点顕微鏡画像は、GFP-SCAPは、ERまたはトンに移動中に存在することを示してERからゴルジへのSCAPの人身売買の図3.検出彼はツニカマイシンなしで/（5 mM）のグルコースの非存在下または存在下でゴルジ（1 / mlの）12時間U87細胞で治療。 PDIは、ERの染色（赤）（A）を示します。 Giantin、ゴルジマーカー（赤）（B）。 DAPI（青）は、細胞核を染色します。スケールバーは10μmで表します。図3Aは、新たなデータであり、以前に公開されていない。 図3Bは 31から許可を得て変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究では、ヒト細胞における膜画分の単離およびウエスタンブロットを用いてSCAP N -glycosylationおよび総タンパク質の検出のためのサンプルを調製するためのプロトコルを説明します。我々は、さらに、GFP標識し、共焦点顕微鏡を用いてSCAP輸送を監視するための方法を提供します。この方法は、特に膜タンパク質を分析するために使用され、SCAP Nの -glycosylationおよび輸送を研究するための重要なツールです。
異なるN -glycan鎖を認識し、Nを -glycosylatedタンパク質42を識別するために、種々のレクチンを用いる方法に比べて、ここで説明する手法は、SCAPのタンパク質断片のグリコシル化を同定するために、移行シフトタンパク質結合Nは -glycan除去するPNGアーゼFを使用して検出しますAA 540から707まで。レクチン方法の制限は、特定のを認識するレクチンの適切な型の識別に依存しています
本研究では、ヒト細胞におけるNの -glycosylationと人身売買の分析のために使用されるGFP標識SCAPのプラスミドは、ハムスター由来です。 SCAPタンパク質のアミノ酸540から707断片のみ、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株15のように、ハムスターSCAPのタンパク質およびN -glycosylationを検出することができに対して惹起されたSCAP抗体（IgGの-9D5）。アミノ酸に対する抗体は、450 -ヒトSCAPの500は、 図1に示すように、ヒト細胞における内因性SCAPタンパク質を検出することができるSCAP N -glycoを検出します。人間SCAPの707断片 - ヒト細胞または組織中のsylationは、我々は、アミノ酸540に対して特異的な抗体を開発する必要があります。また、SCAPに結合したN -glycanを認識する特異的レクチンの同定は-glycosylation 42人のSCAP Nを分析する別の方法です。また、SCAPに結合各N -glycanチェーンの組成と構造を定義する（N263、N590およびN641）は、ERからゴルジへのSCAPの人身売買の根底にあるメカニズムの理解を容易にするであろう。
また、SCAP のN -glycosylationを検出するための最良の結果を得るために、我々はブラウンとゴールドスタイン実験15からの刊行物に記載された方法から改変されている我々の実験条件に応じていくつかの反応パラメータを調整します。正常SCAPタンパク質とNの -glycosylationを検出するために、膜画分および核抽出物の品質は非常に重要です。我々は、直接氷上バックサンプルを入れ避け、37℃でインキュベートした膜画分の後、タンパク質濃度を決定しました。ここで説明する方法は広く、癌、心臓血管疾患、糖尿病、および肥満などの研究の別の分野に適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 mM Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22 G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 |
References
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals. Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).
- Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy. CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).
- Guo, D., et al. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).
- Menendez, J. A., Lupu, R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).
- Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas. Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).
- Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. Protein sensors for membrane sterols. Cell. 124, 35-46 (2006).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Expanding Roles for SREBP in Metabolism. Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).
- Nohturfft, A., Zhang, S. C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).
- Jeon, T. I., Osborne, T. F. SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).
- Sato, R., et al. Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1). The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).
- Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies. The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).
- Sakai, J., et al. Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein. The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).
- Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein. Cell. 87, 415-426 (1996).
- Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain. The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).
- Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).
- Espenshade, P. J., Hughes, A. L. Regulation of sterol synthesis in eukaryotes. Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).
- Yang, T., et al. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER. Cell. 110, 489-500 (2002).
- Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).
- Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).
- Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).
- Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes. Cell. 102, 315-323 (2000).
- Sakai, J., et al. Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment. Cell. 85, 1037-1046 (1996).
- Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77, 53-62 (1994).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).
- Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein. J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).
- Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins. Cell. 161, 161-172 (2015).
- Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins. The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).
- Guo, D. SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells. Mol Cell Oncol. 3, (2016).
- Cheng, C., et al. Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth. Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).
- Shao, W., Espenshade, P. J. Sugar Makes Fat by Talking to SCAP. Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).
- Guo, D., et al. EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy. Sci Signal. 2, 82 (2009).
- Guo, D., et al. An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway. Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).
- Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer. Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).
- Bell, E. H., Guo, D. Biomarkers for malignant gliomas. Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).
- Geng, F., et al. Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis. Clin Cancer Res. , (2016).
- Ru, P., et al. Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth. Cell Rep. , (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Uehara, T., et al. S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature. 441, 513-517 (2006).
- Miyashita, T. Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins. Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).
- Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step. Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).
